Изучение химиопрофилактической активности средств растительного происхождения на модели канцерогенеза печени и пищевода, индуцированного N-нитрозодиэтиламином

Эксперименты выполнены в 2 этапа на 284 половозрелых крысах-самцах линии Wistar с исходной массой 150-180 г без внешних признаков заболевания и были разделены на 6 групп: I – интактный контроль; II – группа животных, получавших N-нитрозодиэтиламин (N-НДЭА); III – группа животных, получавшихнарядусN-НДЭА«Ресвератрол»;IV–группаживотных,получавших изолированно «Ресвератрол»; V – группа животных, получавших наряду с
N-НДЭА полисахариды корневища аира болотного; VI – группа животных, получавших изолированно полисахариды корневища аира болотного.
Животные содержались в стандартных условиях вивария ФГБОУ ВО СОГМА Минздрава России. Кормление осуществлялось однократно в сутки (связано с особенностями схемы эксперимента) с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях. При проведении доклинических исследований руководствовались правилами лабораторной практики в РФ (ГОСТ Р-53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики») и Приказом МЗ РФ от 23 августа 2010 г. No 708н «Правила лабораторной практики». Работа одобрена на заседании научного этического комитета ГБОУ ВПО СОГМА Минздравсоцразвития России – Протокол No2.3 от 06.12.2012 г.
Характеристика объектов исследования
• В качестве канцерогена применялось вещество N-нитрозодиэтиламин Sigma-Aldrich (USA), раствор, дозировка – 100 мг/л питьевой воды, добавлялся к питьевой воде, доступ круглосуточный в течение 16 недель;
• полисахариды аира болотного (полисахаридный комплекс) – были получены в ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России, г. Томск, ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН, г. Томск, и предоставлены для проведения исследований, за что выражаем глубокую признательность. Предоставлены в виде порошкообразного вещества серо-розового цвета, вводились в дозировке 75 мг/кг массы тела с пищей ежедневно, один раз в сутки, в течение 24 недель;
• биологически активная добавка «Ресвератрол» («Ресвератрол», Res), производства Solgar (USA) – в форме капсул с порошкообразным содержимым серо-коричневого цвета, состоящих из: активного вещества – экстракта корня горца японского (Polygonum cuspidatum), стандартизированного по ресвератролу (100мг в 1 капсуле), вводились в дозировке 100 мг/кг массы тела с пищей ежедневно, один раз в сутки, в течение 24 недель.
Доза полисахаридов аира болотного – 75 мг/кг определена в соответствии с рекомендациями сотрудников ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН г. Томск, сделанных на основании изучения их способности тормозить канцерогенез, как в сочетании с цитостатиками, так и самостоятельно на экспериментальных моделях перевиваемой опухоли Льюиса (Сафонова Е.А., 2011).
Доза ресвератрола определена на основании данных литературы. В исследованиях по изучению дозазависимого антиканцерогенного эффекта ресвератрола показано, что указанная доза способна достоверно тормозить развитие рака печени (Anupam B. et al., 2009).
Завершающим этапом выводили всех животных из эксперимента путем внутрибрюшинного введения раствора анестетика общего действия «Золетила» (Франция), из расчета 5,0 мг в объеме 0,1 мл готового раствора препарата, при котором производили забор крови из сердца, предварительно промыв шприц антикоагулянтом – гепарином. В крови определялись соответствующие биохимические и гематологические показатели.
Печень оценивали макроскопически по балльной шкале. Все новообразования в пищеводе подсчитывали и измеряли. Индекс множественности рассчитывали по отношению к эффективному числу крыс. Новообразования в пищеводе, глотке и преджелудке подсчитывали и измеряли. Материал для гистологического исследования фиксировали в 10% растворе формалина и подвергали исследованию после окраски срезов гематоксилином и эозином. Определяли морфологический тип новообразований в соответствии с гистологическими классификациями опухолей печени и пищевода, предложенными Международным агентством по изучению рака (МАИР). Микроскопическую оценку неопластических изменений проводили также по шкале условных единиц по 3-балльной шкале. После оценки изменений у отдельных крыс рассчитывали средний показатель в группе. Об эффективности исследуемых веществ судили по изменению частоты возникновения пренеопластических и неопластических изменений, индекса множественности и среднего балла макро- и микроскопических изменений в опытных группах животных по сравнению с контролем.
Биохимические показатели: активность аланинаминотрансферазы (АлАТ), аспартатаминотрансферазы (АсАТ), щелочной фосфатазы (ЩФ), уровень билирубина и холестерина в плазме крови определяли на автоматическом биохимическом анализаторе AU 480 BECKMAN COULTER. Определение уровня гидроперекисей (ГП) в плазме крови осуществляли по методу Гаврилова В.Б., Гавриловой А.Р., Мажуль Л.М. (Данилова Л.А. и др., 2003), малонового диальдегида (МДА) в эритроцитах общеизвестным методом (Камышников В.С., 2003), активности каталазы (КАТ) в эритроцитах по методу E. Beutler (Данилова Л.А. и др., 2003), активности супероксиддисмутазы (СОД) в эритроцитах общеизвестным методом (Камышников В.С., 2003), осмотической резистентности мембран эритроцитов спектрофотометрически на спектрофотометре Unico2000 при длине волны 540 нм, активности Na+/К+-АТФазы в ткани печени по методу K.S. Keeton (Мосягин В.В., 2011).
Статистическая обработка данных проведена с применением пакета прикладных программ STATGRAPHICS Plus 5,0 for Windows и SPSS 15,0 for Windows. Применялись стандартные статистические методы, определяли среднюю арифметическую и стандартную ошибку средней (M±m), достоверность различий в группах оценивалась с помощью параметрических методов (t-критерий Стьюдента) при нормальном распределении признаков, и непараметрических методов (U-критерий Манна-Уитни) в случае отсутствия нормального распределения показателей. Различия при уровне значимости р<0,05 расценивались как достоверные. Тип распределения определялся критерием Шапиро-Уилка. Проводили множественный регрессионный анализ и факторный анализ. Корреляционные связи оценивали с помощью коэффициента корреляции Пирсона, в расчет брали связи r>0,7.
Также был проведен ROC-анализ, который представляет собой графическую методику оценивания эффективности регрессионных моделей с помощью 2 показателей – чувствительности и специфичности. Чувствительность и специфичность менее 0,7 считается низкой, от 0,7 до 0,9 – умеренной, от 0,9 до 1,0 – высокой (Орлова И.В., 2009; Груздев А.В., 2012).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Влияние «Ресвератрола» на развитие экспериментального канцерогенеза печени и пищевода
По результатам проведенного исследования было выявлено достоверное снижение частоты возникновения опухолевых образований и степени их малигнизации в ткани печени в группе животных, получавших наряду с канцерогеном «Ресвератрол» и полисахариды аира болотного (табл. 1, 2). Это подтверждает способность «Ресвератрола» и полисахаридов аира болотного оказывать химиопрофилактическое действие на данной экспериментальной модели.
Таблица 1 – Влияние «Ресвератрола» на канцерогенез печени, индуцированный
Таблица 1 – Влияние «Ресвератрола» на канцерогенез печени, индуцированный
N-нитрозодиэтиламином у крыс
Таблица 1 – Влияние «Ресвератрола» на канцерогенез печени, индуцированный
N-нитрозодиэтиламином у крыс
С неопластическими изменениями N-нитрозодиэтиламином у крыс
Микроскопическая оценка С неопластическими изменениями
Злокачест- Доброкачест-
Группы
животных Группы
животных N-НДЭА
Х – холангиома, Гм – гемангиома. Различия с группой N-НДЭА достоверны: * – р<0,05 венные Злокачест- опухоли венные венные Доброкачест- опухоли венные Микроскопическая оценка Гиперплазия и дисплазия Гиперплазия и дисплазия прот 2,35±0,3 1,3±0,13* 2,35±0,3 опухоли Хц Гп Х Гм 3 6 4 4 опухоли Хц Гп Х Гм 9 оков прот оков N-НДЭА +Res 30 (56,7%)* 3 6 4 4 27 (90%) 27 (90%) 2,43±0,56 1,17±0,3* 2,43±0,56 15 4* 2 1* 2 2 5* 4 N-НДЭА Примечание. Гц – гепатоцеллюлярный, Хц – холангиоцеллюлярный, Гп – гепатома, 1,17±0,3* ХПр–имхоелчангииео.мГа,цГм––гепмаатногциеолмлаю.лРяарзнлыичйи,яХсцгру–ппхоойлNан-НгиДоЭцеАллдюослтяорвнеырнйы, :Г*п–р–<0г,е0п5атома, + Res (56,7%)* 4* 2 1* 2 2 5* 4 6 * 1,3±0,13 ТТабалбилциаца22––ВВллиияяннииее ппооллииссааххаарриддоваира болотннооггооннаакакнацнецреоргоегнеензепз епчеечнеин,и, индуцированный N-нитрозодиэтиламином у крыс Таблица 2 – Влияние полисахаридов аира болотного на канцерогенез печени, индуцированный N-нитрозодиэтиламином у крыс Группы жГирвуоптпных животных N-НДЭА N-НДЭА индуцированный N-нитрозодиэтиламином у крыс С неопластическими изменениями С неопластическими изменениями Микроскопическая оценка Микроскопическая оценка Злокачест- Доброкачест- Гиперплазия Злвоекнанчыесет- Добвреонкнаычест- Гиидпиесрплазия овпеунхноылеи овпеунхноылеи и дисплазия оли опухоли Хц Гп Х Гм Хц Гп Х Гм 252 5 5 9 252 5 5 9 132 1* 1* 7 132 1* 1* 7 прото пкровто ков 32 30 3,2±0,3 14 30 2,27±0,25 2,27±0,25 N-НДЭА N-НДЭА 32 (93,7%) 3,2± 0,3 14 (93,7%) + ПОЛИ + ПОЛИ 32 16 1,87±1,7* 9* 16 1,45±0,2* Гц Гц опух Гц Гц 32 (50,0%)* 1,87±1,7* 9* (50,0%)* 1,45±0,2* Примечание. Гц – гепатоцеллюлярный, Хц Примечание. Гц – гепатоцеллюлярный, Хц – холангиоцеллюлярный, Гп – гепатома, – холангиоцеллюлярный, Гп – гепатома, Гм – гемангиома, Х – холангиома. Различия с группой N-НДЭА достоверны:* – р<0,05. Гм – гемангиома, Х – холангиома. Различия с группой N-НДЭА достоверны:* – р<0,05. 10 Так, на фоне введения в рацион исследуемых животных «Ресвератрола» и Так, на фоне введения в рацион исследуемых животных «Ресвератрола» и полисахаридов аира болотного отмечена их способность тормозить развитие полисахаридов аира болотного отмечена их способность тормозить развитие КоКл-овло-вжоижвоитвноытнхывх в гругпрпуеппе КолК-волж-виовжотинвыохтнвых в групгпреуппе КоКл-овло-вкорыкрсысс с неонпелоапслтаисчтеисчкеисмкими измиезмнениеянмииямпиечпеенчиени КолК-волк-вроыскрсыс с неопнлеаосптлиачсетсикчиемсикими измеинземнеиняемнияпмеичепнеичени МаМкраоксркооспкио-пи- чесчкеасякаояцеонцкеанква в балблаалхлах МакМроасккроопсик-опи- ческчаеясокацяенокцаенвка в баллбаахллах гепгаетпоа-то- цицтоивтов гепагтеоп-ато- цитоцвитов МиМкриоксркоос-ко- пипчеисчкеасякая оцеонцкеанква в балблаалхлах МикМроисккроо-ско- пичепсикчаеяская оценокцаенвка в баллбахллах опухолевых образований в пищеводе, индуцированных N-НДЭА, что проявлялось Так, на фоне введения в рацион исследуемых животных «Ресвератрола» и полисахаридов аира болотного отмечена их способность тормозить развитие опухолевых образований в пищеводе, индуцированных N-НДЭА, что проявлялось в статистически достоверном снижении частоты и множественности возникновения новообразований, снижении степени малигнизации неопластических изменений (табл. 3, 4). Таблица 3 – Влияние «Ресвератрола» на канцерогенез пищевода, индуцированный Таблица 3 – Влияние «Ресвератрола» на канцерогенез пищевода, индуцированный Таблица 3 – Влияние «Ресвератрола» на канцерогенез пищевода, индуцировNа-ниытйроNзо-дниэтиролазомдиинэотмиулакмрыинсом у крыс N-нитрозодиэтиламином у крыс С неопластическими изменениями С неопластическими изменениями Микроскопическая оценка Микроскопическая оценка Злокачествен- Злокачествен- ные опухоли ные опухоли Доброкачест- Доброкачест- венные и венные и предраковые предраковые опухоли опухоли ПОР ПОР ПНОР ПНОР ПЛ ПЛ полип полип Группы Группы животных животных N-НДЭА 30 N-НДЭА 30 21 (70%) 21 (70%) 18 (60%) 18 (60%) 6,2±0,27 6,2±0,27 4,0±0,33* 4,0±0,33* 7 7 8 11 7 7 8 11 4 2 16 2* 4 2 16 2* 2,43±0,33 2,43±0,33 1,34±0,28* 1,34±0,28* N-НДЭА + N-НДЭА + 30 Res 30 Res Примечание. ПОР – плоскоклеточный ороговевающий рак, ПНОР – плоскоклеточный Примечание. ПОР – плоскоклеточный ороговевающий рак, ПНОР – плоскоклеточный неороговевающий рак, ПЛ – папиллома. Различия с группой N-НДЭА достоверны: * – неороговевающий рак, ПЛ – папиллома. Различия с группой N-НДЭА достоверны: * – ТабТлаибцлаи4ца– В4л–иВянлиеянпиоелипсоалхиарсаихдаорвиадиорва баоилроатнбоглотнанкоагноцнеарокгаенцезерпоигщеенвеозда, р<0,05. р<0,05. Таблица 4 – Влияние полисахаридов аира болотного на канцерогенез пищевода, пищевода, индуцированный N-нитрозодиэтиламином у крыс индуцированный N-нитрозодиэтиламином у крыс индуцированный N-нитрозодиэтиламином у крыс С неопластическими изменениями С неопластическими изменениями Микроскопическая оценка Микр Группы Злокачественные опухоли п Cis Cis 9 12 9 9 12 9 4 5* 18* 4 5* 18* Группы животных Злокачественные опухоли животных N-НДЭА 32 32 32 26 5,3±0,55 9 3 3 2 3,56±0,25 3,56±0,25 предраковые опухоли о ПЛ ПЛ ухоли полип полип енка ПОР ПОР ПНОР ПНОР N-НДЭА (81,25%) 5,3±0,55 9 (81,25%) N-НДЭА + 10 3,0±0,81* 5 1,28±0,16* 1,28±0,16* N-НДЭА + ПОЛИ (31,25%)* 3,0±0,81* 5 ПОЛИ Примечание. ПОР – плоскоклеточный ороговевающий рак, ПНОР – плоскоклеточный (31,25%)* Примечание. ПОР – плоскоклеточный ороговевающий рак, ПНОР – плоскоклеточный неороговевающий рак, ПЛ – папиллома, Cis – рак in situ. Различия с группой N-НДЭА неороговевающий рак, ПЛ – папиллома, Cis – рак in situ. Различия с группой N-НДЭА достоверны: * – р<0,05. достоверны: * – р<0,05. Влияние «Ресвератрола» и полисахаридов аира болотного на функцию Влияние «Ресвератрола» и полисахаридов аира болотного на функцию печени в динамике канцерогенеза, индуцированного у крыс печени в динамике канцерогенеза, индуцированного у крыс N-нитрозодиэтиламином N-нитрозодиэтиламином Любые повреждения печени могут сопровождаться нарушением её функций, оскопическая оц Доброкачест- Доброкачест- венные и венные и предраковые КоКло-вло-вкоркырсывс гвргурпупепе ККоолл-в-вооккррыыссввггррууппппее КоКло-вло-вкоркырсыс с неноеполпалсатситчиечсексикмиими изимземненеиняимяими пипщиещвеовдоада ККоолл-в-вооккррыысссс ннееооппллаассттииччеессккииммии иизмзмееннеенниияяммии ппиищщееввооддаа ИнИднедкескс мнмонжоежсетсвтевненнонсотсити ИИннддеекксс ммнноожжеессттввеенннооссттии Микроскопи- Микроскопи- Микроскопи- Микроскопи- ческая оценка в ческая оценка в ческая оценка в ческая оценка в баллах баллах баллах баллах Любые повреждения печени могут сопровождаться нарушением её функций, Влияние «Ресвератрола» и полисахаридов аира болотного на функцию печени в динамике канцерогенеза, индуцированного у крыс N-нитрозодиэтиламином Любые повреждения печени могут сопровождаться нарушением её функций, проявляющихся в изменении биохимических показателей крови, в частности уровня ферментов АлАТ, АсАТ, ЩФ, пигмента (билирубин), показателей, характеризующих метаболическую функцию печени (холестерин). Так, в динамике исследования отмечено достоверное повышение активности первых месяцев исследования, при этом нарастая до максимальных значений на первыхАмлеАсТя,цАевсАиТс,сЩлеФдовагнриуяп,пепржиивэототнмынх,арпаослтуачяавдшоимхаикзсоилмиарлоьвнаыннхозNна-НчеДнЭиАй нса 3-м месяце исследования, чего не происходило в группах животных, получавших первых месяцев исследования, при этом нарастая до максимальных значений на 3-м месяце исследования, чего не происходило в группах животных, получавших наряду с канцерогеном «Ресвератрол» и полисахариды аира болотного. На более 3-м месяце исследования, чего не происходило в группах животных, наряду с канцерогеном «Ресвератрол» и полисахариды аира болотного. На более ппозодлнуичхавсшроикхахнаирсясдлуедосвакнаиняцеаркотигевномсть«РАессАвТериатЩроФл» вигрпуоплпиасхапхарракитдиычеаскииране поздних сроках исследования активность АсАТ и ЩФ в группах практически не болотного. На более поздних сроках исследования активность АсАТ и ЩФ отличалась. Графические изображения изменений биохимических показателей в отличалась. Графические изображения изменений биохимических показателей в в группах практически не отличалась. Графические изображения изменений динамике представлены на рисунке 1, 2. биохимических показателей в динамике представлены на рисунке 1, 2. динамике представлены на рисунке 1, 2. Рисунок 1 – Уровень АлАТ, АсАТ в динамике исследования РиРсиуснуноокк11––УУрроовень АлАТ,, АсАТТввддииннамамиикекеисислселдеодвоавнаиняия Примечание. Различия достоверны: # – относительно I группы; * – относительно II группы Примечание. Различия достоверны: # – относительно I группы; * – относительно II группы Примечание. Различия достоверны: # – относительно I группы; * – относительно (р˂0,05(р,˂t-0к,р0и5,тtе-ркирйитСертиьйюСдетньютад)ента) II группы (р˂0,05, t-критерий Стьюдента) Рисунок 2 – Уровень ЩФ в динамике исследования РисуРниоскун2о–к У2р–оУверноьвеЩньФЩвФдивндаимниакмеииксесилсесдлоевдаонвиаяния Примечание. Различия достоверны: # – относительно I группы; * – относительно II группы Примечание. Различия достоверны: # – относительно I группы; * – относительно Примечание. Различия достоверны: # – относительно I группы; * – относительно II группы (р˂0,05,ItI-гкруиптпеыри(йр˂С0т,ь0ю5,дtе-кнртиат)ерий Стьюдента) (р˂0,05, t-критерий Стьюдента) Уровень билирубина и холестерина на ранних сроках исследования в группе Уровень билирубина и холестерина на ранних сроках исследования в группе животных, получавших изолировано канц1е2роген, не отличался от уровня групп животных, получавших изолировано канцероген, не отличался от уровня групп животных, получавших наряду с канцерогеном «Ресвератрол» и полисахариды животных, получавших наряду с канцерогеном «Ресвератрол» и полисахариды аира болотного, и нарастал к 3-му месяцу исследования. На более поздних сроках аира болотного, и нарастал к 3-му месяцу исследования. На более поздних сроках эксперимента уровень билирубина возрастал в группе животных, получавших эксперимента уровень билирубина возрастал в группе животных, получавших Уровень билирубина и холестерина на ранних сроках исследования в группе животных, получавших изолировано канцероген, не отличался от уровня групп животных, получавших наряду с канцерогеном «Ресвератрол» и полисахариды аира болотного, и нарастал к 3-му месяцу исследования. На более поздних сроках эксперимента уровень билирубина возрастал в группе животных, получавших наряду с канцерогеном «Ресвератрол», а в группе животных, получавших наряду с канцерогеном полисахариды аира болотного, оставался на уровне показателей группы интактного контроля. Уровень холестерина в группах животных, получавших наряду с канцерогеном «Ресвератрол» и полисахариды аира болотного, достоверно не отличался от группы интактного контроля (рисунок 3). Рисунок 3 – Уровень билирубина и холестерина в динамике исследования Рисунок 3 – Уровень билирубина и холестерина в динамике исследования Примечание. Различия достоверны: # – относительно I группы; * – относительно II группы Рисунок 3 – Уровень билирубина и холестерина в динамике исследования Примечание. Различия достоверны: # – относительно I группы; * – относительно II группы (р˂0,05, U-критерий Манна-Уитни) (р˂П0р,0и5м,еUч-акнриет.ерРиайзлМичаниняа-дУоистноив)ерны: # – относительно I группы; * – относительно ВлияниIеI г«рРупепсыве(р˂а0т,0р5о, Uл-ак»риитерпиойлМиаснанха-аУриитндио)в аира болотного на активность Влияние «Ресвератрола» и полисахаридов аира болотного на активность Na+/K+-АТ+Фа+зывтканипеченивдинамикеисследования Na /K -АТФазы в ткани печени в динамике исследования Влияние «Ресвератрола» и полисахаридов аира болотного на активность В динамВикдеинаи+мсис+кледиосвсалнедиояванвиыяявылеянвлоенододсотсотвоеврернное сниженениеиеактаиквтниовснтиости Na /K -АТФазы в ткани печени в динамике исследования Na+/K+-АТФазы у животных, получавших канцероген, чего не происходило в Na+/K+-АТФазВыдиунажмивкеотинсыслхе,допвоалниуячавышявилхенкоадноцсетроовегрено,ечсенгиоженеиепаркотисвнхосдтило в ++ груNпaпе/Kж-АиТвФотанзых,ужпоилвуочтнавышхи,хполнуачраявдшуихскакнацнецреоргоегне,ночмего«нРееспвреориастхродли»лои группе животных, получавших наряду с канцерогеном «Ресвератрол» и в группе животных, получавших наряду с канцерогеном «Ресвератрол» и полисахариды аира болотного. Графическое изображение данных по группам полисахариды аира болотного. Графическое изображение данных по группам полисахариды аира болотного. Графическое изображение данных по группам представлено на рисунке 4. представлено на рисунке 4. представлено на рисунке 4. Рисунок 4 – Активность Na+/K+-АТФазы в динамике исследования Примечание. Различия достоверны: # – относительно I группы; * – относительно II группы (р˂0,05, t-критерий Стьюдента) Рисунок 4 – Активность Na+/K+-АТФазы в динамике исследования Рисунок 4 – Активность Na+/K+-АТФазы в динамике исследования Влияние «Ресвератрола» и полисахаридов аира болотного на систему Примечание. Различия достоверны: # – относительно I группы; * – относительно II группы Примечание. РазличиПя ОдоЛс-тАовОерЗнвыд: и#н–амоитнкоесэиктсепльенроимI егнртупапы; * – относительно (р˂0,05, t-критерий Стьюдента) II группы (р˂0,05, t-критерий Стьюдента) При изучении процессов перекисного окисления липидов – антиоксидантной Влзиащяинтиые («ПРОеЛсв-АеОрЗа)трволдиан»амикпеолэкисспаерхиамреиндтаолвьнаоигоракабноцлеоротгнеонегзоа нпаолсуичсетнеыму данные о достоверных изменениях интенсивности в системе ПОЛ-АОЗ в крови ПОЛ-АОЗ в динамике эксперимента животных, получавших наряду с канцерогеном «Ресвератрол» и полисахариды При изучении процессов перекисного окисления липидов – антиоксидантной аира болотного, возникающих с 3-го месяца эксперимента и проявляющихся в защиты (ПОЛ-АОЗ) в динамике экспериментального канцерогенеза получены Влияние «Ресвератрола» и полисахаридов аира болотного на систему ПОЛ-АОЗ в динамике эксперимента При изучении процессов перекисного окисления липидов – антиоксидантной защиты (ПОЛ-АОЗ) в динамике экспериментального канцерогенеза получены данные о достоверных изменениях интенсивности в системе ПОЛ-АОЗ в крови животных, получавших наряду с канцерогеном «Ресвератрол» и полисахариды аира болотного, возникающих с 3-го месяца эксперимента и проявляющихся в повышении уровня МДА, что приводит к компенсаторному увеличению активности каталазы и СОД, благодаря чему происходит стабилизация процессов ПОЛ, приводящая к снижению повреждающих агентов и, как следствие, снижению частоты встречаемости опухолей в III и V группах животных. Противоположная картина наблюдается у животных II группы. Проведенные исследования по изучению перекисного метаболизма в динамике химического канцерогенеза показывают развитие нарушений в системе ПОЛ-АОЗ, что влечет за собой структурные изменения в мембране клеток организма, приводящих к снижению их резистентности и повышению восприимчивости к действию повреждающих агентов, что может приводить к развитию опухолей. Таким образом, развитию опухоли предшествует накопление большого количества повреждающих агентов – свободнорадикальных соединений при нарушении функционирования ферментативного звена АОЗ. Их повреждающее действие носит неспецифический характер и является составным элементом типового патологического процесса, однако накопление активных форм кислорода в клетке приводит к нарушению функционирования внутриклеточных процессов, в том числе и процессов репликации. Именно поэтому средства, обладающие антиоксидантной активностью, влияющие на патогенетическое звено развития рака, инактивируют эндогенные повреждающие агенты, которыми являются свободнорадикальные соединения, что проявляется в антиканцерогенном действии. В группе животных, получавших «Ресвератрол» и полисахариды аира болотного, в ранние сроки канцерогенеза уровень МДА и ГП достоверно был ниже уровня аналогичных показателей в группе животных, получавших изолированно канцероген (p<0,05), и практически не отличались от уровня в группе интактного контроля. При этом было отмечено повышение активности ферментативного звена АОЗ у животных II группы, по сравнению с активностью этих ферментов в группах I, III и V, что выражалось в достоверном повышении активности каталазы (р<0,05). Данные изменения, вероятнее всего, связаны с включением компенсаторных возможностей организма животных II группы в ответ на введение повреждающего фактора (N-нитрозодиэтиламина), который провоцирует повышенное образование недоокисленных продуктов (МДА и ГП), что в свою очередь приводит к повышению активности фермента АОЗ – каталазы. На втором месяце эксперимента уровень МДА в III и V группах животных был достоверно ниже показателей II группы (р<0,05). Также наблюдалось повышение содержания МДА в эритроцитах животных, получавших наряду с канцерогеном «Ресвератрол» и полисахариды аира болотного, относительно I группы (р<0,05), что обусловлено действием канцерогена на организм, однако этот показатель был достоверно ниже уровня МДА у животных II группы (р<0,05), что может свидетельствовать об антиоксидантной активности «Ресвератрола» и полисахаридов аира болотного. При этом активность каталазы у животных III и V групп была достоверно ниже относительно II (р<0,05). На третьем месяце эксперимента у животных III и V групп сохранялся низкий уровень МДА по сравнению с II группой (р<0,05), что свидетельствует об усилении процессов ПОЛ в группе животных, получавших изолировано канцероген. В группе животных, получавших дополнительно «Ресвератрол» и полисахариды аира болотного, хоть и наблюдается увеличение уровня МДА относительно группы интактного контроля (р<0,05), но все же остается достоверно ниже относительно показателей II группы, что свидетельствует о менее интенсивном образовании вторичных продуктов ПОЛ, способных оказывать свое повреждающее действие. Уровень ГП в плазме крови животных III и V групп достоверно ниже относительно показателей II (р<0,05) и практически не отличаются от группы интактного контроля (рисунок 5). При этом отмечено начальное напряжение в функционировании ферментативного звена АОС, выражающееся в снижении активности каталазы и СОД у животных II группы (р<0,05), в сравнении с активностью ферментов у животных интактного контроля (р<0,05), а также относительно группы животных, получавших наряду с канцерогеном «Ресвератрол» и полисахариды аира болотного. Это свидетельствует о снижении компенсаторных возможностей организма противостоять токсическому действию канцерогена и развитию морфофункциональных нарушений в тканях печени и пищевода, обнаруживаемые в эти сроки. В III и V группах наблюдалось увеличение активности каталазы относительно показателей второго месяца эксперимента этой же группы (р<0,05) и относительно группы интактного контроля (р<0,05) на третьем месяце эксперимента, что свидетельствует о включении компенсаторных механизмов, направленных на снижение количества прооксидантов, способных привести к развитию новообразований. При определении показателей ПОЛ-АОЗ на 4-м месяце эксперимента было отмечено, что уровень МДА у животных III и V групп был достоверно ниже II группы (р<0,05) и снижался относительно показателей I группы (р<0,05), а также относительно показателей 3-го месяца (р<0,05). На этом этапе эксперимента у животных III и V групп уровень ГП был ниже показателей II группы (р<0,05), а также относительно I группы (р<0,05), а по сравнению с показателями 3-го месяца эксперимента снижался (р<0,05). При оценке показателей ферментативного звена АОЗ на 4-м месяце эксперимента наблюдалось сохранение более высокой активности каталазы и СОД у животных III и V групп. При этом, активность каталазы у животных III группы была достоверно выше показателей II группы (р<0,05), а относительно I достоверно не отличалась. Активность СОД у животных III и V групп относительно II и I групп была выше (р<0,05) (рисунок 6). Рисунок 5 – Уровень МДА и ГП в динамике исследования Рисунок 5 – Уровень МДА и ГП в динамике исследования Примечание.Риазслуинчоикя5до–стУорвеорвнеын:ь#М–ДотАноисиГтеПльвнодиIнгармупипкые;и*с–слоетдновсаинтеиляьно II группы Примечание. Различия достоверны: # – относительно I группы; * – относительно П(рр˂и0м,0е5ч,аtн-икер.итРеарзилйичСитяьюдодсетнотвае)рны: # – относительно I группы; * – относительно II группы II группы (р˂0,05, t-критерий Стьюдента) (р˂0,05, t-критерий Стьюдента) Рисунок 6 – Активность каталазы и СОД в динамике исследования Рисунок 6 – Активность каталазы и СОД в динамике исследования Рисунок 6 – Активность каталазы и СОД в динамике исследования Примечание. Различия достоверны: # – относительно I группы; * – относительно II группы Примечание. Различия достоверны: # – относительно I группы; * – относительно II группы Примечание. Различия достоверны: # – относительно I группы; * – относительно (р˂0,05, t-критерий Стьюдента) (р˂0,05, t-критерий Стьюдента) II группы (р˂0,05, t-критерий Стьюдента) Влияние на осмотическую резистентность мембран эритроцитов в Влияние на осмотическую резистентность мембран эритроцитов динамике канцерогенеза печени и пищевода в динамике канцерогенеза печени и пищевода С процессами ПОЛ-АОЗ напрямую связаны процессы, протекающие в С процессами ПОЛ-АОЗ напрямую связаны процессы, протекающие в С процессами ПОЛ-АОЗ напрямую связаны процессы, протекающие в мембране клеток, что может приводить к нарушению их функционирования и мемебмрбарнаенкелкелтеотко,кч, тчотомоожеетт приводить к ннаарруушееннииюииххфуфнукнцкицоиноинриорвоавнаиняияи и особенно целостности. особенно целостности. особенно целостности. Так, в ггрруупппеежживиовтонтыных,х,поплоулчуачвашвишхих«Р«еРсвеесрваетрраотлр»оли» пиолпиослаихсаархиадрыидаыира Так, в группе животных, получавших «Ресвератрол» и полисахариды аира боалиортаногбоо,лонтаног1о-,м нмаес1я-цме мэкеспяецреимэекнстпаеривмыеянвтлаеновысятвалтеинсотичсетсактистзинчаечсикмиое болотного, на 1-м месяце эксперимента выявлено статистически значимое значимое снижение осмотической резистентности мембран эритроцитов, снижение осмотической резистентности мембран эритроцитов, особенно при снижение осмотической резистентности мембран эритроцитов, особенно при особенно при внесении эритроцитов в растворы с низкими концентрациями внесении эритроцитов в растворы с низкими концентрациями мочевины (рисунок внмесоечнеивинэырит(роицсиунтовкв7р).асТтваокр,ыпсронциезнктимгиемколницзеантрэрациитряомциимтовчевинрыас(трвиосруанхок 7). Так, процент гемолиза эритроцитов в растворах мочевины No2 (45%), No3 (50%) мочевины No2 (45%), No3 (50%) и No4 (55%) был достоверно выше показателей 7). Так, процент гемолиза эритроцитов в растворах мочевины No2 (45%), No3 (50%) и No4 (55%) был достоверно выше показателей II группы (p<0,05), и группы II группы (p<0,05), и группы интактного контроля (p<0,05), во всех растворах и No4 (55%) был достоверно выше показателей II группы (p<0,05), и группы интактного контроля (p<0,05), во всех растворах соответственно. соответственно. интактного контроля (p<0,05), во всех растворах соответственно. На 2-м месяце экспериментального канцерогенеза отмечали обратную На 2-м месяце экспериментального канцерогенеза отмечали обратную На 2-м месяце экспериментального канцерогенеза отмечали обратную диднианмаимкиукупокпаозкаатзеалтеейлеойсмостмичоетсикчоейскорейзирсетезинсттнеонстниосэтритрэорцииттровцивтовII,вIоII IиI, V диIнIIамикVу пгоркуапзпаатхел(ерйисоуснмокти8ч)е.скОотйнорсеизтиеслтьенотнопсетривоэгроитмреосцяицтаовэквсопеIрIи, мIIеIнтиа V группах (рисунок 8). Относительно первого месяца эксперимента осмотическая осмотическая резистентность у животных II группы, в растворах No2; No3 ргрезуипсптаехнт(нроистуьноук ж8и).воОттнныохсиIтIелгьрнуопппые,рвогроасмтвеосряцаха эNoкс2п; еNoри3меинтNoа 4о,смдосттиочвеесркнаяо срнеизизситлеанстьно(сpт<ь0,у05ж)ивотнвысхехIIргарсутпвпоыра,хв, раасвтвоIрIаIхиNo2V; Noгр3упипаNoх4,надболсютодваелрансоь незначительная положительная динамика относительно 1-го месяца эксперимента. снизилась (p<0,05) во всех растворах, а в III и V группах наблюдалась Полученные результаты указывают на снижение компенсаторных незначительная положительная динамика относительно 1-го месяца эксперимента. Полученные результаты указывают на снижение компенсаторных и No4, достоверно снизилась (p<0,05) во всех растворах, а в III и V группах наблюдалась незначительная положительная динамика относительно 1-го месяца эксперимента. Полученные результаты указывают на снижение компенсаторных возможностей, направленных на поддержание осмотической резистентности возможностей, направленных на поддержание осмотической резистентности клеточных мембран приддеействииN--НДЭАииппооввыышеениеииххпрпириодондонворвермемененноомм введении животным «Ресвератрола» и полисахаридов аира болотного. введении животным «Ресвератрола» и полисахаридов аира болотного. Рисунок 7 – Осмотическая стойкость Рисунок 8 – Осмотическая стойкость Рисунок 7 – Осмотическая стойкость Рисунок 8 – Осмотическая мембран эритроцитов у крыс мембран эритроцитов у крыс мембран эритроцитов у крыс ннаа11--ммесяце экспеерриимменетната стойкость мембран эритроцитов у крыснаа22-м-мммесеясцяецэекэспксерпиемреинмтеанта На 3-м месяце эксперимента наблюдались выраженные изменения На 3-м месяце эксперимента наблюдались выраженные изменения осмотической резистентности мембран эритроцитов (рисунок 9). Так, процент осмотической резистентности мембран эритроцитов (рисунок 9). Так, процент разрушенных эритроцитов в растворе No1 у крыс III и V групп был достоверно разрушенных эритроцитов в растворе No1 у крыс III и V групп был достоверно ниже (p<0,05) относительно показателя II группы и достоверно не отличался от ниже (p<0,05) относительно показателя II группы и достоверно не отличался от показателя I группы. В растворе No2 этот показатель соответственно по группам ипмокелазсахтоелжяиеI игрзмупепныен.иВяр(pа<ст0в,о0р5е);Noвр2асэтовотрпеоNoка3заитземльенсеоноитвяеитмстевлеиннаноаплогирчунпупюам направленность, с минимальным разрушением мембран эритроцитов крыс, имел схожие изменения (p<0,05); в растворе No3 изменения имели аналогичную получавших N-НДЭА и «Ресвератрол» и полисахариды аира болотного, и направленность, с минимальным разрушением мембран эритроцитов крыс, с максимальным – у животных, получавших только канцероген (р<0,05). получавших N-НДЭА и «Ресвератрол» и полисахариды аира болотного, и с Процент гемолизированных эритроцитов в растворе No4 у животных III и Vмагкрсуипмпалбьынлымдо–стуовжеирвнотныихж,еп(орл<у0ч,а0в5ш)иохтнтослиьктоелкьанноцепроокгаезнат(ерл<я0,I0I5г)р. уПпрпоыц,енат также относительно I группы (р<0,05). гемолизированных эритроцитов в растворе No4 у животных III и V групп был Процент гемолиза эритроцитов в этом растворе является наиболее достоверно ниже (р<0,05) относительно показателя II группы, а также показательным, так как концентрация мочевины в нем, как осмотически относительно I группы (р<0,05). активного вещества, способного к ослаблению стабилизирующего действия гидрофПорбонцыенхт свгяезмеойлибзеалкоэрвитмреомцбиртоанвы,в спэотосмобнроасптрвиорвеодиятвьлякетсняаруншаиебноилюее целостности клеточной стенки, составляет 55%, и только эритроциты со показательным, так как концентрация мочевины в нем, как осмотически активного стойкой мембраной способны оказывать противодействие влиянию мочевины. вещества, способного к ослаблению стабилизирующего действия гидрофобных По мере увеличения концентрации мочевины (60% и 65% в растворах No5 и связей белков мембраны, способно приводить к нарушению целостности No6, соответственно) полученные результаты хоть и имели отличия по группам, окдлнеатокочнсотйепсетнеьнкриа,злсоисчтиайвлмяежт д5у5%ни, миитуомльекноьшэраилтарсоьц. иты со стойкой мембраной На 4-м месяце эксперимента изменения осмотической резистентности способны оказывать противодействие влиянию мочевины. По мере увеличения мембран эритроцитов животных III и V групп были наиболее выражены концентрации мочевины (60% и 65% в растворах No5 и No6, соответственно) полученные результаты хоть и имели отличия по группам, однако степень различий между ними уменьшалась. На 4-м месяце эксперимента изменения осмотической резистентности мембран эритроцитов животных III и V групп были наиболее выражены (рисунок (рисунок 10), что и соответствует начальному напряжению системы ПОЛ-АОС и появлению первых опухолей в тканях печени и пищевода данных групп. Во II группе наблюдалось сохранение снижения осмотической резистентности мембран эритроцитов, несмотря на более низкие показатели в первых трех растворах, относительно аналогичных на 3-м месяце эксперимента, что в на более низкие показатели в первых трех растворах, относительно аналогичных свою очередь соответствует более глубоким морфологическим изменениям на 3-м месяце эксперимента, что в свою очередь соответствует более глубоким в ткани печени и пищевода, полученным в эти сроки, по сравнению с морфологическим изменениям в ткани печени и пищевода, полученным в эти морфологическими изменениями III и V групп. сроки, по сравнению с морфологическими изменениями III и V групп. Рисунок 9 – Осмотическая стойкость Рисунок 10 – Осмотическая стойкость Рисунок 9 – Осмотическая стойкость Рисунок 10 – Осмотическая стойкость мембран эритроцитов у крыс мембран эритроцитов у крыс мембран эритроцитов у крыс мембран эритроцитов у крыс на 3-м месяце эксперимента на 3-м месяце эксперимента на 4-м месяце эксперимента на 4-м месяце эксперимента Так, процент гемолиза эритроцитов животных III и V групп в растворе No3 Так, процент гемолиза эритроцитов животных III и V групп в растворе был ниже показателей II группы (р<0,05), но оставался выше показателей группы No3 был ниже показателей II группы (р<0,05), но оставался выше показателей интактного контроля (р<0,05). группы интактного контроля (р<0,05). Как указывалось ранее, наиболее показательными являются изменения Как указывалось ранее, наиболее показательными являются изменения осмотической резистентности в растворе No4, при внесении в который остаются осмотической резистентности в растворе No4, при внесении в который остаются целыми эритроциты, способные оказывать сопротивление осмотически активному целыми эритроциты, способные оказывать сопротивление осмотически авкетщиевснтовму.уТваекщ,евстрваус.твТоарке,Noв4равсытвяовлренNoод4овстыояввелреннооепдовсытошвенринеоеоспмовтыичшеескноийе осмотической резистентности эритроцитов у животных III и V групп относительно резистентности эритроцитов у животных III и V групп относительно II (р<0,05), II (р<0,05), при этом показатели III и V групп относительно I не менялись. при этом показатели III и V групп относительно I не менялись. При сравнении осмотической резистентности мембран эритроцитов во При сравнении осмотической резистентности мембран эритроцитов во II с II с III и V группами относительно собственных показателей, III и V группами относительно собственных показателей, отмечено, что начиная со отмечено, что начиная со второго месяца эксперимента происходит второго месяца эксперимента происходит стойкое последовательное снижение стойкое последовательное снижение осмотической резистентности осмотической резистентности клеточных мембран во II группе и повышение в III и клеточных мембран во II группе и повышение в III и V, что указывает нVа, чтсопуоксаозбынвоаестьна с«пРоесосвбенроастьро«лРае»свериатроплоал»иисапхоалриисдахоавридаоиврааираболотного повышать устойчивость клеточных мембран к повреждающему действию повышать устойчивость клеточных мембран к повреждающему действию N-НДЭА, а в совокупности с данными, указывающими на торможение N-НДЭА, а в совокупности с данными, указывающими на торможение опухолевого образования, снижение степени малигнизации, коррекции опухолевого образования, снижение степени малигнизации, коррекции системы системы ПОЛ-АОЗ, можно предположить, что повышение осмотической ПОЛ-АОЗ, можно предположить, что повышение осмотической резистентности резистентности клеточных мембран является одним из возможных клеточных мембран является одним из возможных механизмов механизмов антиканцерогенного действия «Ресвератрола» и полисахаридов антиканцерогенного действия «Ресвератрола» и полисахаридов аира болотного. аира болотного. Математическая модель прогнозирования риска развития рака печени Одной из задач исследования стало проведение более детального анализа корреляционных связей показателей системы ПОЛ-АОЗ и биохимических показателей крови, наиболее меняющихся в разные сроки экспериментального канцерогенеза, с помощью регрессионного анализа. Как показал анализ, между Математическая модель прогнозирования риска развития рака печени Одной из задач исследования стало проведение более детального анализа корреляционных связей показателей системы ПОЛ-АОЗ и биохимических показателей крови, наиболее меняющихся в разные сроки экспериментального канцерогенеза, с помощью регрессионного анализа. Как показал анализ, между показателями: Осмотическая резистентность мембран эритроцитов, МДА, СОД, АлАТ, АсАТ, ГП, КАТ, ЩФ, Na+/К+-АТФаза, – выявлена значительная корреляционная связь. При этом при проведении факторного анализа у исследуемых групп животных первый фактор (77,3%) объединил показатели ПОЛ-АОЗ (МДА, ГП, СОД, КАТ) и биохимические показатели крови (АлАТ, АсАТ, щелочная фосфатаза) и Na+/К+-АТФазу. Учитывая наличие связи между вышеперечисленными показателями (признаками), в ходе множественного регрессионного анализа получили уравнение регрессии (формулу) для прогностических моделей, с помощью которого прогнозируют развитие рака печени у экспериментальных животных: ВРРП = 145,231 – (0,031×A) + (0,922×B) – (0,859×C) – (0,291×D) + (15,502×E) + (6,302×F) + (1,883×G) – (0,089×H) – (27,99× I) + (6,757× J) , где: ВРРП – вероятность развития рака печени (в %), A – Осмотическая резистентность мембран эритроцитов (в % гемолиза); B – МДА (в мкмоль/л); C – СОД (в Ед.ингиб.); D – АлАТ (в мкмоль/с*л); E – АсАТ (в мкмоль/с*л); F – ГП (в мкмоль/л); G – КАТ (в МЕ/гHb); H – ЩФ (Ед/л); I – Na+/К+-АТФаза (в мкмоль Рн /мл белка/час); J – введение средств растительного происхождения («Ресвератрола» и полисахаридов аира болотного): 1 – если имело место, 0 – если не вводилось. Согласно общепринятым шкалам риск развития патологического процесса подразделяется на низкий, умеренный и высокий (Александрович Ю.С., 2015). При получении значения в пределах менее 30% риск развития рака печени низкий, в пределах 30-60% – умеренный, более 60% – высокий. В полученную формулу подставляют данные испытуемого животного и по полученному результату судят о вероятности развития рака печени у конкретного животного. По данным проведенного ROC-анализа, выявлена умеренная и в некоторых случаях высокая чувствительность и специфичность выбранных признаков, что подтверждает правильность их выбора для возможности прогнозирования риска развития злокачественных опухолей печени. Так, чувствительность осмотической резистентности мембран эритроцитов составила 91%, МДА – 85%, ГП – 80%, СОД – 77%, КАТ – 75%, АлАТ – 85%, АсАТ – 87%, ЩФ – 80%, Na+/К+-АТФазы – 91%, тогда как специфичность осмотической резистентности мембран эритроцитов составила 81%, МДА – 75%, ГП – 83%, СОД – 86%, КАТ – 78%, АлАТ – 72%, АсАТ – 78%, ЩФ – 81%, Na+/К+-АТФазы – 90%. Таким образом, проведение расчетов по представленной выше формуле, которое можно производить с помощью простых арифметических вычислений, позволяет с достаточно высокой точностью предсказать вероятность возникновения рака печени задолго до развития заболевания. Формула позволяет выделить группы высокого риска по возникновению рака печени у животных, а также позволяет оценить эффективность химиопрофилактической активности средств растительного происхождения («Ресвератрола» и полисахаридов аира болотного) у животных в эксперименте. Полученная модель прогнозирования обладает высокой точностью, позволяет рассчитать индивидуальный прогноз развития заболевания и доступна для широкого использования. ВЫВОДЫ 1. Полисахариды аира болотного и «Ресвератрол» оказывают ингибирующее влияние на канцерогенез печени и пищевода, индуцированный у крыс N-нитрозодиэтиламином, которое проявляется в достоверном снижении частоты возникновения и степени малигнизации неопластических изменений в печени, снижении множественности и злокачественности новообразований пищевода. 2. Введение в рацион животных полисахаридов аира болотного и «Ресвератрола» в динамике канцерогенеза, индуцированного N-нитрозодиэтиламином, приводит к снижению активности АлАТ, АсАТ, ЩФ, что подтверждает наличие у исследуемых веществ гепатопротекторного действия и позволяет рекомендовать их для длительного профилактического применения. 3. Полисахариды аира болотного и «Ресвератрол» в условиях экспериментального канцерогенеза печени и пищевода, индуцированного N-нитрозодиэтиламином у крыс, оказывают антиоксидантное действие, проявляющееся в снижении интенсивности ПОЛ и активации АОЗ, что является одним из механизмов их антиканцерогенной активности. 4. Полисахариды аира болотного и «Ресвератрол» в условиях экспериментального канцерогенеза печени и пищевода, индуцированного N-нитрозодиэтиламином у крыс, повышают осмотическую резистентность мембран эритроцитов, активность Na+/К+-АТФазы в ткани печени, что является возможным механизмом их химиопрофилактического действия. 5. Разработана математическая формула, позволяющая прогнозировать риск развития и выделить группы высокого риска экспериментального рака печени у животных, с использованием которой подтверждена химиопрофилактическая активность полисахаридов аира болотного и «Ресвератрола» в эксперименте. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Полученные результаты позволяют рекомендовать средства растительного происхождения (ресвератрол и полисахариды аира болотного) для проведения дальнейших доклинических и клинических исследований с целью их применения в качестве химиопрофилактических средств, способных снижать риск возникновения рака печени и пищевода, как в общей популяции, так и в группах высокого онкологического риска. 2. Рекомендовать разработанную модель прогнозирования риска развития рака печени у животных в качестве основы для создания и внедрения в клиническую практику аналогичной формулы, позволяющей формировать группы высокого риска по возникновению рака печени у людей с последующим проведением профилактических мероприятий.