Молекулярно-метаболический статус в тканях опухолей у больных раком шейки матки старше 40 лет при эндофитном и экзофитном вариантах роста

Характеристика материала и методов исследования
Представленная работа проведена на базе отделения онкогинекологии
ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России. В исследование были включены
134 пациентки раком шейки матки со стадиями заболевания Т1a – Т2а N0M0,
которые были под наблюдением в период с 2013 г. по 2019 г. Дизайн
представленного научного исследования согласован и одобрен независимым
локальным этическим комитетом ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава
России.
Критериемотборабольныхявлялсярадикальнорезектабельный,
морфологически подтвержденный диагноз РШМ.
В соответствии с целью исследования все больные РШМ были разделены
в зависимости от варианта формы роста опухоли на две группы: 1 группу
составили больные с экзофитной формой роста РШМ 78 из 134 (58%) человек;
2 группу– 56 из 134 (42%) больных с эндофитной формой роста РШМ.
Проводился тщательный сбор анамнестических данных с использованием, при
необходимости, сведений амбулаторных карт из женских консультаций с места
жительства.Приобследованиибольныхиспользованысовременные
диагностические методы и методики. Всем больным выполнена открытым
доступом, операция I-III типа по Piver. По показаниям, в соответствии со
стандартами и в зависимости от распространенности процесса 22 женщинам со
стадией Т1аNоMо – проводилась только операция. Остальным- 112 (83,5%)
больным, соответствующая стандартам адъювантная лучевая терапия. РШМ
практически с равной частотой возникал в возрасте до и после 50 лет, однако
различие формы роста опухоли не зависело от возраста больных (рис. 1).
Среди жителей города и села РШМ диагностирован в 44,8% и 55,2%
случаев соответственно. При этом у городских больных экзофитная и
эндофитная форма роста опухоли сформировалась соответственно в 47,4% и
41,0% соответственно у сельских – в 52,6% и 58,9% случаях. Разница была
несущественная.

Рисунок 1. Характеристика клинического материала

Плоскоклеточный рак с ороговением, без ороговения и аденокарцинома
установлены при экзофитном росте опухоли в 20,5%; 71,8% и 7,7% случаях и
при эндофитном в 26,8%; 64,3% и 8,9% соответственно. Различия данных не
достоверны.
Ведущим симптомом заболевания были кровянистые выделения из
половых путей и/или контактные выделения, в среднем, у 63 из 134 (63%)
больных. Эта жалоба отмечена у 47,5% (37 из 78) женщин при экзофитном
росте опухоли и у 26 из 56 (46,4%) – при эндофитном. Частота возникновения
экзофитного роста опухоли среди больных I стадии составила 66 из 102
(64,7%), а эндофитного существенно меньше – 36 из 102 (35,2% – р<0,05). Вместе с тем, у больных, имевших II стадию заболевания, существенно, в 2,3 раза чаще опухоль формировалась в виде эндофита. При II стадии эндофитный характер опухоли имел место у 20 из 32 (62,5%) больных, а экзофитный только у 12 из 32 (37,5% -р<0,05). Исследования были проведены в ткани опухоли, полученной при оперативном лечении больных РШМ (эндофитной и экзофитной формы роста). Дизайн исследования представлен на рисунке 2. T1aNoMo-T2aNoMo Рисунок 2. Дизайн исследования Молекулярно-генетические методы Материалом для исследования служили образцы ДНК из FFPE-блоков опухолевой и условно здоровой ткани больных с диагнозом РШМ эндофитной (n=20) и экзофитной (n=20) формами роста, проходивших плановое лечение в ФГБУ «РНИОИ» Минздрава России. Экстракцию ДНК проводили набором Thermo Scientific Gene JET Ffpe DNA Purification Kit согласно инструкции изготовителя, концентрацию ДНК измеряли на флюориметре Qubit 2.0® (Invitrogen, США), качество ДНК проверяли электрофоретическим методом в 2%-ом агарозном геле. Определение относительной копийности 8-ми генов: ESR1, ESR2, GPER1, STS, SULT1A1, SULT1E1, CYP1A1, CYP1A2 и референсных генов GAPDH, B2M, проводили методом RT-qPCR. Каждые 25мкл ПЦР-смеси содержали 10 нг геномной ДНК, 0,2mM dNTP’s, по 600 нМ прямого и обратного праймеров, 2,5 mM MgCl2, ПЦР-буфер, 0,05 u/µl ДНК-полимеразы Thermus aquaticus («Синтол», Россия). В качестве красителя использовали EvaGreen (Biotium, США). Амплификацию каждой из проб осуществляли в трех повторностях с использованием термоциклера CFX96 (Bio-Rad, США) по следующей программе: 95 °C 3 мин., и 40 циклов при 95°C 10 с, 58 °C 30 с (чтение оптического сигнала FAM для красителя EvaGreen) и 72°C 15 с. Первичные данные RT-qPCR анализировали с помощью программного обеспечения Bio- Rad CFX Manager (ver. 2.1). Для внутреннего контроля в каждой постановке использовали NTC пробы. Прямые и обратные праймеры для всех генов были разработаны с использованием базы NCBI Gen Bank. Специфичность подобранных праймеров проверяли в ходе предварительной оптимизации условий амплификации по кривым температуры плавления ампликонов и электрофорезу продуктов ПЦР в 2%-ом агарозном геле. Относительную копийность генетического локуса (RСQ) рассчитывали по формуле 2-ΔCt. Дозу исследованного локуса считали равной диплоидному набору (2n), если отношение RCQ опухоль/норма ~1. Если отношение RCQопухоль/норма было> 1,5 или < 0,5, дозу локуса считали увеличенной (>3n) или уменьшенной (<1n), соответственно. Биохимические методы. Содержание половых гормонов: эстрадиола – Е2, эстрона – Е1, тестостерона общей и свободной формы (Тобщ, Тсв), прогестерона – Р4, ССГ, белков Е6 и Е7, факторов роста (VEGF-A, VEGF-R1, EGF, EGF-R) в гомогенатах опухоли и перифокальной зоны (на расстоянии 1 см от видимого края опухоли) определяли стандартным ИФА методом (ХЕМА, Россия; DBC Канада; BenderMedSystem, Австрия). Статистические методы обработки результатов исследования Полученные данные анализировали с помощью методов статистической обработки с помощью пакета прикладных программ Statistica 10,0, используя как параметрические, так и непараметрические критерии (Трухачева Н.В., 2013). Все полученные результаты были проверены на соответствие закону о нормальном распределении. Оценку достоверности различий проводили с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни и параметрического критерия Стьюдента. При обработке результатов вычисляли значения средней величины, дисперсию, стандартную ошибку. Существенными считали различия при р<0,05, при этом соблюдались общие рекомендации для медицинских исследований. Результаты исследования Всебольные, вошедшиев исследование, имелипрогностически неблагоприятныерепродуктивныеиполовыефакторыдляразвития злокачественного процесса шейки матки, однакоотдельногофактора, определяющего формирование экзофитной или эндофитной формы роста РШМ, не выявлено. Подавляющее число - 101 из 134 (75,4%) больных в анамнезе имели сопутствующую патологию шейки матки. Фоновые процессы шейкиматкихарактеризовалисьналичиемпредшествующейиранее пролеченной истинной эрозии шейки матки и псевдоэрозии (эктопия). Такая патология имелась в среднем у 57 из 78 (73,0%) больных с экзофитной опухолью и у 44 из 56 (78,6%) при эндофитной опухоли. Ранняя половая жизнь до 18 лет и частая смена партнеров имела место практически у каждой третьей больной. Многодетных матерей было 17,8% среди больных с эндофитной формой роста опухоли и 11,5% с экзофитной. В анамнезе многократные аборты были у 23,1% больных при экзофитной опухоли и 30,4% женщин, с эндофитной опухолью. Травматизация ткани шейки матки различной степени и характера ранее была у 72 из 134 (53,7%) пациенток. В группе женщин с эндофитной формой роста деформация, развитие рубцовой ткани шейки матки имело место у 37 из 56 (66,1%) женщин, а при экзофитном росте такое повреждение шейки матки было у меньшего числа больных - у 35 из 78 (44,9% - р<0,05). Установлена разница в частоте встречаемости ожирения, при этом известно, что жировая ткань является источником внегонадного синтеза эстрогенов. Среди больных с эндофитной формой роста опухоли было в 1,6 раза (р<0,05) больше пациенток с ожирением – 44 из 56 (78,6%), против 38 из 78 (48,7%) при экзофитной форме роста. При этом, 1-я степень (индекс массы тела-ИМТ 30- 34,9) и 2-я степень (ИМТ 34,9 и выше) ожирения среди больных с экзофитными опухолями имелась соответственно в 42,1% и 57% случаях, а при эндофитном росте опухоли был соответственно у 20,4% и 79,4% женщин (р<0,05). 5-тилетняя общая и бессобытийная выживаемость больных с Т1аNоMо стадией составила соответственно 94,9±4,0 и 90,0±4,9%. У больных с экзофитной формой роста опухоли соответственно 96,7±2,2 и 93,2±3,1%, с эндофитной - соответственно 93,2±5,7 и 86,8±4,9%. Разница в результатах общей выживаемости, связанная с формой роста опухоли, составила 3,5%, а бессобытийной – 6,4% (Log-Rank Test р=0,5746). После комбинированного лечения со стадиями процесса Т1а2NоMо - T1b2NoMo общая и бессобытийная выживаемости больных независимо от формы роста опухоли составили соответственно 91,2 ±3,7% и 87,6±4,5%. Общая выживаемость при экзофитном и эндофитном варианте роста была соответственно на уровнях 93,8±3,3 и 88,5±4,9%. Разница в результатах несущественна – 5,3%. Бессобытийная выживаемость соответственно 91,1±2,6 и 84,2±4,1%. Разница результатов, связанная с формой роста, - 6,9% (Log-Rank Test р= 0,4327). Общая 5-ти летняя выживаемость больных Т2аNоMо РШМ независимо от формы роста опухоли составила 85,8±4,9%, отдельно при экзофитных опухолях 91,8±4,2%, при эндофитных - 83,8±3,7%. Разница результатов на 8,0% несущественна(Log-RankTestр=0,5610).Бессобытийная5-тилетняя выживаемость независимо от формы роста опухоли была у 81.4±3,9% больных II стадии РШМ, при экзофитной форме роста 83,2±4,5%, а при эндофитных в 79,6±4,1%. (Log-Rank Test р=0,7823). В целом, локальные и локорегионарные рецидивы возникли у 4 из 78 (5,1%) больных, имевших экзофитную форму роста опухоли шейки матки. При эндофитном характере поражения, рецидивные процессы установлены у 8 из 56 больных (14,2%), в 2,8 раза чаще, и развивались они в более ранние сроки. Было установлено, что в самой злокачественной опухоли и прилежащих тканях был нарушен гормоногенез, что выражается в резкой смене приоритетов в сторону превалирования андрогенов на фоне значительного снижения эстрогенов. В опухолях шейки матки наблюдался прогестероновый дефицит, чтоможетотражатьсянафункциональнойактивностиэстрадиолаи тестостерона.Нарядусоднонаправленнымиизменениямиэстроген- андрогенного соотношения и отсутствия защитного антипролиферативного действия со стороны прогестерона, выявлены различия в динамике ССГ при различных вариантах роста опухоли шейки матки. В случае экзофитного роста снижение эстрогенов и повышение андрогенов влекло за собой парадоксальное повышение выработки ССГ и снижение его при эндофитном варианте РШМ (рис. 3). Рисунок 3. Содержание гормонов и ССГ в тканях шейки матки при разных вариантах роста опухоли Экспрессия Е7 меняет гормоногенез в сторону усиления синтеза эстрогенов и андрогенов, стимулирует выработку ССГ и пролактина, вызывает прогестероновый дефицит во всех исследуемых образцах тканей. Визуально неизмененная ткань при экзофитном варианте роста РШМ менее подвержена влиянию экспрессии онкобелка Е7. При экспрессии белка Е7 изменение гормонального статуса в тканях опухоли независимо от варианта роста имеет однонаправленный характер, также как в визуально неизменѐнных тканях и отличаются только степенью выраженности происходящих изменений (рис. 4). Рисунок 4. Содержание гормонов и ССГ в тканях шейки матки при разных вариантах роста опухоли в зависимости от Е7 Выявленные взаимоотношения стероидных гормонов и их связывающего глобулина могут свидетельствовать о потере со стороны гормона его специфической функции связывания и поддержании баланса активных и связанных форм половых гормонов. Важное значение для развития РШМ играет нарушение метаболизма женских половых гормонов и, в частности, сдвиг соотношения между отдельными их фракциями. Известна также негативная роль в развитии рака метаболита 16-гидроксиэстрона (16α-ОНЕ1) и, особенно, нарушения его равновесия с 2-гидроксиэстроном (2-ОНЕ1). Найдено перераспределение содержания метаболитов эстрогенов в ткани опухоли и ее перифокальной зоны вне зависимости от формы роста. Так содержание 2-ОНЕ1 в образцах злокачественной опухоли было в среднем в 1,7 раза ниже, чем в визуально неизмененной ткани шейки матки. Уровень 16α-ОНЕ1, напротив, был в среднем в 1,3 раза выше нормативных показателей. Коэффициент соотношения 2-ОНЕ/16α-ОНЕ1 в ткани злокачественной опухоли шейки матки оказался в 2,2 раза сниженным (р<0,05). Все изученные показатели в перифокальной зоне не имели достоверных отличий от значений в ткани злокачественной опухоли. Несмотря на то, что при различных формах роста опухоли шейки матки, метаболиты 2-ОНЕ1 и 16α-ОНЕ1, а также их соотношение не имели достоверных отличий, экспрессия белка Е7 выявила ряд расхождений. Так, при экзофитной форме роста в ткани опухоли найдено повышение соотношения метаболитов в 1,4 раза (р<0,05) при экспрессии белка Е7. При эндофитной форме роста в ткани опухоли наблюдалось снижение в 1,8 раза (р<0,05) соотношения 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1. Нами проведено сравнение относительной копийности генетических локусов, посредством которых реализуются клеточные и физиологические реакции на действие эстрогенов в опухолевых и нормальных клетках шейки матки. Для всех проанализированных генетических локусов было отмечено изменение дозы генов в опухолевых клетках шейки матки относительно нормальных. Преобладала тенденция увеличения копийности. Статистически достоверное изменение копийности было выявлено для трех генетических локусов - GPER1, SULT1A1, CYP1A1 (рис. 5). Рисунок 5. Копийность генов в опухолевых клетках РШМ относительно нормальной ткани При изучении изменения копийности генов в возрастных группах больных РШМ было отмечено, что в группе 41-50 лет с эндофитной формой роста опухоли было достоверное, в 1,3 раза (р<0,05), увеличение копийности генов GPER1 и CYP1A1 с частотой 41,7% и 66,7% соответственно. Также в этой возрастной группе отмечалось увеличение амплификации гена CYP1A2 у 41,67% больных. В возрастной группе 51-60 лет с эндофитной формой роста опухоли наблюдалось увеличение копий генов ESR2, GPER1, SULT1A1 с частотой 50, 100 и 75% соответственно (рисунок 6). Рисунок 6. Изменение копийности генов в возрастных группах больных РШМ У пациенток с экзофитной формой роста опухоли в возрастной группе 41- 50 лет выявлено достоверное увеличение копийности гена CYP1A1. По остальным генетическим локусам в разных возрастных группах изменения копийностиненаблюдалось.Следовательно,можнопредложить,что необходимо использовать данные о генах GPER1, SULT1A1, CYP1A1 в качестве биомаркеров, указывающих на малигнизацию тканей шейки матки. Хорошо известно, что опухоль не способна развиваться и расти без адекватного на то обеспечения, поэтому в последнее время пристальное внимание в онкологии уделяют процессам ангиогенеза в опухоли. Было установлено, что в ткани опухоли при эндофитном росте соотношение VEGF-А (маркера сигнального пути ангиогенеза) к его рецептору R1 не отличается от такового в визуально неизмененной ткани, а образование патологической кровеносной сети активно протекает в перифокальной зоне опухоли (рис. 7). Рисунок 7. Уровень факторов роста, их рецепторов и антигена плоскоклеточной карциномы в тканях шейки матки при разных вариантах роста опухоли При этом активация VEGF практически не зависит от EGF. Напротив, при экзофитном росте VEGF-А/ R1 проявляет активность именно в ткани опухоли, а не в ее перифокальной зоне, и зависит от уровня EGF. Соотношение EGF/EGF-R, важнейшего показателя аутокринного пути промоции опухоли, в исследуемых тканях указывает на повышенную пролиферативную активность только клеток ткани опухоли при экзофитном росте. Экспрессия маркера плоскоклеточного рака SCC при экзофитном росте ограничена только тканью опухоли, тогда как при эндофитном росте выявляется и в перифокальной зоне опухоли. Сравнивая влияние белка Е7 на активацию ростовых факторов в ткани РШМ при двух вариантах его роста, можно предположить, что в ткани экзофитной опухоли этот белок способствует повышению активации VEGF-А – сигнального пути ангиогенеза, тогда как в ткани эндофитной опухоли ограничивает активность указанного пути (рис. 8). Причины различного влияния белка Е7 на ангиогенную активность экзофитных и эндофитных опухолей шейки матки еще предстоит выяснить, однако полученные результаты подтверждают неблагоприятный прогноз и более агрессивное течение эндофитного варианта РШМ. Рисунок 8. Уровень факторов роста, их рецепторов и антигена плоскоклеточной карциномы в ткани опухоли шейки матки при разных вариантах ее роста в зависимости от Е7 Таким образом, в тканях опухоли РШМ вне зависимости от формы роста наблюдалось выраженное превалирование андрогенов на фоне значительного сниженияэстрогенов,прогестероновыйдефицитнафонеувеличения пролактина; снижение содержания 2-ОНЕ1 и соотношения 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1 при увеличении16α-ОНЕ1; увеличение содержания VEGF-A и EGF (рис. 9). 2-OHE1/16A-OHE12-OHE1/16A-OHE1 VEGF-A, VEGF-VEGF-A, VEGF- A/R1A/R1 Рисунок 9. Молекулярно-метаболические особенности ткани опухоли шейки матки Отличительными особенностями при различных формах роста опухоли были: повышение уровня ССГ в случае экзофитного роста и снижение при эндофитном варианте; коэффициенты VEGF-А/R1 и EGF/EGF-R увеличивались только при экзофитном росте новообразования. Экспрессия Е7 при экзофитной форме роста вызвала в ткани опухоли повышение соотношения метаболитов эстрогенов, повышение активации VEGF-А, увеличение коэффициента соотношения VEGF-A/R1, снижение уровня SCC и EGF, а при эндофитной форме роста – снижение соотношения 2- ОНЕ1/16α –ОНЕ1 метаболитов эстрогенов, уровня VEGF-A и коэффициента соотношения VEGF-A/R1, повышение активности SCC и EGF. ВЫВОДЫ 1.В формировании различной формы роста опухоли шейки матки принимают участие однотипные возрастные, социальные и репродуктивные факторы. Развитие эндофитной формы роста рака в большей степени зависит от травматических повреждений шейки матки и метаболических нарушений в виде ожирения, встречающихся в 1,5 и в 1,6 раза чаще (р<0,05), чем при экзофитном варианте. 2.Независимо от стадии процесса, при эндофитной форме рака шейки матки рецидивы заболевания после радикального лечения встречаются у 14,2% больных, против 5,1% у пациенток с экзофитными опухолями, что в 2,8 раза чаще. 5-летняя выживаемость при начальном раке шейки матки (T1a- T2aNoMo) с экзофитной и эндофитной формами роста не имела статистически достоверных отличий, но имела тенденцию к снижению при эндофитных опухолях. 3.В тканях опухоли рака шейки матки и в прилежащих тканях вне зависимостиотформыростаопухолинаблюдалосьвыраженное превалирование андрогенов - увеличение тестостерона в среднем на 78% на фоне значительного снижения эстрогенов - сумма эстрогенов снижена в среднем на 69,4%, выявлен прогестероновый дефицит в среднем на 33% и увеличение пролактина в среднем на 61%. Различия выявлены в динамике ССГ: в случае экзофитного роста произошло повышение выработки ССГ в среднем в 1,9 раза, а при эндофитном росте, напротив, отмечено снижение данного показателя в 1,8 раза. При экспрессии белка Е7 изменения гормонального статуса во всех исследуемых тканях независимо от варианта роста опухоли имелиоднонаправленныйхарактериотличалисьтолькостепенью выраженности. 4.Содержание метаболитов эстрогенов и их соотношение в исследуемых тканях не зависели от формы роста опухоли: найдено снижение в среднем 2,2 раза содержания 2-ОНЕ1 и в 2,3 раза соотношения 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1. Экспрессия Е7 при экзофитной форме роста вызвала в ткани опухоли повышение соотношения метаболитов эстрогенов в 1,4 раза, а при эндофитной форме роста – снижение в 1,8 раза. 5.В ткани опухоли при эндофитном росте соотношение VEGF-А к его рецептору R1 не отличалось от такового в визуально неизмененной ткани, а в перифокальной зоне этот показатель был выше в 2 раза, т.е. образование патологической кровеносной сети активно протекало в перифокальной зоне опухоли. При этом активация VEGF практически не зависела от EGF. При экзофитном росте коэффициент VEGF-А/ R1 повышался в опухоли в 3,8 раза и зависел от уровня EGF. В ткани экзофитной опухоли белок Е7 способствовал повышению содержания VEGF-А в 3,7 раза, тогда как в ткани опухоли при эндофитном варианте роста экспрессия Е7 напротив, вызывала снижение уровня VEGF-A в 2,5 раза. 6.Соотношение EGF/EGF-R при экзофитном росте увеличивалось в 2,5 раза только в ткани опухоли и указывало на повышенную пролиферативную активность. Экспрессия маркера плоскоклеточного рака SCC при экзофитном росте была ограничена только тканью опухоли - выше в 3,6 раза, тогда как при эндофитном росте выявлялась в ткани опухоли и в перифокальной зоне – выше чем в интактной в 3,1 и 1,6 раза (р<0,05) соответственно. В ткани экзофитной опухоли белок Е7 способствовал снижению уровня SCC в 1,3 раза (р<0,05), тогда как в ткани опухоли при эндофитном варианте роста экспрессия Е7 вызывала повышение содержания SCC в 2,2 раза. 7.Выявлено статистически значимое увеличение копийности генов GPER1 и CYP1A1 в группе больных РШМ 41-50 лет. При эндофитной форме роста опухоли наблюдалось статистически значимое увеличение копийности генов GPER1, CYP1A1 в среднем в 1,3 раза (р<0,05), при экзофитной форме роста опухоли отмечено увеличение копийности гена CYP1A1 в 1,4 раза (р<0,05). ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Высокий риск развития РШМ отмечен у больных с метаболическими нарушениями, имеющих сочетанные деформации, разрывы шейки матки на фоне ВПЧ – инфицирования. Подобныебольныенуждаютсявдиспансерномнаблюдениис выполнением расширенной кольпоскопии. При появлении морфологических признаков дисплазии эпителия шейки матки CIN II-III, показана конизация (ножевая, радиоволновая или электродиатермоконизация) и морфологический контроль состояния оставляемой части цервикального канала.