Неинвазивные электрохимические методы оценки антиоксидант/оксидантной активности биологических объектов : диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук : 1.4.2

ОГЛАВЛЕНИЕ ………………………………………………………………………………………….. 2
ВВЕДЕНИЕ ……………………………………………………………………………………………….. 5
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР……………………………………………………….. 13
1.1 Активные формы кислорода, образующиеся в организме ……………………. 13
1.2 Система антиоксидантной защиты организма ……………………………………… 14
1.3 Окислительный стресс и его роль в патогенезе ряда заболеваний ………… 18
1.3.1 Болезни системы кровообращения ……………………………………………………. 19
1.3.2 Окислительный стресс и репродуктивная функция мужчин ……………… 19
1.3.3 Окислительный стресс и слюна человека………………………………………….. 20
1.3.4 Окислительный стресс и кожа человека ……………………………………………. 22
1.4 Методы мониторинга окислительного стресса …………………………………….. 24
1.4.1 Методы определения оксидантов ……………………………………………………… 24
1.4.2 Методы определения антиоксидантов ………………………………………………. 27
1.4.3 Электрохимические методы определения АОА/ОА ………………………….. 30
1.4.4 Методы оценки АОА слюны…………………………………………………………….. 32
1.4.5 Методы оценки АОА/ОА семенной жидкости ………………………………….. 33
1.4.6 Методы оценки АОА кожи человека ………………………………………………… 36
1.5 Заключение ………………………………………………………………………………………… 40
1.6 Постановка задачи………………………………………………………………………………. 41
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ………………………………………….. 43
2.1 Оборудование и средства измерения …………………………………………………… 43
2.2 Реактивы и обьекты исследования ………………………………………………………. 43
2.3. Методы исследования ………………………………………………………………………… 45
ГЛАВА 3. ХРОНОАМПЕРОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ
АНТИОКСИДАНТОЙ АКТИВНОСТИ ……………………………………………………. 48
3.1 Выбор условий анализа ………………………………………………………………………. 48
3.2 Определение АОА плазмы крови ………………………………………………………… 56
3.2.1 Исследование раствора, моделирующего состав плазмы крови …………. 56
3.2.2 Выбор степени разбавления пробы …………………………………………………… 57
3.2.3 Определение АОА плазмы крови в присутствии модельного АО ……… 58
ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИОКСИДАННОЙ АКТИВНОСТИ
СЛЮНЫ ХРОНОАМПЕРОМЕТРИЧЕСКИМ И
ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДАМИ ……………………………………………. 62
4.1 Хроноамперометрический метод исследования АОА слюны ……………….. 62
4.1.1 Выбор степени разбавления пробы …………………………………………………… 62
4.1.2 Выбор способа подготовки слюны к анализу ……………………………………. 63
4.1.3 Определение АОА слюны в присутствии модельного АО …………………. 65
4.2 Потенциометрический метод исследования АОА слюны …………………….. 66
4.2.1 Выбор состава медиаторной системы и степени разбавления пробы …. 66
4.2.2 Выбор способа подготовки слюны к анализу ……………………………………. 68
ГЛАВА 5. ОЦЕНКА АНТИОКСИДАНТ/ОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ
СЕМЕННОЙ ЖИДКОСТИ ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ ……. 72
5.1 Определение АОА семенной жидкости в присутствии модельного АО .. 72
5.2 Исследование возможности одновременного обнаружения
антиоксидантов и оксидантов …………………………………………………………………… 73
5.3 Оценка АОА/ОА образцов семенной жидкости с оксидантной
активностью …………………………………………………………………………………………….. 79
5.4 Оценка АОА/ОА семенной жидкости пациентов с нормо- и патоспермией
………………………………………………………………………………………………………………… 82
ГЛАВА 6. НЕИНВАЗИВНЫЙ ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД
ОЦЕНКИ АНТИОКСИДАННОЙ АКТИВНОСТИ КОЖИ ………………………… 85
6.1 Обоснование выбора электрода …………………………………………………………… 85
6.2 Исследование антиоксидантной активности модельных систем
антиоксидантов………………………………………………………………………………………… 89
6.3 Исследование АОА кожи ……………………………………………………………………. 90
6.4 Исследование действия косметических кремов на АОА кожи. …………….. 91
6.5 Исследование действия напитков на АОА кожи и фракций крови ……….. 93
6.6 Предварительные клинические исследования АОА кожи ………………….. 101
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ……………………………………………………………………………………… 104
СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ …………………. 107
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………………………………….. 109

1. Предложен и развит новый гибридный вариант
хроноамперометрического метода, включающий предшествующую
химическую реакцию восстановления K3[Fe(CN)6] антиоксидантами пробы.
Показана линейная зависимость тока окисления продукта этой реакции –
K4[Fe(CN)6] от концентрации модельных АО (АК, МК, глутатион, цистеин),
что позволяет использовать приращение тока в качестве аналитического
сигнала. Предел обнаружения АО равен 6.9·10-6 М.
2. Предложенный подход апробирован при исследовании
биологических образцов. Относительное стандартное отклонение
результатов анализа плазмы крови не превышало 9%. Степень корреляции
результатов определения АОА предложенным гибридным вариантом
хроноамперометрического метода в сравнении со стандартизованным
потенциометрическим методом составила 0.89 (Rкрит=0.67), рассчитанные
значения критериев Стьюдента и Фишера (tэксп = 0.32 и Fэксп= 1.03) не
превышают критических значений.
3. Разработана методика определения АОА слюны новым гибридным
вариантом хроноамперометрического метода, не требующая специальной
пробоподготовки. Относительное стандартное отклонение результатов
определения АОА слюны не превышает 8%. Степень корреляции результатов
определения АОА предложенным гибридным вариантом
хроноамперометрического метода в сравнении со стандартизованным
потенциометрическим методом составила 0.92 (Rкрит=0.67), рассчитанные
значения критериев Стьюдента и Фишера (tэксп = 1.48 и Fэксп= 1.91) не
превышают критических значений.
4. Исследованы закономерности изменения потенциала медиаторной
системы K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] в присутствии образцов, содержащих
оксиданты и антиоксиданты. Разработаны алгоритмы определения АОА/ОА
гибридным потенциометрическим методом.
5. Разработана методика определения АОА/ОА семенной жидкости,
позволяющая оценить АОА и ОА в одном измерении. Диапазон
определяемых концентраций АОА составляет 0.2 – 6 ммоль-экв/дм3.
Показатели повторяемости и воспроизводимости составляют 7 и 13 %.
6. Установлена взаимосвязь антиоксидант/оксидантной активности
семенной жидкости с состоянием репродуктивной системы. Показано, что
наличие оксидантной составляющей при исследовании семенной жидкости
может указывать на развитие патологий репродуктивной функции мужчин.
7. Развит неинвазивный способ определения антиоксидантной
активности кожи гибридным вариантом метода потенциометрии с
использованием медиаторной системы, получены результаты, показывающие
взаимосвязь величины АОА кожи с:
– составом используемой косметической продукции;
– составом потребляемых напитков;
– патологиями сердечно-сосудистой системы
8. Разработанные алгоритмы определения АОА/ОА биологических
жидкостей и тканей реализованы в потенциометрических анализаторах
«Антиоксидант» и «ПА-S», предназначенных для определения АОА/ОА
семенной жидкости и кожи.

Перспективы дальнейшей разработки темы исследования
заключаются в том, что полученные результаты, развитые подходы и методы,
созданные на их базе приборы, будучи использованы в медицине, позволят
разработать диагностические показатели и критерии оценки состояния здоровья
человека. Для этого, в первую очередь, необходимы: проведение исследования
АОА клеток, в частности сперматозоидов, гибридным вариантом
хроноамперометрического метода; разработка гибридного варианта метода
хроноамперометрии для определения ОА биологических жидкостей;
проведение дополнительных исследований для определения концентрации АО
и Ох в семенной жидкости, разработка теоретических основ неинвазивного
потенциометрического метода определения АОА кожи; улучшение
воспроизводимости результатов исследования кожи; сокращение времени
анализа.
СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ

АК – аскорбиновая кислота;
АО – антиоксидант;
АОА – антиоксидантная активность;
АОА/ОА – антиоксидант/оксидантная активность;
АОС – система антиоксидантной защиты организма
АФА – активные формы азота;
АФК – активные формы кислорода;
ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография;
ГР –иглутатионредуктаза;
ГПО –тглутатионпероксидаза;
ГТ – глутатионтрансфераза;
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота;
ДК – диеновые конъюгаты;
Кат – каталаза;
МДА – малоновый диальдегид;
МК – мочевая кислота;
ОС – окислительный стресс;
ОА – оксидантная активность;
ПОЛ – перекисное окисление липидов;
СОД – супероксиддисмутаза;
ТПЭ – толстоплёночный платиновый электрод;
ТУЭ – толстоплёночный углеродсодержащий электрод;
ЭПР – электронный парамагнитный резонанс;
ЭХЯ – электрохимическая ячейка;
ЦВА – циклическая вольтамперометрия;
ХА – хроноамперометрия;
ABTS – 2,2′-азино-бис-(этилбензтиазолино-6-сульфонат);
BDD – допированный бором алмазный электрод;
DCFH-DA – дихлорофлуоресцеин-диацетат;
DPPH – 1,1-дифенил-2-пикрилгидразил;
FRAP – железо-восстанавливающая антиоксидантная способность (.);
ORAC – способностькк абсорбции кислородных радикалов (Oxygen
radical absorption capacity);
TEAC – антиоксидантная активность в эквивалентахеТролокса (Trolox
equivalent antioxidant capacity);
TRAP – общая способность кпулавливанию радикалову(Total radical
trapping parameter).