Новые подходы к получению некоторых люминесцентных и плазмонных меток для иммуноанализа: возможности и ограничения

Во Введении обоснована актуальность проведенных исследований, сформулированы основные цели и задачи, описана научная новизна и практическая значимость полученных результатов, а также сформулированы основные положения, выносимые на защиту.
В Главе 1 представлен критический обзор литературных данных, описывающий последние достижения в области синтеза, фракционирования и применения УНС. Подробно рассмотрены свойства ЗНЧ, подходы к их получению и модификации. Приведены основные преимущества и недостатки исследуемых наноструктур, устранение которых составило основу данной диссертационной работы. Представлена общая информация о подходах конъюгации УНС и ЗНЧ с антителами, подробно описаны характеристики конъюгатов и пути их применения.
В Главе 2 собраны исчерпывающие сведения об использованных реагентах и материалах для экспериментальной части научного исследования. Подробно описаны методики синтеза УНС, их очистки и фракционирования, а также конъюгации с антителами. Представлены методики синтеза ЗНЧ, одноэтапно модифицированных биотином, подходы к созданию меток на основе ЗНЧ@биотин:стрептавидин со специфическими антителами, проведения иммуноанализа и расчета аналитических характеристик.
Глава 3 посвящена синтезу УНС из ДСН ГТ методом с целью оптимизации подхода для получения стабильных и ярких УНС для их последующего аналитического применения.
Одним из важнейших
параметров при синтезе УНС ГТ
методом в автоклаве является
температура синтеза. В целях
оптимизации свойств УНС был исследован температурный интервал нагрева 160- 300oС, а также продолжительность гидротермальной обработки – 1-6 часов при постоянной концентрации ДСН – 7 мг/мл.
Показано, что увеличение температуры синтеза УНС (при постоянном времени нагрева – 3 часа) приводит к значительному сдвигу максимумов поглощения (рис. 1А) и люминесценции (рис. 1Б) в более длинноволновую область спектра. Максимум испускания при температурах синтеза 180-200oС был
Рисунок 1. Спектры поглощения (А) и люминесценции (Б) УНС, полученных ГТ методом в течение 3 часов: 1 – 160 ̊C (λвозб. = 344 нм), 2 -180 ̊C (λвозб. = 344 нм) 3 – 200 °C (λвозб. = 344 нм), 4 – 220 ̊C (λвозб. = 390 нм), 5 – 250 ̊C (λвозб. = 390 нм), 6 – исходный раствор ДСН
зарегистрирован в области 440 нм, при увеличении температуры до 220oС сместился в область 500 нм с увеличением интенсивности люминесценции, что может свидетельствовать об увеличении уровня сопряжения в полученных структурах. Кроме того, стоит отметить, что УНС имеют широкий спектр люминесценции (ширина спектрального пика, зафиксированная на половине максимальной амплитуды, составляет около 100-130 нм), что вероятнее всего свидетельствует о полидисперсности полученных УНС в одном синтезе.
Для увеличения интенсивности люминесценции и стабильности УНС варьировали время ГТ обработки в автоклаве. Показано, что при небольших временах обработки (1-2 часа) не достигается оптимальная интенсивность люминесценции продукта реакции, что может быть связано с неполной конверсией исходного ДСН в люминесцентный продукт, а нагрев более 3 часов приводит к формированию большого количества сажи в продукте реакции (рис. 2).
В результате проведенных экспериментов установлено, что оптимальным временем для получения УНС с максимальной интенсивностью люминесценции является 3 часа
Рисунок 2. График зависимости интенсивности люминесценции УНС от времени ГТ синтеза
при температуре 220oС.
Типичным признаком УНС является зависимость длины волны испускания от длины волны возбуждения, что связано с одновременным присутствием различных люминесцентных центров в их структуре. Характеристичные спектры люминесценции УНС, синтезированных из ДСН при оптимальных условиях, приведены на рис. 3А. Снимки с ПЭМ коррелируют со спектральными данными и демонстрируют смесь структур, средний диаметр УНС ~ 20 нм, среди которых максимальный размер ~ 42 нм, а наиболее мелкие наноструктуры – 3,5-5 нм (рис. 3Б).
Для получения информации о структуре УНС использовали данные спектра КР . Спектр КР содержит характеристичные для углеродных соединений пики D (~1300 см-1) и G (~1600 см-1),
Рисунок 3. Спектры люминесценции (А) и снимок ПЭМ (Б) коллоидного раствора УНС
уширенный
профиль которых предоставляет
информацию об уровне разупорядочения структуры и /или кластеризации в УНС. Полоса D обычно демонстрирует присутствие ароматических колец в структуре. Смещенное положение полосы G (1620 см-1) относительно графита (1580 см-1) и соотношение интенсивностей пиков I (D)/I(G) указывают на небольшой размер структур. Для получения информации о структурных фрагментах и функциональных группах в составе УНС использовали данные ИК спектроскопии. Асимметричные колебания сульфогрупп ν(as. S=O.), входящих в состав ДСН, имеют несколько полос в области 1200-1260 см-1, что также подтверждается деформационными колебаниями δ(S-O-C) при 870 см-1. Пик в области 1720 см-1 соответствует валентным колебаниям группы ν(C=О). В области 1150-1060 см-1 имеются полосы средней интенсивности, соответствующие колебаниям углеродного скелета. В диапазоне 3011-2800 см-1 имеются некоторые пики, соответствующие асимметричным и симметричным колебаниям -СН2- алифатических фрагментов. В высокочастотной области имеются пики связанных OH-групп.
Показано, что при оптимальных параметрах ГТ синтеза (220oС, 3 часа) был получен полидисперсный продукт, содержащий несколько испускающих центров, что требует дальнейшего фракционирования перед оценкой возможности его применения.
С целью разделения полученной смеси УНС по размерам и выделения фракций со схожими физико-химическими характеристиками проводили фракционирование коллоидного раствора УНС с применением метода эксклюзионной хроматографии. Этот метод позволяет получать настраиваемое количество фракций УНС для дальнейших исследований. В результате проведенных экспериментов были получены 48 фракций УНС, которые обладали различными люминесцентными свойствами (Рис. 4).
Рисунок 4. Спектры люминесценции для фракций c различным удерживаемым объемом: А- 7 мл (фр. 10); Б- 10,5 мл (фр. 15); В- 16,1 мл (фр. 23); Г- 25,9 мл (фр. 37); Д- 27,3 мл (фр. 39)
Во фракциях были идентифицированы 3 типа испускающих центров с максимумами люминесценции в областях: 410-420 нм (тип 1), 490 нм (тип 2) и 530 нм (тип 3). Наибольшую интенсивность люминесценции имел первый тип испускающих центров при оптимальном возбуждении 340 нм (фракции 8-15) (рис. 4А, Б). Во фракциях 10-20 присутствовал второй тип испускающих центров с наименьшей интенсивностью люминесценции, а также примеси структур типа 1 и 3 (рис. 4Б – Г). Третий тип испускающих центров (тип 3) характеризовался длинноволновым максимумом испускания ~530 нм (рис. 4Г, Д), максимальная интенсивность люминесценции (λвозб. = 500 нм) типа 3 достигалась во фракции 39. Отличительной особенностью спектра люминесценции третьего типа является отсутствие сдвига длин волн испускания при увеличении длин волн возбуждения. Это, вероятно, связано с наличием люминесцентных центров аналогичного типа.
Для того, чтобы соотнести данные люминесценции с лежащей в основе структурой и морфологией УНС, были проанализированы спектры КР (рис. 5А) и снимки ПЭМ (рис. 5Б – Д). Ширина полос D (~1330 см-1) и G (~1590 см-1) указывает на высокий уровень разупорядочения в структуре УНС. При этом полоса G (1590 см-1) смещена по сравнению с графитом, что является показателем малого размера частиц и согласуется с данными ПЭМ. Согласно данным ПЭМ, средние размеры частиц для фракций 5, 15 и 23 оказались равными 2,3; 1,9 и 1,1 нм соответственно. Размер частиц из фракции 38 трудно оценить из-за еще меньшего размера частиц и плохой контрастности на изображениях.
Таким образом, нами было
продемонстрировано, что ГТ синтез приводит к
получению полидисперсных УНС из ДСН с
различными люминесцентными свойствами. В
ходе исследований был разработан подход для разделения смеси наноструктур на индивидуальные фракции с использованием метода эксклюзионной хроматографии. Однако, стоит отметить существенную проблему данного типа УНС – низкие значения КВ люминесценции как для общей смеси, так и для отдельных фракций. Необходимо рассмотреть альтернативный подход для увеличения интенсивности люминесценции – использование низкомолекулярных соединений для синтеза УНС.
10
Рисунок 5. Спектры КР (А) и изображения ПЭМ для различных фракций УНС: 5 (Б), 15 (В), 23 (Г) и 38 (Д)

Глава 4 посвящена разработке
подходов к синтезу УНС на основе
низкомолекулярных соединений с
высоким КВ люминесценции. В
качестве исходных соединений для
синтеза УНС были выбраны
лимонная кислота и 1,2-
этилендиамин, так как ранее было показано, что они способны образовывать органический флуорофор ИПКК, который обеспечивает интенсивную люминесценцию УНС на их основе (рис. 6). Для синтеза УНС из ЛК и ЭДА
(мольное соотношение = 1:2) применяли метод нагрева водного раствора исходных соединений при атмосферном давлении при 100oС в течение нескольких часов, так как этот подход обеспечивает мягкие условия синтеза и позволяет контролировать физико-химические свойства реакционной смеси на каждом этапе синтеза. Все полученные образцы имели максимум люминесценции в области 450 нм при возбуждении от 300 до 400 нм, увеличение длины волны возбуждающего света (420-500 нм) приводило к смещению
полос испускания в область больших длин волн, что, вероятно, связано с полидисперсностью продукта (рис. 7Б). Более длительное нагревание (более 6
часов) приводило к потемнению реакционной смеси и сокращению интенсивности люминесценции (рис. 7В). Максимальный КВ ~ 89% был достигнут через 6 часов синтеза. При детальном исследовании люминесцентного продукта с помощью ЯМР 1Н спектроскопии было показано, что он содержит сигналы исходных соединений – ЛК (дублеты метиленовых звеньев 2.83 и 3.05 м.д.) и ЭДА (сигнал метиленовых фрагментов при 2.99 м.д.) и очень слабые сигналы ИПКК (два триплета метиленовых звеньев алифатического фрагмента – 3.79 м.д. и 4.16 м.д., сигналы протонов пиридинового кольца – 6, 01 м.д. и 6,05 м.д., уширенный синглет протона в –NH группы при 8,0 м.д.).
Рисунок 7. Спектры поглощения (А) и спектры люминесценции УНС, полученных через 6 часов синтеза (Б), значения КВ образцов (В) и их вид в УФ излучении
Рисунок 6. Схема образования ИПКК

Для большей конверсии исходных соединений в продукт и повышения выхода реакции был применен ГТ метод синтеза при температуре 200oС в течение 3 часов. Изучение различных мольных соотношений ЛК:ЭДА = 1:0,5, 1:1, 1:1,5, 1:2, 1:3, 1:4, 1:6 показало, что максимум поглощения для всех образцов наблюдался в области ~ 350 нм (рис. 8А), а максимум люминесценции располагался в области 450 нм (рис. 8Б). УНС также имели схожие значения квантовых выходов (рис. 8В), что косвенно может свидетельствовать о присутствии в структуре УНС единого люминесцентного центра. Полученные данные демонстрируют, что оптимальное соотношение ЛК:ЭДА для формирования люминесцентных продуктов находится в интервале от 1:1 до 1:2. Для дальнейшего детального изучения физико-химических свойств был выбран образец с мольным соотношением реагентов 1:1,5. Для подтверждения структуры полученного образца проводили исследование с помощью спектроскопии ЯМР 1Н и 13С (Таблица 1). В спектре ЯМР 1Н присутствуют сигналы при 3,5–2,0 м.д., которые, предположительно, коррелируют с полиамидом лимонной кислоты, а также
сигналы неидентифицированных примесей.
Таблица 1. ЯМР 1Н и 13С спектры образца с мольным соотношением 1:1,5
Рисунок 8. Оптические характеристики УНС, полученных из ЛК и ЭДА с различными мольными соотношениями: спектры поглощения (А), спектры люминесценции (Б), и значения КВ (В)
Спектр
Растворитель
δ, м.д.
3,79 (т., 2H, J = 9.1 Hz, СН2), 4,16 (т., 2H, J = 9.1 Hz, СН2), 5,94 (с., 1H, СH), 6,05 (с., 1H, СH), 7,75 (уш.с., 1H, NH)
172,48 (c., 1C, СOOH), 45,03 (c., 1C, CH2), 47,60 (c., 1C, CH2), 89,16; 105,03; 149,92; 157,15; 164, 87 (с., пиридин. кольцо)
ЯМР 1H
ЯМР 13С D2O
Для разделения смеси продуктов и установления их структуры проводили детальное исследование с использованием метода горизонтального гель- электрофореза смеси ЛК:ЭДА = 1:1,5. В результате разделения были получены 4 индивидуальные фракции образца в положительной (фр. 1-2) и отрицательной (фр. 3-4) областях (рис. 9).
Фракции 1-3 имели интенсивную коричневую окраску, в отличие от фракции 4. При возбуждении ультрафиолетовым светом (λвозб. = 365 нм) все фракции имели схожий максимум испускания в области 450 нм. Полоса 3
обладала
люминесценции,
перепоглощения
интенсивностью
соотношением
прозрачная в белом свете фракция 4 (КВ> 80%). Согласно данным ЯМР 1Н, эта фракция была идентифицирована как чистый флуорофор ИПКК. Существенным отличием фракции 4 является отсутствие зависимости положения максимума люминесценции от возбуждения, что
также характерно для молекулярного флуорофора. При этом природа коричневых частиц (фракции 1- 3) может быть охарактеризована как избыток
сложных полимерных структур на основе лимонной кислоты и этилендиамина с включением ИПКК, характеризующийся люминесценцией при 450 нм.
Так как фракция 4 представляет собой яркий органический флуорофор ИПКК, содержащий различные функциональные группы, нами были реализованы подходы для его конъюгации со вторичными кроличьими антимышиными антителами. Для создания ковалентной связи между карбоксильной группой в составе ИПКК и первичной аминогруппой в составе антитела был использован метод активированных эфиров.
В качестве линкеров для формирования амидной связи были использованы 1-этил-3-(3-диметил-амино-пропил)-карбодиимид гидрохлорид (ЭДК) и натриевая соль N-гидроксисульфосукцинимида (сульфо-ГСС). Для получения конъюгатов ИПКК со вторичными АТ подбирали оптимальные условия путем варьирования основных компонентов реакции: концентрации вторичных АТ, линкеров, времени и температуры перемешивания. Диапазоны исследуемых концентраций веществ и параметров представлены в таблице 2.
Таблица 2. Варьируемые параметры для синтеза конъюгатов ИПКК с АТ
низкой вероятно,
интенсивностью из-за эффекта Наибольшей люминесценции и заряда к массе обладала
фотонов.
Рисунок 9. Результат гель- электрофоретического разделения УНС из ЛК:ЭДА в дневном свете (А), в УФ свете (Б)
No параметра 1
3
5
Параметр
Концентрация АТ, моль/л Концентрация ЭДК, моль/л Концентрация сульфо-ГСС, моль/л Время перемешивания, час Температура перемешивания, oС
Варьируемый диапазон
2*10-5– 1*10-7 1*10-3 – 5*10-7 1*10-3 – 5*10-7 2 – 24
4, 25, 37
13

Метод горизонтального гель-электрофореза был использован для оценки связывания ИПКК со вторичными АТ. В результате исследования, установлено, что полученный конъюгат имел меньшую подвижность в геле благодаря большему отношению массы к заряду (рис 10, линия 1). Кроме того,
интенсивность люминесценции конъюгата была значительно ниже, чем интенсивность исходного флуорофора (сокращение интенсивности на ~ 65% при мольном соотношении линкеров 1:2). Флуорофор, связанный с линкерами, и свободный флуорофор имели схожую электрофоретическую подвижность (рис 10, линии 2-3). Полученные результаты
предположительно можно объяснить возможным гашением возбужденного синглетного состояния за счет присутствия в составе антител сопряженной аминокислоты триптофана посредством фотоиндуцированного переноса электронов.
Таким образом, установлено, что в результате конъюгации происходит значительное тушение люминесценции ИПКК в составе конъюгата, что существенно ограничивает возможность применения конъюгата в любых вариантах иммуноанализа.
Так как было установлено, что УНС, полученные на основе различных соединений, представляют собой сложную смесь структур, а также продемонстрированы весомые ограничения для их применения в качестве меток в иммуноанализе, то необходима разработка альтернативных систем для создания эффективных меток. В качестве таких систем были выбраны ЗНЧ, которые обладают рядом преимуществ, таких как простой синтез, высокая коллоидная стабильность, различная функционализация поверхности и превосходные оптические свойства. В главе 5 описан подход для одностадийного синтеза биотинилированных ЗНЧ, а также разработка иммунохимического анализа для количественного обнаружения СРБ в плазме крови человека как основного белка острой фазы воспаления.
Для синтеза ЗНЧ, функционализированных биотином, был разработан подход прямого восстановления тетрахлороаурата (III) водорода биотином при нагревании в щелочной среде (pН = 10). Согласно проведенным исследованиям, на данный момент в литературе не описаны подходы одностадийного синтеза функционализированных биотином ЗНЧ для их последующего применения в иммуноанализе. Для улучшения оптических свойств и стабильности ЗНЧ,
Рисунок 10. Электрофореграмма полученных образцов: 1 – конъюгат ИПКК со вторичными антителами, 2 – ИПКК с линкерами ЭДК и сульфо-ГСС в ФСБ, 3 – ИПКК в ФСБ
функционализированных биотином, мы изучили свойства продукта, полученного при различных мольных соотношениях Au:биотин – 1:2,7; 1:8 и 1:13 (где CAu3+ = 0,75 ммоль/л и Cбиотина = 2, 6 и 10 ммоль/л). Формирование ЗНЧ контролировали
за счет возникновения плазмонной полосы на спектрах поглощения и данных изображений ПЭМ (рис. 11). Более низкая концентрация биотина (2 ммоль/л, соотношение Au:биотин 1:2,7) привела к получению размытого спектра поглощения и низкой концентрации наночастиц с большим распределением по размеру 35±21 нм (рис. 11А(а), Б). Типичная полоса ППР сферических наночастиц при 526 нм появляется при соотношении Au:биотин = 1:8 (рис. 11A(б)).
Рисунок 11. (А) – Спектры поглощения ЗНЧ@биотин с различными мольными соотношениями Au:биотин: (а)- 1:2,7; (б)- 1:8; (в)- 1:13. ПЭМ-изображения ЗНЧ@биотин с мольными соотношениями Au:биотин (Б) – 1:2.7; (В) – 1:8, (Г) – 1:13
ПЭМ формирование состоящих из множества ЗНЧ небольшого размера (3,7±0,7 нм), а не отдельных наночастиц (рис. 11В). Максимальное значение оптической плотности при 521 нм было достигнуто при соотношении Au:биотин 1:13 (рис. 11(в)). Значительный избыток биотина приводил к стабилизации ЗНЧ со средним размером 9±3 нм (рис. 11Г). ЗНЧ@биотин с оптимальным соотношением 1:13 очищали с помощью двойного центрифугирования для удаления возможного избытка биотина. С целью формирования метки на основе ЗНЧ@биотин проводили их взаимодействие со стрептавидином. Разработанная метка будет обладать рядом ценных преимуществ, таких как интенсивный оптический сигнал, отсутствие трудоемких этапов конъюгации и очистки, образование устойчивого к физико-химическим воздействиям комплекса ЗНЧ@биотин:стрептавидин и возможность взаимодействия с различными биотинилированными соединениями, что делает данную метку привлекательной для иммунохимических методов. Стрептавидин представляет собой белок с тетрамерной структурой (Mw = 55 кДа), полученный из актинобактерий Streptomyces avidinii. Он может взаимодействовать с четырьмя молекулами биотина с высоким сродством. Способность ЗНЧ@биотин взаимодействовать со стрептавидином оценивали методом горизонтального гель- электрофореза. В результате эксперимента было установлено, что свободные
Изображения демонстрируют «кластеров»,

ЗНЧ@биотин и комплекс, полученный в результате взаимодействия ЗНЧ@биотин со стрептавидином, перемещались в агарозном геле с различной скоростью. Комплекс ЗНЧ@биотин:стрептавидин имел меньшую подвижность и, следовательно, большее отношение массы к заряду по сравнению с ЗНЧ@биотин. В целях повышения эффективности взаимодействия ЗНЧ@биотин со стрептавидином и формирования стабильной метки варьировали их мольные
соотношения. Были проанализированы четыре мольных соотношения ЗНЧ@биотин к стрептавидину, такие как 1:9, 1:1, 2:1 и 4:1. Избыток стрептавидина по отношению к ЗНЧ@биотин (мольное соотношение ЗНЧ@ биотин:стрептавидин = 1:9) приводил к образованию комплекса со сдвигом максимума оптической плотности до 540 нм, что указывает на сшивание между биотинилированными ЗНЧ и стрептавидином (рис. 12А). Изменение оптической плотности образовавшегося комплекса в сторону более длинных волн является результатом коллективных колебаний электронов нескольких ЗНЧ. При соотношениях ЗНЧ@биотин:стрептавидин = 1:1, 2:1 и 4:1 показан слабый сдвиг плазмонного максимума, что указывает на недостаток белка для образования стабильного комплекса с наночастицами (рис. 12А). Плотность иммобилизованных в лунках антител влияет на их способность взаимодействовать с антигеном. Чтобы контролировать плотность иммобилизации антител и избежать снижения их функциональной активности, сравнивали различные концентрации биотинилированных антител, такие как 2, 4, 8, 16, 35 и 70 мкг/мл (рис. 12Б). Антитела
иммобилизовали в лунках полистирольного микропланшета и добавляли комплексы ЗНЧ@биотин:стрептавидин с описанными выше соотношениями 1:9, 1:1, 2:1 и 4:1. Наилучший результат (наивысшая оптическая плотность) был получен для соотношения ЗНЧ@биотин:стрептавидин (1:9) и концентрации биотинилированных антител 8 мкг/мл.
Рисунок 12. (A) Нормированные спектры поглощения ЗНЧ@биотин (красный) и комплексов ЗНЧ@биотин:стрептавидин с различными мольными соотношениями: 1:9 (синий), 1:1 (зеленый), 2:1 (серый), 4:1 (оранжевый). (Б) Зависимость нормированной оптической плотности комплексов ЗНЧ@биотин:стрептавидин от концентрации АТ (n = 3)
Поскольку комплекс
ЗНЧ@биотин:стрептавидин с
мольным соотношением 1:9
продемонстрировал лучший
оптический сигнал со
специфическими антителами, мы
подробно изучили кинетику
образования комплекса и
проанализировали максимумы
поглощения
ЗНЧ@биотин:стрептавидин, их
средние размеры (методами
динамического светорассеяния и
ПЭМ), индексы
полидисперсности (ИП) и
значения ꝣ-потенциала через 0,
15, 30, 60, 90 и 120 минут
взаимодействия (рис. 13).
Средний гидродинамический
диаметр исходных ЗНЧ@биотин составлял 17 нм с ИП 0,11 ± 0,03, а ꝣ-потенциал был равен -36±7 мВ. После добавления раствора стрептавидина средний размер комплекса сразу увеличивался до 224 нм (ИП 0,33) со смещением максимума ППР до 531 нм (рис. 13А). Изображения ПЭМ демонстрируют образование комплекса ЗНЧ@биотин:стрептавидин и большой избыток стрептавидина (темные пятна вокруг образованных комплексов) (рис. 13Б). Дальнейшее увеличение времени взаимодействия приводит к увеличению размера комплексов, что отражается в смещении максимума поглощения (рис. 13А). Изображения ПЭМ подтверждают расходование свободного стрептавидина на образование более крупных агломератов, содержащих плотноупакованные ЗНЧ@биотин (рис.13Б, В, Г). После 60 минут взаимодействия образовывались комплексы размером ~ 1 мкм и ƺ-потенциалом -9±2 мВ (рис. 13А). Вероятно, стрептавидин блокирует все доступные молекулы биотина и ограничивает дальнейший процесс образования комплекса. Время образования комплекса не должно превышать один час для сохранения свободных биотин-связывающих сайтов стрептавидина для связывания с биотинилированными антителами в анализе. Разработанная метка была применена для детектирования СРБ в плазме крови человека иммунохимическим методом. СРБ является одним из основных белков острой фазы, концентрация которого быстро увеличивается в ответ на травму, воспаление или инфекцию, поэтому он широко применяется в качестве маркера.
Рисунок 13. (А) Зависимость размера (синие столбцы) и положения максимумов поглощения (оранжевые точки) от времени образования комплекса. ПЭМ-изображения комплексов ЗНЧ@биотин:стрептавидин после различного времени взаимодействия (мин): (Б) – 0, (В) – 15, (Г) – 60
Он представляет собой пентамерный белок, который состоит из пяти нековалентно связанных и негликозилированных идентичных субъединиц по 206 аминокислот в каждой, которые образуют дискообразный пятиугольник. Для разработки иммунохимического анализа был выбран «сэндвич» формат иммуноанализа, который обеспечивает определение высокомолекулярных антигенов с высокой чувствительностью и специфичностью. Данный формат включает пару специфических антител к пространственно удаленным эпитопам исследуемого антигена, различные концентрации СРБ, а также разработанную метку на основе ЗНЧ@биотин:стрептавидин (рис. 14).
Рисунок 14. Схематическое изображение разработанного иммуноанализа для обнаружения СРБ
В результате анализа появление характерной розовой окраски ЗНЧ@биотин свидетельствует о присутствии аналита в пробе. Интенсивность окрашивания характеризует количество антигена (СРБ) в образце. Оптимизацию данного анализа с целью улучшения аналитических характеристик проводили путем варьирования различных параметров: концентрации покровных АТ, буферов для иммобилизации АТ, блокировочных агентов и промывок микропланшета, концентрации детекторных биотинилированных АТ, мольного соотношения компонентов метки и времени инкубации (Таблица 3).
18

Таблица 3. Варьируемые и оптимальные параметры иммунохроматографического анализа
для проведения
Оптимальный параметр
БСА 0,5%
ФСБ+0.1% Твин 20
8 1:9
1 2
4
5 6 7
Параметр
Концентрация покровных антител, мкг/мл
Блокирующий буфер
Промывающий буфер
Концентрация детекторных антител, мкг/мл
Мольное соотношение ЗНЧ@биотин:стрептавидин
Время инкубации метки, мин
Варьируемый показатель
2, 4, 8, 16, 35, 70
Казеин 0,5-3% БСА 0,5-3% ПЭГ-ОН 1-3% ФСБ
ФСБ + 0.05% Твин 20 ФСБ+0.1% Твин 20
8, 10, 15
1:9, 1:1, 2:1, 4:1
0, 15, 30, 60
Буфер для иммобилизации покровных антител
ФСБ (pH = 7,2), ФСБ+NaCl (pH = 7,3), ФСБ+БСА (pH = 7,3), ББ (pH = 9,7)
ФСБ (рН 7.2)
В соответствии с разработанными оптимальными параметрами проводили определение СРБ в буферном растворе ФСБ (рН = 7,2) с использованием различных концентраций СРБ (1, 3, 10, 30, 100, 300 и 1000 нг/мл). Результаты определения приведены на рисунке 15. Как видно из полученных данных, линейный диапазон определения составляет от 3 до 100 нг/мл.
Предел обнаружения (ПО) для разработанного анализа составляет 1,5 нг/мл. Разработанный иммунохимический анализ был апробирован на образцах плазмы крови
Рисунок 15. Калибровочная кривая и соответствующий линейный диапазон (вставка сверху) обнаружения CРБ в буфере ФСБ (pH=7.2) (n = 3)
человека (рис. 16). Для этого в образцы плазмы крови вносили стандартные растворы СРБ с получением конечных концентраций аналита 1, 3, 10, 30, 100, 300 и 1000 нг/мл. Неразбавленная плазма крови приводит к сильному матричному эффекту и нечетким оптическим сигналам. Чтобы уменьшить матричный эффект, плазму разбавляли в 2, 4, 10, 50 и 100 раз. Отсутствие матричных эффектов достигали при 50-кратном и 100-кратном разбавлении.
Введено СРБ, нг/мл
Найдено СРБ, нг/мл Sr
Меньшие разбавления (2, 4 и 10 раз) приводили к высоким неспецифическим сигналам (рис. 16). При оптимальном разбавлении плазмы крови 1/50 ПО составлял 1,2 нг/мл, а предел количественного
Линейный аналогично растворе, составил 3-100 нг/мл. В таблице 4 систематизированы данные по определению
определения динамический определению
– 3,9 нг/мл. диапазон,
в стандартном СРБ разработанным методом.
Рисунок 16. Калибровочные кривые и соответствующие линейные диапазоны (вставка сверху) обнаружения CРБ в плазме крови, разбавленной в: 10 (серый), 50 (оранжевый) и 100 (синий) раз (n = 3)
Таблица 4. Иммунохимическое определение СРБ в образцах плазмы крови человека методом «введено-найдено»
1 1,05±0,08
3 3,30±0,32 10 10,6±0,74 30 31,4±2,7
100 103±5
300 310±13 1000 1049±56
0,07 0,09 0,07 0,08
0,05 0,04 0,05
Селективность иммунохимического
измерения перекрестной реактивности с другими белками острой фазы воспаления: прокальцитонином (ПКТ) и сывороточным амилоидом А (САА1). В результате эксперимента показано, что не происходит неспецифического взаимодействия антител против СРБ с ПКТ и CAA1, что подтверждает отсутствие перекрестной реактивности.
Таким образом, разработан одностадийный метод получения функционализированных биотином ЗНЧ, а также проведена оптимизация методики синтеза с целью получения наночастиц, обладающих высокой стабильностью и функционалом биотина. Показана эффективность взаимодействия ЗНЧ@биотин со стрептавидином и моноклональными биотинилированными антителами против СРБ посредством нековалентного взаимодействия. Проведена работа по разработке иммунохимического метода определения СРБ в плазме крови человека, который соответствует современным тенденциям аналитической и клинической практики для определения хронических уровней СРБ в плазме крови человека с целью мониторинга течения воспалительного процесса.
анализа
подтверждали
путем

ЗАКЛЮЧЕНИЕ
1. Разработаны одностадийные подходы к получению люминесцентных меток на основе декстран сульфата натрия, лимонной кислоты, а также плазмонных меток на основе модифицированных биотином и стрептавидином наночастиц золота, изучены закономерности их свойств, продемонстрирована возможность практического применения метки на основе биотинилированных наночастиц золота и стрептавидина в иммуноанализе для определения маркера воспаления – С-реактивного белка человека.
2. Синтезированы углеродные наноструктуры на основе декстран сульфата натрия, лимонной кислоты и 1,2-этилендиамина методами нагревания при атмосферном и повышенном давлении в автоклаве. Установлены закономерности изменения их свойств, показано влияние времени и температуры синтеза, мольных соотношений реагентов на люминесцентные свойства.
3. Продемонстрированы подходы тонкого разделения смесей углеродных наноструктур на дискретные компоненты по размеру и соотношению массы к заряду. Методом эксклюзионной хроматографии из гидротермально обработанного декстран сульфата натрия выделены компоненты с различными оптическими характеристиками. Определены условия гель- электрофоретического разделения люминесцентных продуктов из лимонной кислоты и 1,2–этилендиамина, выделен флуорофор 5-оксо-1,2,3,5- тетрагидроимидазо[1,2-α]пиридин-7-карбоновая кислота, обладающий КВ более 80%. Изучены возможности и ограничения конъюгации флуорофора с антителами. Показано, что конъюгирование приводит к значительному снижению люминесценции флуорофора.
4. Разработан новый одноэтапный метод синтеза биофункционализированных биотином наночастиц золота. Установлены оптимальные условия получения яркой, стабильной метки на основе функционализированных биотином наночастиц золота и стрептавидина: мольное соотношение Au:биотин – 1:13, ЗНЧ@биотин:стрептавидин – 1:9. Показано, что размер и функционал метки может быть легко настроен путем варьирования условий инкубации компонентов.
5. Показана возможность количественного определения СРБ человека иммунохимическим методом с использованием метки на основе функционализированных биотином наночастиц золота и стрептавидина. Успешно проведена апробация метода на образцах плазмы крови человека. Установлено, что разбавление плазмы крови в 50 раз нивелирует матричный эффект. Разработанный анализ характеризовался пределом обнаружения 1,2 нг/мл, что соответствует современным тенденциям аналитической и клинической практики для определения хронических уровней СРБ.