Оценка иммуногистологических маркеров воспалительной деструкции эндопериодонтального комплекса

С целью повышения эффективности диагностических мероприятий при
воспалительной деструкции эндопериодонтального комплекса было проведено
иммуногистохимическое исследование образцов пульпы зуба, извлеченных при
плановомстоматологическомвмешательстве.Внаучномисследовании
используются следующие иммуногистохимические маркеры: CD-31, CD-57, CD-
68, CD-138, VEGF, коллаген IV типа. Выбор этой группы ИГХ-маркеров для
проведения настоящего исследования обусловлен их антигенной специфичностью
в отношении процесса воспаления, в том числе с элементами деструкции. Интерес
представляло выявление позитивных клеток, вовлекаемых в иммунный процесс
при развитии воспаления, а также уровень их экспрессии. Дифференцирование
иммунных клеток основывалось на использовании моноклональных антител.
Было проведено обследование 90 пациентов (43 мужчин и 47 женщин в возрасте
18–59лет),обратившихсявАУ«Республиканскаястоматологическая
поликлиника» Минздрава Чувашии с целью лечения в плановом порядке и
поделенных на 3 группы после получения их информированного согласия: 1-я
гpyппa – интaктнaя, включaeт пaциeнтoв, кoтopым пpoвoдилacь экстирпация
пульпы зубов по протетическим показаниям, тo еcть пpи oбpaщeнии пaциeнтoв
дaннoй гpyппы на плановое эндодонтическое вмешательство для подготовки
необходимых зубов к дальнейшему рациональному протезированию, и которые
не предъявляли жалоб на боли и дискомфорт в зубах, подлежащих исследованию
(n = 30); 2-я группа – контрольная, включает пациентов, которым проводилась
экстирпация пульпы зубов с выявленным хроническим пульпитом при их
обращении с жалобами либо при выявлении данной патологии на плановом
осмотре (К04.03) (n = 30); 3-я группа – сравнения, включает пациентов, которым
проводили забор пульпарного биоптата с частично сохраненной пульпой
многокорневых зубов с выявленным хроническим апикальным периодонтитом и
наличием синус-тракта, обратившихся с впервые возникшими жалобами на
данную патологию, ранее не имевших данной патологии исследуемых зубов,
направленных от смежных специалистов либо с выявлением ее на плановом
осмотре (К04.6) (n = 30). Исследовались лица молодого и среднего возраста от 18
до 59 лет, без сопутствующей фоновой соматической патологии, относящиеся к
трудоспособному населению, которым необходимо сохранение режима трудовой
деятельности. Градация пациентов по возрасту и включение групп (молодой и
средний возраст) связаны с тем, что по классификации Всемирной организации
здравоохранения (ВОЗ) это трудоспособное население, нарушение здоровья
которого нежелательно. Интерес представляли иммуногистологические маркеры
воспалительной деструкции эндопериодонтального комплекса, оценка которых
проводилась на основании морфологического исследования и морфометрического
анализа состояния ткани пульпы зубов, экстирпированной из корневых каналов
зубов клинических групп пациентов. Обследование пациента является одним из
основных этапов диагностического процесса. Для своевременной и правильной
постановкидиагнозанеобходимобылопридерживатьсячеткой
последовательности клинического обследования.
Целью проведения обследования являлось выявление любых отклонений от
нормы, постановка правильного диагноза с дальнейшим назначением адекватного
лечения. Обследование проводили по стандартной методике, которая включала
основные и дополнительные методы обследования – сбор анамнеза, объективное
обследование (осмотр, перкуссия, зондирование, пальпация). Использовали
методы оценки пародонтального статуса – индекс кровоточивости десны по
Мюллеману – Коуэллу и индекс РМА (папиллярно-маргинально-альвеолярный) в
модификации Parma.В качестведополнительных методов обследования
применялась термодиагностика, электроодонтодиагностика и лучевые методы
исследования: 2D-система визуализации, фистулография (лучевая диагностика с
введенным контрастным веществом, чаще всего гуттаперчевым штифтом, в
свищевой ход) при наличии открытого свищевого хода с целью определения
точной локализации патологического очага, конусно-лучевая компьютерная
томография (КЛКТ), или 3D-визуализация. В последующем морфологическом
исследовании использовался биоптат (экстирпат) пульпы из корневых каналов
зубов пациентов, из которого делались срезы с дальнейшим окрашиванием
гистологическими красителями, в частности гематоксилином и эозином, для
дальнейшей подготовки к иммуногистологическому исследованию (Рисунок 1).

Рисунок 1 – Pacклaдкa и oкpacкa гeмaтoкcилин-эoзинoм oбpазцoв пyльпы

Иммуногистологическое исследование выполнялось в соответствии со
стандартными протоколами. В качестве контроля на чувствительность и
специфичностьреагированияприменяласьнeиммyнизиpoвaннaякpoличья
cывopoткa (Рисунок 2).
Рисунок 2 – Гoтoвыe пapaфинoвыe блoки и микpoпpeпapaты oбpaзцoв пyльпы
c пpoвeдeнным иccлeдoвaниeм нa мapкepы

У всех пациентов из 3-й группы (группа сравнения) с диагнозом хронический
гранулирующий периодонтит был выявлен свищевой ход (Рисунок 3).

Рисунок 3 – Выявление и зондирование свищевого хода зуба 3.6
Проведениефистулографииосуществлялосьдляконкретизации
локализации деструктивного очага воспаления в периодонте. Данный способ
применяли при отказе пациента от проведения КЛКТ-исследования (Рисунок 4).

Рисунок 4 – Фистулография зуба 1.2 с помощью гуттаперчевого штифта

Цифpoвыe изoбpaжeния микpoпpeпapaтoв пульпы пoлyчeны с применением
системы архивирования на базе микроскопа Leica DM4000B с использованием
цветной фотокамеры Leica DFC 425 и лицензионной программы Leica Application
Sute 3.6.0. Микрофотографии для проведения морфометрических измерений были
получены при увеличениях ×200 и ×400 с обязательным обозначением
градуировочной шкалы на каждом снимке (Рисунок 5).
Рисунок 5 – Иммуногистохимический метод выявления маркера CD-31.
Пульпа зуба. Пульпит. Микроскоп Leica DM4000B. Увеличение ×400

Линейные морфометрические измерения выполнены с использованием
лицензионнойпрограммыLeicaApplicationSute3.6.0.Количественные
показателиинтенсивностиядернойИГХ-реакцииполученыподсчетом
соотношения количества окрашенных ядер к количеству не подвергшихся окраске
и переведением выясненных значений в процентное число. Морфометрические
показатели интенсивной мембранной и цитоплазматической ИГХ-реакций в
количественномсоотношениивыполненысприменениемлицензионной
программы «Микро-Анализ», а также демоверсии программы Sigma Scan Pro.
Площадь покрытия ИГХ-реакции мембран и цитоплазмы оценивали методиками
автоматического выявления и подсчитывания площади цветового спектра
(окрашенного DAB), вызывающего исследовательский интерес, в соотношении к
площади самого изображения с переводом в процентное число. Каждый срез
измеряли не менее чем в трех полях зрения, учитывая малый размер самих
образцов. При обнаружении незначительного числа клеточных единиц, дающих
цитоплазматическую или мембранную окраску, применяли методику их подсчета
в трех интересующих полях зрения с визуализацией при увеличении ×400.
ЛабораторноеисследованиепроводилосьнабазеАУ«Республиканский
клинический онкологический диспансер» МЗ ЧР г. Чебоксары под руководством
заведующего патологоанатомическим отделением, доктора медицинских наук
Москвичева Евгения Васильевича.
Статистическую обработку полученных данных проводили методиками
параметрического и непараметрического анализов. Применяли классические
показатели, используемые в описательной статистике: чиcлo нaблюдeний (n),
cpeднee apифмeтичecкoe (M), cтaндapтнoe oтклoнeниe (σ). Для описания выборки
использовали также медиану (Ме), 10 и 90 процентили наблюдения – Ме{10-90}.
Статистическую значимость различий в исследовании определяли по критерию
Стьюдента (t), малый объем выборки либо неправильное распределение
требовали использования непараметрического критерия Манна – Уитни (рm-u).
Для оценки различий при применении качественных признаков использовали
«критерий χ2» и «критерий Фишера» точной достоверности. Вероятную
погрешность обозначали символом «p». Статистическая значимость различий
между выборками принималась при показателях p≤0,05, p≤0,01, p≤0,001.
Необходимость корреляционного анализа определяли степенью зависимости
между исследуемыми показателями и ее направленностью. Для качественного
статистического анализа было необходимо применение коэффициента линейной
корреляции по Пирсону (r), а при неправильном характере распределения или
маломчисленаблюденийвычисляликоэффициентнепараметрической
корреляции по Спирману (rS). Статистическая значимость этих коэффициентов
корреляции принималась как допустимая при p≤0,05. Согласно шкале Чеддока,
связь менее 0,3 считали слабой, 0,3–0,7 – средней силы, более 0,7 – сильной.
Статистическуюобработкуполученныхданныхвыполнялина
персональном компьютере с использованием специализированных программ по
статистике в средах Exel 97.0 и Statistica for Windows 6.0, являющихся
программным продуктом компании StatSoft, США.
Заключение
В очаге воспаления при наличии хронического процесса отмечается
усиление клеточной иммунной реакции, тесная взаимосвязь между воспалением и
механизмомиммуногистологическойзащиты.Воспалительныйпроцесс
провоцирует характерную реакцию ткани пульпы на повреждение, далее
происходит привлечение специальных клеток при проникновении патогенных
факторов в эндодонт, ликвидация патогенов и поврежденных клеток, локализация
очага от неповрежденной ткани для минимизации распространения инфекции и
дальнейшее восстановление очага деструкции. Нарушение или блокировка
любого из этих этапов неизбежно приведет к хронизации воспалительного
процесса. Соответственно, логично говорить о том, что иммуногистологические
механизмыиграютведущуюрольвразвитиивоспаления.Приэтом
иммуногистологическим критерием развития патологического процесса будет
являться показатель четкой взаимосвязи между развитием воспаления в пульпе и
изменением локализации NK-клеток, что подтверждает иммунный характер
воспалительной реакции.
На основании полученных результатов можно утверждать, что на
современномуровнеразвитияморфологическихисследований
иммуногистологический раздел представляет собой исчерпывающий, логично
выстроенныйсимбиозморфологическойдиагностикиихарактеристики
иммунозаинтересованныхклеточныхпопуляцийиопосредованныхими
патологическихпроцессов.ИспользованиерезультатовИГХ-маркерной
диагностикивстоматологииявляетсяперспективнымвпрактической
деятельности при лечении воспалительных процессов с первичным поражением
пульпы. Для эффективной уточненной диагностики воспалительной деструкции
эндопериодонтального комплекса на морфологическом уровне врач-стоматолог
долженвладетьпредставлениямиобиммуногистологическомразделе
этиопатогенеза и методах соответствующего обследования пациентов.
Выводы
1. При пульпите и периодонтите выявлено достоверное увеличение (в 2
раза, р≤0,001) количества CD-31+ клеток, чтообусловливает выраженные
сосудистые изменения – полнокровие, эктазию с количественным увеличением и
уменьшением сосудов микроциркуляторного русла соответственно; достоверное
повышение (в 2 раза, р≤0,001) содержания CD57+ клеток при пульпите,
максимально выраженное увеличение (в 3 раза, р≤0,001) при периодонтите с
изменением их нормального расположения и скоплением в зоне лимфоцитарных
инфильтратов при периодонтите; достоверное увеличение содержания CD-68+
клеток при пульпите (в 5 раз, р≤0,001) с диффузным расположением среди
фибробластов стромы, достоверное уменьшение CD-68+ клеток при периодонтите
(в 5 раз, р≤0,001) с фиброзированием ткани пульпы; появление и значительное
увеличение CD-138+ клеток при периодонтите (в 5 раз, р≤0,001), что
обусловливает прогрессирование воспалительного процесса с акцентом на
пролиферацию; достоверное повышение (в 3 раза, p≤0,001) содержания VEGF+
клеток при пульпите и снижение их количества (в 3 раза, p≤0,001) при
периодонтите, что является ранним признаком фиброзирования и структурно-
функциональной деградации сосудистого русла; значительное повышение (в 2
раза, р≤0,001) содержания коллагена IV типа при периодонтите, что является
признаком усиления фиброзирования.
2. Установлена прямая сильная корреляционная связь (r = +0,87, p≤0,05)
иммуногистологических и клинических маркеров при хроническом воспалении
структур эндопериодонтального комплекса с первичным поражением пульпы:
уровень экспрессии сочетается с характерными показателями индексов РМА и
Мюллемана – Коуэлла клинически (1,1–1,3 и 25–28% соответственно).
3. При пульпите морфологически сосуды пульпы синусоидного типа,
эктазированы, строма отечная (p≤0,05); дискретное расположение NK-клеток
среди клеток стромы без формирований периваскулярных скоплений (p≤0,05);
увеличение числа макрофагов, характерное диффузное расположение макрофагов
средифибробластовстромы(p≤0,05);периваскулярноерасположение
плазматических клеток (p≤0,05); позитивная цитоплазматическая реакция клеток
стромы к VEGF с их равномерным расположением в виде скоплений в количестве
5–10 (p≤0,05); размытие контура базальной мембраны сосудов и значительное
утолщение их стенок, увеличение общего количества капилляров с существенным
увеличением числа макрофагов (p≤0,05) при выраженной воспалительной
инфильтрации. Для периодонтита характерно выраженное полнокровие и эктазия
кровеносных сосудов, наличие CD-31-положительных клеток среди фибробластов
стромы (p≤0,05); увеличение количества NK-клеток без периваскулярного
расположения (p≤0,05); уменьшение числа макрофагов и общее снижение
клеточных элементов пульпы и ее фиброзирование (p≤0,05); накопление
плазматических клеток в строме (p≤0,05); снижение количества VEGF-
позитивных клеток, уменьшение реакции клеток эндотелия сосудов (p≤0,05);
увеличение фиброзирования пульпы, снижение клеточного рисунка, уменьшение
количества макрофагов, рост числа и выявление значительного утолщения стенок
капилляров (p≤0,05). Выявлено общее уменьшение клеточной составляющей на
фоневозникновенияначальныхочаговбесструктурногораспада,что
подтверждает наличие хронического воспалительного процесса.
4.Иммуногистологическимипризнакамиразвитияхронического
воспаления структур эндопериодонтального комплекса с первичным поражением
пульпы являютсяпоказатели: плазматическиеклетки пульпы достигают
максимального количества с появлением признаков деструкции эндопериодонта;
эндотелиальные клетки микрососудов пульпы являются ранним предиктором
микроциркуляторных нарушений с достижением максимального количества при
пульпите и снижением (в 3 раза) при периодонтите; развитие воспалительного
процесса в пульпе характеризуется значительным увеличением (в 2,5 раза)
толщиныстенокмикроциркуляторногоруслаидеградациисосудистой
организации (в 3 раза) при развитии признаков деструкции; увеличение числа
макрофагов наблюдается при поражении пульпы, снижение до минимума – при
вовлечениипериодонта;увеличениеколичестваNK-клетокпульпы
регистрируется с нарастанием воспалительного процесса, достижение максимума
указывает на появление признаков деструкции;увеличение числа сосудов
микроциркуляторного русла пульпы при нарастании воспалительного процесса
указывает на компенсаторный механизм реакции сосудов на воспаление,
последующее снижение – на возникновение деструктивных процессов и
появление признаков фиброза.

Практические рекомендации
1.Полученнаяморфологическаяиммуногистологическаяоценка
воспалительного процесса в пульпе будет полезна врачам-стоматологам в
качестве теоретического пособия, что даст информацию об углубленном
понимании характера, длительности и течения воспалительного процесса.
2. Необходимо осуществлять курацию пациентов с деструктивными
изменениямивпериапикальнойобластисобязательнымсоблюдением
отдаленных сроков динамического наблюдения – 48 месяцев. Это срок,
необходимый для составления исчерпывающего представления об успешности
проведенного эндодонтического лечения с учетом последовательности развития
доказанных иммунных клеточных реакций.
3. Опираться при оценке развития и прогноза воспалительного процесса
эндопериодонтальногокомплексанавыявленныеиммуногистологические
признаки.
4. Использовать результаты исследования для формирования представления
обиммунологическомлокальномответепривоспалительномпроцессе
эндопериодонтального комплекса пульпарного происхождения.

Перспективы дальнейшей разработки темы
Полученныерезультатымогутспособствоватьповышениюуровня
диагностики осложнений кариеса на ранних стадиях с формированием глубокого
понимания развития патологических процессов на тонком гистологическом
уровне во избежание превращения врачебных манипуляций исключительно в
рутинную процедуру. Представляется целесообразным продолжить исследования
в данном направлении по следующим параметрам: изучить процесс воспаления
эндопериодонтапосредствоманализаработыинойгруппы
иммуногистохимических маркеров; провести исследование уже использованных в
научном исследовании маркеров непосредственно в тканях периодонта.