Определение холестерина в пищевых продуктах и биологических объектах методом вольтамперометрии
СОДЕРЖАНИЕ …………………………………………………………………………………………… 2
УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ……………………………………….. 6
ВВЕДЕНИЕ …………………………………………………………………………………………………. 7
ГЛАВА 1. Литературный обзор ………………………………………………………………….. 15
1.1 Биологическая роль холестерина в организме человека…………………………. 15
1.2 Биологический синтез холестерина: стадии и регуляция ……………………….. 19
1.3 Физические и химические свойства холестерина…………………………………… 24
1.4 Методы определения холестерина ………………………………………………………… 27
1.4.1 Спектрофотометрические и колориметрические методики определения
холестерина ……………………………………………………………………………………………….. 27
1.4.2 Флуориметрические методики определения холестерина……………………. 30
1.4.3 Хроматографические методики определения холестерина ………………….. 31
1.4.4 Ферментативные методики определения холестерина ………………………… 34
1.4.5 Электрохимические методики определения холестерина ……………………. 38
1.4.5.1 Применение биосенсоров ………………………………………………………………… 38
1.4.5.2 Применение модифицированных электродов …………………………………… 49
ГЛАВА 2. АППАРАТУРА И МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА …………………… 55
2.1 Оборудование, ячейка, электроды и растворы……………………………………….. 55
2.2. Объекты исследования ………………………………………………………………………… 65
2.3.Методика эксперимента ……………………………………………………………………….. 66
2.3. 1 Вольтамперометрическая методика определения холестерина на
поверхности электрода с иммобилизованными ферментами ……………………….. 66
2.3.2 Вольтамперометрическая методика определения холестерина на
поверхности модифицированного электрода ………………………………………………. 68
2.3.3 Спектрофотометрическая методика определения холестерина с
треххлористым железом …………………………………………………………………………….. 69
2.3.4 Методика проведения микроскопических исследований поверхности
электродов …………………………………………………………………………………………………. 69
2.3.5. Методика проведения ИК-спектроскопических исследований
поверхности электродов …………………………………………………………………………….. 70
ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ
ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ ОКИСЛЕНИЯ ХОЛЕСТЕРИНА НА ФЕРМЕНТНОМ
ЭЛЕКТРОДЕ ……………………………………………………………………………………………… 72
3.1. Влияние различных факторов на аналитический сигнал окисления
холестерина на ферментном электроде ………………………………………………………. 72
3.1.1. Влияние материала индикаторного электрода на аналитический сигнал
окисления холестерина на ферментном электроде………………………………………. 73
3.1.2 Влияние природы фонового электролита на аналитический сигнал …….. 75
3.1.3. Влияние рН фонового электролита на аналитический сигнал …………….. 77
3.1.4 Расчет кинетических параметров ферментативной реакции ………………… 78
3.1.5 Влияние компонентов матрицы пробы на аналитический сигнал
электровосстановления перекиси водорода как продукта ферментативного
окисления холестерина ………………………………………………………………………………. 82
3.2 Исследование морфологии электродной поверхности …………………………… 84
ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ
ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ РЕАКЦИИ ОКИСЛЕНИЯ ХОЛЕСТЕРИНА НА ХМЭ
………………………………………………………………………………………………………………….. 87
4.1. Влияние различных факторов на аналитический сигнал окисления
холестерина на ХМЭ ………………………………………………………………………………….. 89
4.1.1. Влияние материала подложки ХМЭ на аналитический сигнал окисления
холестерина ……………………………………………………………………………………………….. 89
4.1.2 Влияние природы фонового электролита на сигнал электроокисления
холестерина на ХМЭ ………………………………………………………………………………….. 92
4.1.3. Влияние рН фонового электролита на сигнал окисления холестерина на
ХМЭ ………………………………………………………………………………………………………….. 94
4.1.4. Влияние параметров электролиза (время и потенциал электролиза) на
сигнал окисления холестерина на ХМЭ ……………………………………………………… 97
4.1.5 Влияние компонентов матрицы пробы на аналитический сигнал
окисления холестерина на ХМЭ …………………………………………………………………. 99
4.2 Расчет параметров электродного процесса ………………………………………….. 101
4.3 Исследование физико-химических закономерностей протекания реакции
окисления холестерина на химически модифицированном электроде ……….. 103
4.4 Исследование морфологии электродной поверхности …………………………. 108
ГЛАВА 5. МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ
ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКОЙ МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ХОЛЕСТЕРИНА В ПРОДУКЦИИ ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ И
БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ НА ХМЭ ……………………………………………… 115
Глава 5.1. Разработка вольтамперометрической методики определения
содержания холестерина в продукции пищевой промышленности и
биологических объектах …………………………………………………………………………… 115
5.1.1. Методика выполнения измерений количественного содержания
холестерина в продуктах пищевой промышленности и биообхектах …………. 120
5.1.2. Подготовка вольтамперометрической методики определения
холестерина к метрологической аттестации ……………………………………………… 123
5.2. Определение содержания холестерина в пищевых продуктах и
биологических объектах объектах методами вольтамперометрии и
спектрофотометрии. Сравнительный анализ. ……………………………………………. 126
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ ………………………………………………. 131
Список литературы ………………………………………………………………………………….. 137
Приложение 1 ………………………………………………………………………………………….. 153
УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ
ВОЗ – всемирная организация здравоохранения
ССЗ – сердечно-сосудистые заболевания
СЛОС – синдром Сита-Лемли-Опитца
ХМЭ – химически модифицированный электрод
ХСЭ – хлоридсеребряный электрод
СУЭ – стеклоуглеродный электрод
ГЭ – графитовый электрод
КЭ – композитный углеродсодержащий электрод с обновляемой поверхность
ПВД – полиэтилен высокого давления
ПХ – пероксидазха хрена
ХО – холестерол оксидаза
ДАГУДФК – 2,6-диацетил-2,4,6,8-тетраазабицикло[3.3.0]октан-3,7-дион-
дифосфоновая кислота
ФАД – флавинадениннуклеотид
БАС – биологически активные соединения
ИК – инфракрасный
ДМСО – диметилсульфоксид
ТДАС – трифторид диэтиламиносеры
ТМОС – тетраметоксисилан
ТЕОС – тетраэтоксисилан
ЕС – механизм, включающий электрохимическую реакцию и последующую
химическую реакцию
Актуальность работы. По статистике Всемирной Организации
Здравоохранения (ВОЗ) сердечно сосудистые заболевания (ССЗ)
представляют собой основную причину смертности во всем мире. В
частности, в 2008 году от сердечно сосудистых заболеваний умерло 17,3
миллиона человек, среди которых 7,3 миллиона человек умерло от
ишемической болезни сердца и 6,2 миллиона по причине инсульта. По
прогнозам специалистов ВОЗ к 2030 году около 23,3 миллионов человек
могут умереть от ССЗ [1]. Также прогнозируется, что к 2030 году ССЗ
останутся единственной причиной смерти от неинфекционных заболеваний.
Одним из методов предотвращения большинства ССЗ является снижением
повышенного уровня липидов. Не смотря на то, что холестерин
вырабатывается организмом человека, значительное его количество
поступает с пищей. Поэтому, контроль содержания холестерина в крови
человека и продуктах питания очень важен для профилактики и терапии ССЗ.
Согласно рекомендациям Российского кардиологического общества от 2012
года, одним из важнейших параметров в определении риска сердечно-
сосудистых заболеваний (ССЗ) является определение биохимических
маркеров атеросклероза. Для оценки уровня риска развития ССЗ применяется
шкала SCORE (Systemic Coronary Risk Evaluation) [2]. Указанная шкала
применяется в странах с высоким уровнем смертности от ССЗ (куда
относится РФ) и включает в себя, в качестве одного из ключевых параметров,
содержание общего холестерина в крови пациента.
Кроме того, по данным Американской ассоциации сердечных
заболеваний в 85% случаев при диагностике ишемической болезни,
гипертензии, атеросклероза и тромбоза одним из важнейших показателей
наличия заболеваемости являлся повышенный уровень свободного и
эстерифицированного холестерина.
В современных медицинских учреждениях существует достаточно
богатая диагностическая база, разрабатываются и внедряются новые приборы
и методы анализа биообъектов. Однако, сердечно сосудистые заболевания
относятся к такой группе заболеваний, при которых зачастую происходят
внезапные случаи поражения сосудов, что приводит к смерти даже молодых
людей.
В связи со всем вышеизложенным, разработка новых экспрессных тест-
систем для определения холестерина как в биологических жидкостях
человека, так и в продуктах питания обладает высокой актуальностью. В
свою очередь необходимость создания портативных тест-систем требует,
прежде всего, изучения физико-химических основ методик определения
холестерина. В настоящее время существует достаточно много работ по
электрохимическому определению холестерина с использованием
биосенсоров, в основе которых лежит реакция окисления холестерина на
поверхности электрода, модифицированного ферментами (холиноксидаза,
пероксидаза хрена). Использование ферментов несомненно имеет ряд
преимуществ (высокая селективность, чувствительность), но и ряд
недостатков (нестабильность ферментов во времени, их высокая стоимость).
Поэтому разработка новых неферментативных способов определения
холестерина как в биологических объектах, так и в пищевых продуктах
является актуальной задачей.
Цель работы. Исследовать физико-химические закономерности
окисления холестерина с целью разработки методик его количественного
определения в продукции пищевой промышленности и биологических
объектах.
В соответствии с этим в работе поставлены следующие задачи:
1. Исследовать влияние азагетероциклического соединения ряда
бисмочевин на процесс электрохимического окисления холестерина.
2. Исследовать природу сигнала и физико-химические
закономерности окисления холестерина на электроде, модифицированном
азагетероциклическим соединением ряда бисмочевин.
3. Исследовать влияние различных факторов на процесс
электрохимического окисления холестерина (природа фонового электролита,
рН раствора, материал электрода).
4. Разработать неферментативный способ определения холестерина
на электроде, модифицированном азагетероциклическим соединением ряда
бисмочевин
5. Провести сравнительные определения содержания холестерина в
продукции пищевой промышленности и биологических объектах, используя
разработанный биосенсор, ХМЭ и арбитражный метод сравнения
(спектрофотометрический).
Помогаем с подготовкой сопроводительных документов
Хочешь уникальную работу?
Больше 3 000 экспертов уже готовы начать работу над твоим проектом!
4.9 (826 отзывов)
5 (18 отзывов)
4.5 (9 отзывов)
4.7 (82 отзыва)
4.7 (18 отзывов)
4.2 (25 отзывов)
4.6 (30 отзывов)
5 (49 отзывов)
5 (20 отзывов)
