Определение холестерина в пищевых продуктах и биологических объектах методом вольтамперометрии

СОДЕРЖАНИЕ …………………………………………………………………………………………… 2

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ……………………………………….. 6

ВВЕДЕНИЕ …………………………………………………………………………………………………. 7

ГЛАВА 1. Литературный обзор ………………………………………………………………….. 15

1.1 Биологическая роль холестерина в организме человека…………………………. 15

1.2 Биологический синтез холестерина: стадии и регуляция ……………………….. 19

1.3 Физические и химические свойства холестерина…………………………………… 24

1.4 Методы определения холестерина ………………………………………………………… 27

1.4.1 Спектрофотометрические и колориметрические методики определения
холестерина ……………………………………………………………………………………………….. 27

1.4.2 Флуориметрические методики определения холестерина……………………. 30

1.4.3 Хроматографические методики определения холестерина ………………….. 31

1.4.4 Ферментативные методики определения холестерина ………………………… 34

1.4.5 Электрохимические методики определения холестерина ……………………. 38

1.4.5.1 Применение биосенсоров ………………………………………………………………… 38

1.4.5.2 Применение модифицированных электродов …………………………………… 49

ГЛАВА 2. АППАРАТУРА И МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА …………………… 55

2.1 Оборудование, ячейка, электроды и растворы……………………………………….. 55

2.2. Объекты исследования ………………………………………………………………………… 65

2.3.Методика эксперимента ……………………………………………………………………….. 66

2.3. 1 Вольтамперометрическая методика определения холестерина на
поверхности электрода с иммобилизованными ферментами ……………………….. 66
2.3.2 Вольтамперометрическая методика определения холестерина на
поверхности модифицированного электрода ………………………………………………. 68

2.3.3 Спектрофотометрическая методика определения холестерина с
треххлористым железом …………………………………………………………………………….. 69

2.3.4 Методика проведения микроскопических исследований поверхности
электродов …………………………………………………………………………………………………. 69

2.3.5. Методика проведения ИК-спектроскопических исследований
поверхности электродов …………………………………………………………………………….. 70

ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ
ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ ОКИСЛЕНИЯ ХОЛЕСТЕРИНА НА ФЕРМЕНТНОМ
ЭЛЕКТРОДЕ ……………………………………………………………………………………………… 72

3.1. Влияние различных факторов на аналитический сигнал окисления
холестерина на ферментном электроде ………………………………………………………. 72

3.1.1. Влияние материала индикаторного электрода на аналитический сигнал
окисления холестерина на ферментном электроде………………………………………. 73

3.1.2 Влияние природы фонового электролита на аналитический сигнал …….. 75

3.1.3. Влияние рН фонового электролита на аналитический сигнал …………….. 77

3.1.4 Расчет кинетических параметров ферментативной реакции ………………… 78

3.1.5 Влияние компонентов матрицы пробы на аналитический сигнал
электровосстановления перекиси водорода как продукта ферментативного
окисления холестерина ………………………………………………………………………………. 82

3.2 Исследование морфологии электродной поверхности …………………………… 84

ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ
ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ РЕАКЦИИ ОКИСЛЕНИЯ ХОЛЕСТЕРИНА НА ХМЭ
………………………………………………………………………………………………………………….. 87

4.1. Влияние различных факторов на аналитический сигнал окисления
холестерина на ХМЭ ………………………………………………………………………………….. 89
4.1.1. Влияние материала подложки ХМЭ на аналитический сигнал окисления
холестерина ……………………………………………………………………………………………….. 89

4.1.2 Влияние природы фонового электролита на сигнал электроокисления
холестерина на ХМЭ ………………………………………………………………………………….. 92

4.1.3. Влияние рН фонового электролита на сигнал окисления холестерина на
ХМЭ ………………………………………………………………………………………………………….. 94

4.1.4. Влияние параметров электролиза (время и потенциал электролиза) на
сигнал окисления холестерина на ХМЭ ……………………………………………………… 97

4.1.5 Влияние компонентов матрицы пробы на аналитический сигнал
окисления холестерина на ХМЭ …………………………………………………………………. 99

4.2 Расчет параметров электродного процесса ………………………………………….. 101

4.3 Исследование физико-химических закономерностей протекания реакции
окисления холестерина на химически модифицированном электроде ……….. 103

4.4 Исследование морфологии электродной поверхности …………………………. 108

ГЛАВА 5. МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ
ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКОЙ МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ХОЛЕСТЕРИНА В ПРОДУКЦИИ ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ И
БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ НА ХМЭ ……………………………………………… 115

Глава 5.1. Разработка вольтамперометрической методики определения
содержания холестерина в продукции пищевой промышленности и
биологических объектах …………………………………………………………………………… 115

5.1.1. Методика выполнения измерений количественного содержания
холестерина в продуктах пищевой промышленности и биообхектах …………. 120

5.1.2. Подготовка вольтамперометрической методики определения
холестерина к метрологической аттестации ……………………………………………… 123
5.2. Определение содержания холестерина в пищевых продуктах и
биологических объектах объектах методами вольтамперометрии и
спектрофотометрии. Сравнительный анализ. ……………………………………………. 126

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ ………………………………………………. 131

Список литературы ………………………………………………………………………………….. 137

Приложение 1 ………………………………………………………………………………………….. 153
УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

ВОЗ – всемирная организация здравоохранения
ССЗ – сердечно-сосудистые заболевания
СЛОС – синдром Сита-Лемли-Опитца
ХМЭ – химически модифицированный электрод
ХСЭ – хлоридсеребряный электрод
СУЭ – стеклоуглеродный электрод
ГЭ – графитовый электрод
КЭ – композитный углеродсодержащий электрод с обновляемой поверхность
ПВД – полиэтилен высокого давления
ПХ – пероксидазха хрена
ХО – холестерол оксидаза
ДАГУДФК – 2,6-диацетил-2,4,6,8-тетраазабицикло[3.3.0]октан-3,7-дион-
дифосфоновая кислота
ФАД – флавинадениннуклеотид
БАС – биологически активные соединения
ИК – инфракрасный
ДМСО – диметилсульфоксид
ТДАС – трифторид диэтиламиносеры
ТМОС – тетраметоксисилан
ТЕОС – тетраэтоксисилан
ЕС – механизм, включающий электрохимическую реакцию и последующую
химическую реакцию