Оптимизация процессов селекции и культивирования клеток линии СНО, продуцирующих рекомбинантные антитела против фактора некроза опухоли-альфа человека

В ходе выполнения диссертационной работы использован комплекс генно-инженерных, молекулярно-биологических, биохимических, иммунохимических методов исследования, а также методы работы с культурами клеток млекопитающих.
Результаты и их обсуждение
Получение экспрессионных плазмид, несущих гены цепей антитела F10
Для получения биплазмидной системы экспрессии в векторы pcDNA3.3 и pOptiVEC (Invitrogen, США) с помощью двух перекрывающихся синтетических олигонуклеотидов были введены сайты узнавания рестриктаз NheI и XhoI и отобраны клоны с правильной ориентацией фрагмента. Ранее из библиотеки кДНК, полученной на основе мРНК гибридомы, продуцирующей антитела к ФНО-α человека, были выделены и охарактеризованы клоны, содержащие гены вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей антитела к ФНО-α человека F10 (Radko, Boitchenko et al.).
Ген химерной легкой цепи антитела был получен в результате объединения кодирующих последовательностей мышиного вариабельного и человеческого константного доменов методом SOE-PCR. Амплификация проводилась со специфическими олигонуклеотидными праймерами, с помощью которых на 5’-конец гена был введен сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции NheI, а на 3’-конец был введен сайт XhoI. После обработки PCR-фрагмента соответствующими рестриктазами ген химерной легкой цепи антитела клонировали в вектора pcDNA3.3 и pOptiVEC с введенными сайтами узнавания рестриктаз NheI и XhoI, и секвенировали в обоих направлениях по методу Сэнгера.
Таким образом, были получены следующие экспрессионные конструкции:
— плазмиды, несущие гены тяжелой и легкой цепей химерного антитела F10 против ФНО-α человека (Рисунок1А, Б) раздельно, а именно, pcDNA3.3-LС, pcDNA3.3-HС, pOptiVEC-HС, pOptiVEC-LС.
— экспрессионные плазмиды pOptiVEC-EGFP и pcDNA3.3-mCherry, содержащие ген зеленого и красного флуоресцентных белков для контроля процессов трансфекции и селекции (Рисунок 1В);
Следующей задачей являлось получение бипромоторных экспрессионных плазмид, в которых гены обеих цепей антитела находятся в одной плазмиде. В такой конструкции транскрипция гена легкой цепи антитела осуществляется с CMV промотора, для транскрипции гена тяжелой цепи антитела был использован промотор EF-1α. Были получены 2 варианта
бипромоторных плазмид, отличающиеся направлением транскрипции генов легкой и тяжелой цепей антитела (Рисунок 1Г, Д).
Рисунок 1. Структура плазмид для биплазмидной и бипромоторной экспрессии антитела к ФНО-а, и плазмид, несущих гены флуоресцентных белков
A — Плазмиды pOptiVEC-LC и pcDNA3.3-HC, несущие лёгкую цепь антитела и ген дигидрофолатредуктазы, а также тяжёлую цепь и ген устойчивости к генетицину, соответственно;
Б – Плазмиды pOptiVEC-HC и pcDNA3.3-LC, несущие тяжёлую цепь антитела и ген дигидрофолатредуктазы, а также лёгкую цепь и ген устойчивости к генетицину, соответственно;
B — Плазмиды pOptiVEC-EGFP и pcDNA3.3-mCherry, несущие ген белка EGFP и ген дигидрофолатредуктазы и ген белка mCherry под и ген устойчивости к генетицину, соответственно;
Г – Плазмида pBiPr-ABTNF, несущая гены тяжёлой и лёгкой цепей антитела против ФНО-а человека и ген дигидрофолатредуктазы в прямой ориентации «голова-хвост»;
Д – Плазмида pBiPr-ABTNF, несущая гены тяжёлой и лёгкой цепей антитела против ФНО-а человека и ген дигидрофолатредуктазы в обратной ориентации «голова-голова».
Сравнение культур клеток CHO, полученных на основе биплазмидной экспрессии
На основе пар плазмид А и Б (Рисунок 1) методом липофекции были получены две культуры (S3 и S1), проведена селекция 500 мкг/мл G418 и 250 нМ MTX. Продуктивность полученной стабильной линии S3 превышает уровень продукции антител в линии S1 (Рисунок 2), что может свидетельствовать о целесообразности расположения гена легкой цепи в cis-ориентации по отношению к гену dhfr в составе экспрессионной плазмиды.
Культура S3 Культура S1
Рисунок 2. Продукция антител в клеточных линиях S1 и S3 в зависимости от концентрации метотрексата в среде культивирования
Концентрации мАт приведены для культивирований, выполненных в конце каждого из последовательных циклов селекции.
В рамках оптимизации лабораторной технологии культивирования клеточных линий в суспензии было исследовано влияние плотности клеточного инокулята и режима культивирования на уровень
продукции антител. Антитело-продуцирующую линию S3-250нМ выращивали в присутствии 250 нM MTX и 500 мкг/мл G418 в качестве селектирующих агентов. С целью выяснения оптимального метода культивирования в суспензии были использованы три основных подхода, приведенные в Таблице 1.
Таблица 1. Уровень продукции антител при различных методах культивирования в суспензии
Метод культивирования
Концентрация антител в культуральной среде, мкг/мл
Метод произвольного культивирования (начало культивирования с плотностью культуры 3 × 105 клеток/мл)
24,5 ± 3
Метод контролируемой плотности (концентрация клеток поддерживалась равной 6 × 105 клеток/мл)
20,4 ± 2,5
Метод сверхплотной инокуляции (начало культивирования с плотностью культуры 4,5 × 106 клеток/мл)
19,5 ± 1,5
Метод произвольного культивирования с низкой плотностью посева при произвольном культивировании позволил добиться наибольшего выхода биосинтеза антител.
Альтернативным способом выращивания для получения продукции целевого продукта клеточной культуры является применение микрокасул, микрогранул и других носителей. Сравнение уровня экспрессии антител в микрокапсулах, микрогранулах и в суспензии производили в ходе культивирования в течение 18 дней (Рисунок 3А).
A
Б В
Рисунок 3. Культивирование CHO S3 в микрокапсулах, микрогранулах и суспензионной культуре
(А) продукция антител; (Б) изображения клеток на 14 день культивирования, растущих в кальций-альгинатных микрогранулах; (В) — в альгинат-олигохитозановых микрокапсулах. Шкала 100 мкм.
Из Рисунка 3А можно сделать вывод о том, что культивирование стабильных антитело- продуцирующих линий в микрокапсулах приводило к увеличению продукции белка по
сравнению с суспензионной культурой и культивированием в микрогранулах, так как в микрокапсуле свободного объема для роста клеток было значительно больше.
Динамика селекции культур S1 и S3
Культуры S1 (Рисунок 4А) и S3 (Рисунок 4Б), прошедшие двойную трансфекцию, были поэтапно селектированы с получением стабильных линий клеток, устойчивых к 500 нМ MTX. После окончания процедуры селекции и проведения проверки стабильности культур стало возможным сравнение динамики селекции каждой из них. Для культур S1 и S3 селекция начиналась с концентрации 10 нМ и заканчивалась 500 нМ MTX. Статистически достоверное расхождение (p=0,01) значений уровней продукции рекомбинантных антител против ФНО-α в ходе селекции началось с концентрации основного селективного агента MTX равной 250 нМ. (Рисунок 4В). Гомогенность и чистота аффинно выделенных антител подтверждена методом белкового денатурирующего гель-эдетрофореза (Рисунок 4Г).
Рисунок 4. Динамика селекции клеточных линий CHO DG44, трансфицированных плазмидами pOptiVEC-HC и pcDNA 3.3-LC (A); pOptiVEC-LC и pcDNA 3.3-HC (Б)
A – OptiCHO, B – OptiCHO + G418 500 мкг/мл, C – OptiCHO + G418 500 мкг/мл + 50 нМ MTX, D – OptiCHO + G418 500 мкг/мл + 100 нМ MTX, E – CD OptiCHO + G418 500 мкг/мл + 250 нМ MTX, F – CD OptiCHO + G418 500 мкг/мл + 500 нМ MTX
В. Сравнение продукции антител клеточными линиями S1 и S3 в ходе селекции.
Г. Электрофореграмма образца антител, выделенных из супернатанта культур S1 и S3. +2-ME — в буфере с 2-меркаптоэтанолом; -2-ME — без 2-меркаптоэтанола.
Цитосортировка культур S1 и S3
С целью отбора клеточной популяции, характеризующейся повышенным уровнем экспрессии антител, к стабильной линии CHO S3-500 nM, полученной с помощью метотрексатной (500 нМ) и G418 (500 мкг/мл) селекции, был применен метод флуоресцентной клеточной сортировки на проточном цитофлуориметре с последующим культивированием. До этой процедуры для линии S3 MFI (средняя интенсивность флуоресценции, которая косвенно указывает на экспрессию целевого белка) составлял 15,2, а продуктивность 64 мг/л.
Было выяснено, что и до, и после сортировки культура S3 характеризуется более высокими уровнями продукции целевого IgG по сравнению с культурой S1. Так, MFI культуры S3 составляло до и после сортировки 3,7 и 15,2, соответственно, по сравнению со значениями 2,8 и 9,2 для культуры S1 (Рисунок 5В, Г). Сортировка клеток S3 привела к увеличению продукции антител на 30%, а уровень биосинтеза антител культурой S1 значительно не изменился (Рисунок 5Б).
Рисунок 5. Оптимизация продукции антител на проточном цитосортировщике
A. Клетки линии S3 обработанные антителами против IgG-FITC человека до сортировки В окне P3 находится 17% FITC-позитивных клеток. В окне P4 – FITC-негативные клетки. Б. Продукция антител линиями S1 и S3 до сортировки и после сортировки и последующего культивировании в присутствии 1000 нМ MTX.
В, Г. Цитосортировка культур S1 и S3. Изменение содержания FITC-позитивных клеток в культуре до и после проведения цитосортировки.
13

Проведенные эксперименты показали целесообразность использования метода цитосортировки для увеличения уровня продукции антител культурой клеток, ранее прошедшей селекцию высокими концентрациями метотрексата.
Анализ вариантов бипромоторной системы экспрессии
При использовании биплазмидных системы экспрессии для создания линии-продуцента гетеросубъединичных белков, к которым относится химерное антитело против ФНО-α, рост числа копий генов легкой и тяжелой цепей антитела достигается за счет использования двух селективных маркеров (Рисунок 1А, Б).
Прежде чем проводить сравнение бипромоторной и биплазмидной систем экспрессии между собой, было решено исследовать, какой из вариантов плазмиды pBiPr-ABTNF (Рисунок1Г, Д) является наиболее оптимальным. Для трансфекции культуры CHODG44 использовали бипромоторные плазмиды в прямой («голова-хвост») и в обратной («голова- голова») ориентации транскрипции. В результате селекции были отобраны по 2 культуры для каждого вида бипромоторной экспрессионной кассеты.
Рисунок 6. Сравнение максимальной продукции культур, полученных на основе вариантов бипромоторных плазмид на стадии селекции 25 нМ MTX
На основании полученных данных нами был сделан вывод о наибольшей перспективности культуры S11 (обратной ориентацией генов цепей антитела). Данная культура в дальнейшем была использована для последующих раундов селекции и клонирования (Рисунок6) в сравнении с культурой S3, полученной на основе биплазмидной системы экспрессии.
Сравнение биплазмидной и бипромоторной систем экспрессии
После прохождения процедуры клонирования культуры на флуоресцентном сортировщике колоний ClonePIX FL данные продуктивности её клонов сравнивали с исходной родительской культурой клеток. Каждая культура, являющаяся потомком культуры S11, прошла чередующиеся этапы селекции 5, 50, 500 и 2000 нМ MTX. Культура, являющаяся потомком культуры S3, прошла чередующиеся этапы селекции сочетанием 500 мкг/мл G418 с 5, 50, 500 нМ MTX и 1000 мкг/мл G418 в сочетании с 2000 нМ MTX (Рисунок 7).
Различия в гетерогенности возникают из-за метода селекции культур. Так, в случае культуры S3 (Рисунок7А, В, Д, Ж) селекция велась с использованием двух различных селективных агентов — MTX и G418, направленных на селекцию клеток, содержащих плазмиды несущие раздельно гены лёгкой и тяжёлой цепей антитела против ФНО-α. Напротив, при селекции линии клеток S11 (Рисунок7Б, Г, Е, З) селекция велась по пути, предполагающем эквимолярное увеличение копийности генов легкой и тяжелой цепей данного антитела.
Проведенные эксперименты показали, что как биплазмидная, так и бипромоторная системы экспрессии могут быть использованы для селекции клонов-продуцентов. Оптимальная концентрация МTX для селекции клонов культуры S11 составила 500 нМ. Параллельный анализ культур, прошедших селекцию с применением концентрации MTX равной 2000 нМ, показал, что продуктивность получаемых клонов культуры S11 практически не изменилась по сравнению с родительской культурой. Клоны-продуценты, выделенные из культуры S11, в отличие от клонов культуры S3, также прошедшей селекцию 2000 нМ MTX, показывают уровень продукции рекомбинантных антител, сравнимый с родительской культурой. Данный факт означает невозможность дальнейшего увеличения продукции культуры с использованием методики с применением плазмид на основе бипромоторной системы экспрессии (pBiPr), рассматриваемой в данной работе.
Рисунок 7. Продукция каждого из последовательных клонов-продуцентов (голубые столбцы), и уровень продукции родительских культур (оранжевые столбцы) для культур потомков линий S3 (А, В, Д, Ж) и S11 (Б, Г, Е, З)
Проведенные эксперименты показали, что как биплазмидная, так и бипромоторная системы экспрессии могут быть использованы для селекции клонов-продуцентов. Оптимальной концентрацией МTX для селекции клонов культуры S11 является 500 нМ. Параллельный анализ культур, прошедших селекцию с применением концентрации MTX равной 2000 нМ, показал, что продуктивность получаемых клонов культуры S11 практически не изменилась по сравнению с родительской культурой. Клоны-продуценты, выделенные из культуры S11, в отличие от клонов культуры S3, также прошедшей селекцию 2000 нМ MTX, показывают уровень продукции рекомбинантных антител, сравнимый с родительской культурой. Данный факт означает невозможность дальнейшего увеличения продукции культуры с использованием методики с применением плазмид на основе pBiPr, рассматриваемой в данной работе. Дальнейшее увеличение концентрации селективного агента приводит к уменьшению
продукции клеточной линии подобно описанным ранее случаям [Balabashin, Kovalenko et al. 2014]. В целом, клоны, полученные из культуры S11, характеризуются большей однородностью в части продукции целевого белка, что может свидетельствовать о синхронизации уровня экспрессии генов легкой и тяжелой цепей антитела в бипромоторной системе экспрессии по сравнению с биплазмидной. Наиболее высокие уровни биосинтеза антител для биплазмидной системы достигаются при концентрации MTX 2000 нМ.
Оптимизация среды культивирования и применение гидролизатов
Наряду с оптимизацией процессов селекции культуры и отбора клонов были исследованы подходы для усовершенствования процесса культивирования клеток в бессывороточных средах. На первом этапе была изучена возможность использования рекомбинантных белков-добавок рекомбинантного человеческого сывороточного альбумина (рЧСА) и рекомбинантного трансферрина человека (рТФР) для увеличения продуктивности культуры в среде известного состава IMDM. Для определения концентрации белковых компонентов неживотного происхождения, необходимых для роста культуры продуцента и продукции целевого белка, использовали стоковые растворы рекомбинантных белков. Рекомбинантные белки-добавки рЧСА и рТФР были получены и очищены с использованием гель-фильтрации методом, описанным в работах [Bobik, Vorob’ev et al. 2008, Bobik, Popov et al. 2019]. Также использовали инсулин и селенит натрия. Конечная концентрация белковых и небелковых компонентов в разрабатываемых средах представлена в Таблице 2.
Таблица 2. Соотношение компонентов в тестируемой бессывороточной среде (мг компонента/количество концентрата, необходимого для приготовления 1 л среды роста)
Соотношение в среде, относительно концентрации ITS
Компонент Инсулин рТФР Na2SeO3 рЧСА
3:1:1 1:3:1 30 10 5,5 16,5
1:1:3 1⁄3:1:1 10 3,33
1:1⁄3:1 1:1:1⁄3 1:1:1 3:3:3
10 10 10 30 3,33
1⁄3:1⁄3:1⁄3
1,8 5,5 5,5 16,5 1,8 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000
5,5 5,5
0,0067 0,0067 0,0201 0,0067 0,0067 0,0022 0,0067 0,0201 0,0022
Для получения максимальной концентрации мАт культивирование продолжали в течение 14 сут до истощения питательных веществ в среде (Рисунок 8).
Рисунок 8. Конечная концентрация мАт в среде после 14 суток культивирования на средах с различным соотношением рекомбинантных белков-добавок в среде IMDM
1 – IMDM 3:1:1, 2 – IMDM 1:3:1, 3 – IMDM 1:1:3, 4 – IMDM 1⁄3:1:1, 5 – IMDM 1:1⁄3:1, 6 – IMDM 1:1:1⁄3, 7 – IMDM 1:1:1, 8 – IMDM 3:3:3, 9 – IMDM 1⁄3:1⁄3:1⁄3, 10 – IMDM+ITS 3:3:3, 11 –
IMDM+ITS 1:1:1
Наиболее высокие концентрации мАт при культивировании были получены в среде IMDM, содержащей однократную и трехкратную концентрацию рекомбинантных белков неживотного происхождения, где однократной считали 10 мг/л инсулина, 5,5 мг/л рТФР, 0,0067 Na2SeO3 и 1000 мг/л рЧСА. далее применяли однократную концентрацию.
В качестве дополнительных компонентов, необходимых для повышения эффективности среды культивирования, были исследованы гидролизаты растительных белков, которые экстрагировали из порошков пшеницы, подсолнечника, гороха, риса, рисовой муки и сои. После экстракции белков проводили их количественную и качественную характеристику (Рисунок 9).
Рисунок 9. Электрофореграммы водных экстрактов растительных белков
риса (А, 1-4) и гороха (А, 5 и 6) до (1, 3 и 5) и после (2, 4 и 6) гидролиза папаином; а также соевых белков (Б, 1 и 2), глютена (Б, 3 и 4) и подсолнуха (Б, 5 и 6).
Для исследования факторов, влияющих на продуктивность линии-продуцента (выход целевого продукта в среду культивирования), были использованы гидролизаты белков риса, рисовой муки, гороха, сои, пшеницы, подсолнечника и дрожжевого экстракта. Каждый из этих гидролизатов добавляли до 10% в среду культивирования, содержащую 3×105 клеток/мл. В качестве отрицательного контроля вместо гидролизата добавляли буфер, в котором растворяли гидролизаты. Усредненные результаты трёх независимых экспериментов представлены на Рисунке 10.
Рисунок 10. Продуктивность линии клеток (1, мАт, мкг/мл среды) при внесении гидролизатов неживотного происхождения (2, мкг/мл)
1 – рисовый белок, 2 – белок рисовой муки, 3 – белок гороха, 4 – белок сои, 5 – белок пшеницы, 6 – белок подсолнечника К- – контроль без внесения растворов гидролизатов, с
внесением буфера гидролизатов, YE –10% дрожжевой экстракт.
Комбинация белков-добавок, входящая в состав разработанной среды, позволила повысить продуктивность стабильной культуры-продуцента мАт в среде IMDM на 44% по сравнению с комплексной коммерческой добавкой ITS (Insulin-transferrin-selenium). Анализ влияния различных растительных гидролизатов показал, что наряду с широко используемыми в мировой практике гидролизатами риса и сои перспективным является применение гидролизатов гороха и подсолнечника. Так, внесение в измененную среду IMDM гидролизатов белков гороха и подсолнечника, содержащих пептиды с молекулярной массой менее 5 кДа, способствовало увеличению продуктивности линии в 4,5 и 3,7 раза, соответственно, по сравнению с контролем.
Культивирование для получения продукта и введение подпитки культуры
Для изучения ростовых характеристик и продуктивности клона линии CHO S3-2F11 было проведено культивирование с применением полной ростовой среды OptiCHO. Также было осуществлено сравнительное культивирование данной линии с применением подпитки и без применения подпитки. Культура, получавшая подпитку с применением коммерческого препарата Cell Boost 7, увеличила свою продуктивность в ходе культивирования в 3,6 раза (Рисунок 11).
Рисунок 11. Сравнительное культивирование линии CHO S3-2F11 с применением подпитки и без применения подпитки культуры. Стрелками показаны дни внесения подпитывающего раствора в культуральный флакон
Проведение подкормки культуры из расчёта объема культивирования 1000 мл требует внесения 120 мл раствора компонента Cell Boost 7a и 12 мл раствора компонента Cell Boost 7b на один литр среды культивирования OptiCHO. Для достижения эквивалентного уровня продукции антител при применении только среды OptiCHO необходимо 3000 мл данной среды, а также проведения 3 единовременных или последовательных культивирований, что увеличивает финальную стоимость затраченных компонентов.
Таким образом проведённая работа позволяет сделать заключение. Терапевтические мАт уже давно являются важным классом белков для лечения широкого спектра заболеваний: бактериальных, вирусных, аутоиммунных. Оптимизация процессов селекции и культивирования клеток СНО-продуцентов терапевтических мАт способствует снижению себестоимости препаратов на их основе, что в конечном итоге приводит к увеличению их доступности и улучшению качества жизни больных.
В ходе выполнения работы был осуществлен сравнительный анализ 4 вариантов биплазмидных и бипромоторных конструкций для экспрессии химерного антитела к ФНО-α человека в клетках СНО. Были отобраны наиболее эффективные варианты для каждого типа экспрессионных конструкций, после чего были исследованы закономерности метотрексатной селекции и клонального отбора для полученных стабильных клеточных культур. Было установлено, что применение бипромоторных конструкций для экспрессии мАт к ФНО-α позволяет добиться больших уровней продуктивности в отношении целевого белка на этапе селекции клеточной линии при концентрации MTX, не превышающей 500 нМ. Было показано, что после достижения порога, равного 250-500 нМ MTX, до применения клонального отбора или цитосортировки для каждой из исследованных культур рост продуктивности мАт прекращается и начинает снижаться по мере дальнейшего увеличения концентрации MTX. Данная особенность селекции может быть преодолена увеличением концентрации второго селективного агента при наличии его гена в составе экспрессионного вектора. При более высокой концентрации селективного агента оптимальным является использование биплазмидной конструкции, в том числе в сочетании с проведением цитосортировки родительской культуры. Было показано, что флуоресцентно-активированная сортировка клеток (FACS) позволяет идентифицировать и селективно обогатить культуру клеток на основании принципа присутствия и количеств поверхностных белков. Таким образом, технологии, которые приводят к окрашиванию клеточной поверхности за счёт наличия на ней продуцируемого белка, пригодны для радикального увеличения эффективности скрининга путем селективного обогащения культуры за счёт высокопродуктивных клеток до клонирования.
Линия клеток, полученная в ходе детекции клонов, показывающих высокую активность по связыванию вторичных антител, имеет достоверно более высокую продуктивность в отношении целевого белка. При этом она не содержит посторонних репортерных белков или довесков к продуцируемым белкам.
Предложенный в работе способ селекции клонов-продуцентов, основанный на использовании флуоресцентно-меченых вторичных антител и автоматизированного анализа
уровня биосинтеза, дает возможность в короткие сроки при меньшей концентрации селективных агентов произвести отбор клонов-суперпродуцентов рекомбинантных антител. Использование небольших концентраций селективных агентов позволяет предположить возможность дальнейших повторных клонирований и дальнейшего роста продукции субклонов.
Проведено сравнение нескольких методов инокулирования клеточной биомассы при суспензионном культивировании клеток CHO DG44, продуцирующих рекомбинантные антитела к ФНО-α. Показано, что метод культивирования с низкой плотностью посева способствует достижению наибольшего уровня биосинтеза антител.
Предложена альтернатива культивированию клеток в суспензии, которая представляет собой культивирование клеток в гидрогелевых микрогранулах на основе альгината кальция или в альгинат-олигохитозановых полупроницаемых микрокапсулах, мембрана которых позволяет антителам проходить через мембрану и накапливаться в культуральной среде. Показано, что уровень продукции антител клетками CHO DG44, включенными в полимерные микрокапсулы, превышал уровень продукции белка при суспензионном режиме культивирования в любом из его видов.
Была показана возможность оптимизации среды культивирования исключительно с применением белковых факторов неживотного происхождения и растительных гидролизатов. Разработанная в ходе выполнения данной работы рекомбинантная низкобелковая среда на основе комбинации белков-добавок позволила повысить продуктивность стабильной культуры- продуцента рекомбинантных химерных антител на основе клеток линии CHO на 44% по сравнению с используемой комплексной коммерческой добавкой ITS (Insulin-transferrin- selenium). Внесение в разработанную среду на основе IMDM гидролизатов белков гороха и риса, содержащих пептиды с молекулярной массой ниже 5кДа, позволило увеличить продуктивность линии на основе клеток CHO в 3,9 и 4,5 раза, соответственно. Такая комбинация добавок в среду культивирования на основе базовой среды IMDM позволяет избежать контаминации конечного продукта культивирования в виде белкового препарата вирусами человека и другими болезнетворными агентами.
Все перечисленные результаты позволяют добиться значительного снижения себестоимости конечного препарата.
Выводы
1. Созданы две пары конструкций (биплазмидная и бипромоторная) для экспрессии химерных антител к фактору некроза опухоли-альфа в культуре эукариотических клеток CHO DG44, дефицитной по гену дигидрофолатредуктазы dhfr.
2. На основе созданных биплазмидных и бипромоторных конструкций получены линии клеток, стабильно экспрессирующие рекомбинантные антитела к фактору некроза опухоли-альфа, оптимизирована стратегия получения и культивирования стабильных продуцентов рекомбинантных антител.
3. Установлено, что на ранних этапах получения стабильной клеточной линии сравнимый уровень продуктивности культуры может быть достигнут при использовании как биплазмидной, так и бипромоторной систем экспрессии. Для достижения высокого уровня продуктивности при концентрации селективного агента метотрексата более 500 нМ оптимальным является использование биплазмидной конструкции, в том числе в сочетании с проведением цитосортировки родительской культуры и клонального отбора.
4. Добавление рекомбинантных белков инсулина, трансферрина и человеческого сывороточного альбумина позволило повысить продуктивность стабильной культуры- продуцента рекомбинантных антител на основе клеток линии CHO на 44% по сравнению с используемой комплексной коммерческой добавкой ITS.
5. Внесение в разработанную среду гидролизатов белков гороха и риса, содержащих пептиды с молекулярной массой ниже 5кДа, позволило увеличить продуктивность линии на основе клеток CHO в 3,9 и 4,5 раза, соответственно.