Органопротекция предстательной железы на фоне хронического венозного полнокровия в эксперименте

Всего в эксперименте было использовано 108 кроликов-самцов. Для достижения поставленной цели и выполнения установленных задач в ходе исследования были выделены 3 основных этапа.
Первый этап включал создание валидной модели хронического венозного полнокровия малого таза в эксперименте. На данном этапе было использовано 28животных, разделенных на 3 группы. Группа нормальной сосудистой анатомии (n=4), группа с созданной моделью (n=12) и группа с изолированной перевязкой срединной крестцовой вены (n=12).
Второй этап послужил для оценки степени воздействия венозного полнокровия малого таза на структуру предстательной железы в хроническом
эксперименте. В этот этап было использовано 35 кроликов. Для изучения нормальной гистоархитектоники простаты была выделена Группа 1 (n=5), в Группе 2 изучали влияние хронического расширения вен малого таза на простату (n=15) и в Группе 3 оценивали изолированное влияние прогестерона (n=15).
Третий этап заключался в оценке протективного действия антиоскиданта, венотоника и их комбинации на простату на фоне хронического венозного полнокровия. В качестве групп контроля, ввиду принципа минимизации использования лабораторных, были выбраны Группа 1 и 2 второго этапа исследования. На 3 этапе было использовано 45 кроликов, рандомизированных на 3 группы по 15 животных в каждой группе. В Группе 1 животные получали изолированно диосмин, в Группе 2 – ресвератрол, в Группе 3 – комбинацию диосмина и ресвератрола.
Схема исследования представлена на рисунке 1.
Рисунок 1 – Общая схема исследования
На первом этапе лабораторным животным проводили ультразвуковое
исследование венозного аппарата малого таза до начала эксперимента и в день вывода из него, также после мануальной компрессии передней брюшной стенки

фиксировали рефлюкс крови по венам малого таза (более 1секунды). Дополнительно после вывода животных из эксперимента проводили флебографию малого таза в прямой проекции.
На втором и третьем этапе производили забор предстательных желез, готовили микропрепараты, окрашивали гемотоксилином и эозином, по Маллори, затем выполняли фотографирование по 10 полей зрения каждого микропрепарата. После чего в программе ImageJ выполняли морфометрический анализ полученных снимков с регистрацией процентных долей железистой ткани, фиброзных волокон, гладко мышечных клеток. Дополнительно к исследованию микроструктуры предстательной железы проводили химический анализ образцов на содержание гидроксипролина.
Статистическую обработку данных проводили c помощью программного обеспечения Statistica v.12, о достоверности различий судили при помощи непараметрического критерия χ2. Использованы методы непараметрической статистики. Для оценки достоверности результатов при сравнении групп применены непараметрические критерии (Mann-Whitney). Цифровые данные представлены в виде М±m, где М – средняя величина, m –доверительный интервал. Достоверность полученных данных анализировали с помощью критерия Фишера, различия считали статистически значимыми при p<0,05. Положения, выносимые на защиту 1. У лабораторных животных (кролик) после пересечения v.sacralis mediana и дополнительного ежедневного введения в течение месяца гормона Прогестерон 1%-1мл возникает стойкое венозное полнокровие: достоверное увеличение диаметра вен на 63,4% с момента перевязки и окончания эксперимента (p<0,05). Увеличенный диаметр вен, возникший с 30 суток эксперимента, сохранился к 180 суткам и составлял 3,8-3,93 мм (p<0,05). Такого эффекта не было зарегистрировано у животных, которым изолированно пересекли срединную сакральную вену. В данной группе животных, к 180 суткам эксперимента размер вен сопоставим с исходными значениями, уменьшение диаметра отмечено в динамике 1,5-3,9-2,7-1,77 мм (p<0,05). 2. У лабораторных животных с искусственно созданным хроническим венозным полнокровием малого таза при проведении морфометрии выявлена достоверно бо́ льшая доля площади фиброзных волокон в простате относительно здоровых животных. Также прослеживается положительная связь между выраженностью фиброза в предстательной железе, выявленных светооптическим и морфометрическим методом и уровнем гидроксипролина в ткани предстательной железы, что позволяет сделать вывод о негативном воздействии персистирующего венозного полнокровия малого таза на гистоархитектонику предстательной железы. 3. На фоне персистирующего расширения вен малого таза у лабораторных животных комбинированная простатопротективная терапия диосмином+ ресвератролом достоверно более эффективна, чем монотерапия антиоксидантом или венотоником. Апробация и внедрение в практику результатов исследования Материалы диссертации используются в учебном процессе кафедры урологии ФГБОУ ВО «Омский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации при проведении занятий со студентами 6-го курса лечебного факультета, клинических ординаторов, слушателей циклов непрерывного медицинского образования для врачей- урологов и смежных специальностей. Результаты исследования внедрены в практическую работу амбулаторно- поликлинического звена ЛПУ г. Омска и урологической клиники ФГБОУ ВО «Омский государственный медицинский университет» Минздрава России. Основные положения диссертации доложены и обсуждены: на V Конгрессе урологов Сибири с международным участием (Красноярск, май 2016 г.); XVI Конгрессе Российского общества урологов и Российско-Китайском форуме по урологии (Уфа, ноябрь 2016 г.); Европейском конгрессе по андрологии (Будапешт, октябрь 2018 г.); заседании Омского отделения Российского общества урологов (Омск, январь 2018 г., май 2019 г.); XV Конгрессе «Мужское здоровье» с международным участием (Сочи, 2019 г.); IX Конгрессе урологов Сибири с международным участием (Новосибирск, 2021 г.); XXI Конгрессе Российского общества урологов (онлайн-формат, Санкт- Петербург, 2021 г.); Мировом урологическом конгрессе (онлайн-формат, 2021 г.). Апробация диссертационной работы состоялась на совместном заседании кафедры хирургических болезней и урологии ДПО, кафедры общей хирургии, кафедры госпитальной хирургии им. Н.С. Макохи, кафедры факультетской хирургии, урологии ФГБОУ ВО ОмГМУ Минздрава России (протокол No 3 от 29.10.2021г). Степень достоверности результатов Достоверность результатов исследования определена достаточным числом наблюдений (108 лабораторных животных), длительностью проведенного эксперимента (180 дней), современными лабораторными и инструментальными методами исследования и способами статистической обработки полученных данных. Публикации По материалам диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 3 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК Минобрнауки РФ российских рецензируемых научных изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций. В ФГБОУ ВО ОмГМУ МЗ РФ получен патент на изобретение No 2612832, 13.03.2017. Личный вклад автора в исследование Автор лично составил план и дизайн исследования. Проанализировал отечественную и зарубежную литературу. Самостоятельно проведены оперативные пособия на лабораторных животных, уход, вывод из эксперимента. Автором проведена статистическая обработка с интерпретацией полученных данных, сформулированы выводы и даны практические рекомендации. В совместных публикациях с соавторами, доля автора составляет 75-90%. Структура и объём диссертации Диссертационная работа построена по традиционному плану, изложена на 123 страницах машинописного текста, иллюстрирована 12 таблицами, 24 рисунками, включает в себя введение, обзор литературы, 4 главы собственных клинических исследований, заключение, выводы, практические рекомендации, список литературы. Библиографический список включает 168 литературный источник, из них – 44 отечественных и 124 зарубежных источников. Соответствие диссертации паспорту научной специальности Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 3.1.13 – «урология и андрология». Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Результаты исследования и их обсуждение На первом этапе исследования установлено, что созданная модель венозного полнокровия в эксперименте, заключающаяся в пересечении срединной крестцовой вены и дополнительном введении прогестерона в течение 30 суток, обеспечивает стойкую структурно закрепленную варикозную трансформацию вен малого таза. Способ моделирования заключался в следующем животных фиксировали на операционном столе. Проводили обработку операционного поля раствором первомура. Под комбинированной анестезией производили срединную лапаротомию. Выделяли терминальный участок толстой кишки и проксимальный толстой до условной линии входа в малый таз. Мобилизовали срединную крестцовую вену и после наложения двух лигатур пересекали последнюю (рисунок 2). Рану послойно ушивали. После операции всем животным, с целью профилактики инфекционно-токсических осложнений, внутримышечно вводили 1 мл раствора гентамицина, в течение 7 суток. Также внутримышечно животным вводили 0,2 мл 1%раствора прогестерона. Прогестерон вводили в течение 30 дней, начиная за сутки от оперативного вмешательства. Все процедуры проводили, следуя правилам асептики и антисептики. Доказательством созданного хронического венозного полнокровия являются разработанные эмпирические критерии. Первым эмпирическим критерием эффективности созданной модели служит возникновение расширения вен малого таза у лабораторных животных после их аутопсии и проведения флебографии относительно здоровых животных. Дополнительным критерием является регистрация при дуплексном ангиосканировании значимого рефлюкса в венах малого таза. Рисунок 2 – Этап операции. Выделена срединная крестцовая вена У животных с созданной моделью хронического венозного полнокровия малого таза парапростатические вены при проведении флебографии достоверно шире вен интактных животных, зарегистрировано расширение вен на 75% к окончанию эксперимента (р<0,05). Обращают на себя внимание результаты флебографии животных Группы 3, так к 30 суткам эксперимента зафиксировали увеличение диаметра вен (3,9 мм), однако к 180 суткам диаметр вен уменьшился практически до начальных значений (1,77 мм) (p<0,05) (рисунок 3). При проведении сонографического исследования на 30 сутки выявленные изменения в Группе 2 были сопоставимы с результатами Группы 3, регистрировали расширение парапростатических вен. На 90 сутки в Группе 3 отмечено значимое уменьшение диаметра тазовых вен до 2,73 (p<0,01). Также не регистрировался рефлюкс в парапростатических венах. 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 p<0,001 4,1 1,53 p<0,001 4,17 p<0,001 3,83 3,9 1,53 2,7 1,53 30 дней 90 дней 180 дней 1,77 Группа 1 Группа 2 Группа 3 Рисунок 3 – Результаты флебографии группы первого этапа исследования К окончанию эксперимента у животных Группы 3 не было зафиксировано значимого увеличения диаметра вен, что может говорить о полной компенсации венозного оттока от органов малого таза. На 180 сутки получены следующие результаты, представленные в таблице 1. Таблица 1 – Сравнение диаметра вен при выполнении сонографии, 180 дней Показатель 1 группа (n=4) 2 группа (n=4) 3 группа (n=4) Доплерография (зафиксирован рефлюкс) – + – Сонографическое исследование, (диаметр парапростатических вен, мм) Не регистрируются 3,93±0,2 2,73±0,6 Исходя из представленных результатов, можно сказать, что создание стойкого расширения вен возможно при сочетании двух факторов: острой венозной гипертензии и дополнительного токсического действия прогестерона. Стоит обратить внимание, что введение стероидного гормона проводили в течение 30 суток после пересечения срединной крестцовой вены. Действие прогестерона в раннем послеоперационном периоде было достаточным, чтобы сформировать и зафиксировать расширение вен малого таза на протяжении 180 суток эксперимента. На предлагаемой модели возможно изучение патологического влияния хронической венозной гипертензии на органы и ткани малого таза, в частности мужских особей. Так же возможно исследование потенциально новых лекарственных воздействий как на собственно венозную гиперемию, так и на патологические механизмы, возникающие на его фоне. Данная модель была запатентована автором в Российской Федерации. Получен патент на изобретение – Способ создания стойкого венозного полнокровия в малом тазу у лабораторных животных. Патент РФ No 2612832, 13.03.2017. На втором этапе исследования изучали влияние хронического венозного полнокровия малого таза на структуру предстательной железы. В группе животных, с созданным хроническим расширением вен малого таза, были выявлены значительные изменения в структуре предстательной железы. При проведении световой микроскопии начавшийся фиброз в первый месяц исследования прогрессивно продолжался до окончания эксперимента. Возникшие изменения в гемодинамике малого таза, заключающиеся в расширении вен, повлекли за собой нарушение гистоархитектоники предстательной железы. Рост фиброзных волокон «удушал» железистые структуры, замыкая их в отдельно лежащие группы. Нарастающая лейкоцитарная инфильтрация ткани простаты говорит о персистирующем очаге хронического воспаления, которое привело к таким грубым нарушениям (рисунок 4). А – утолщенные фиброзные прослойки «удушают» железистые структуры (белая стрелка), отдельные группы ацинусов со сниженной высотой эпителия (желтая стрелка). Окраска по Малори, ×40; Б – сформированный фиброз внутри ацинусов железы (белая стрелка), резко сглаженный контур эпителия, с отсутствием секрета в просвете (черная стрелка). Окраска по Малори, ×100. Рисунок 4 – Микропрепарат предстательной железы. 180 день, 2 группа Обозначенные изменения, зафиксированные при световой микроскопии, полностью соотносятся с данными морфометрии. Значимым оказалось увеличение доли фиброзных волокон на 71,4% с 30 по 180 день у животных Группы 2 (p<0,01). Увеличение доли соединительной ткани положительно коррелирует с увеличением концентрации гидроксипролина в предстательной железе у животных Группы 2 на 63,3% (p<0,01). Значимое уменьшение доли железистой ткани на 41,3% (p<0,01) к 6 месяцу наблюдения сопоставимо с изменениями найденными при световой микроскопии (рисунок 5). При этом стоить отметить, что изолированное введение прогестетрона не приводило к значимым изменениям в гистоархитектонике предстательной железы. Отсутствие изменений в ультраструктуре простаты подтверждаются морфометрическими показателями и данными химического анализа. Результаты значимо не отличаются от интактных животных. 100 90 87,6 80 70 60 50 40 30 20 10 85,06 p<0,001 44,86 6,64 13,58 8,74 5,82 p<0,01 41,56 6,2 p<0,001 ЖТ ГК ФВ Группа 1 Группа 2 Группа 3 Примечание – ЖТ – железистая ткань; ГК – гладкомышечечные клетки; ФВ – фиброзные волокна. Рисунок 5 – Морфометрические показатели Группы 1, Группы 2 и Группы 3, 6 месяц Таким образом, созданная модель стойкого венозного полнокровия приводит к выраженным изменениям в предстательной железе. На данном этапе исследования доказана роль регионарного венозного полнокровия в склерогенезе простаты, развития стромального отека и уменьшении объема железистой ткани. Полученные результаты подтверждают патогенитическую роль венозной гиперемии в развитии гистологических проявлений ХП/СХТБ. На третьем этапе исследования проводили оценку органопротективных свойств венотоника, антиоксиданта и их комбинации на предстательную железу на фоне хронического венозного полнокровия в эксперименте. В качестве метода протекции ткани простаты у лабораторных животных оправданным представляется применение комбинации ресвератрола+диосмина. Данные лекарственные средства были выбраны исходя из патогенетической обоснованности. Варикозно расширенные вены влекут за собой накопление продуктов перикисного окисления, поддерживающие очаг хронического воспаления исходом которого является склероз органа. Именно венотоник с антиоксидантом прицельно воздействуют на необходимые звенья патогенеза В группе животных, получавших комбинацию лекарственных средств, были выявлены минимальные изменения при проведении световой микроскопии. Напротяжении всего эксперимента регистрировали высокий, пышный эпителий, хорошую секрецию, тонкие фиброзные прослойки (рисунок 6). АБВ А – Группа 1. Выраженный фиброз за счет утолщения междольковых перегородок, уменьшение доли ацинусов предстательной железы; Б – Группа 2. Фиброзные волокна занимают значительную часть поля зрения, сниженная высота железистого эпителия со сглаживанием его контура; В – Группа 3. Отмечается выраженная секреция эпителия, хорошо развитая фестончатость контура ацинусов, тонкие фиброзны прослойки. Рисунок 6 – Микрофотографии предстательной железы 180 дней, окраска по Малори, увеличение ×100 Данные микроскопии были подтверждены после проведения морфометрии полученных снимков. В Группе 3 были значимо меньшие результаты доли площади фиброзных волокон 4,64/6,2/9,08 на 30/90/180 сутки наблюдения относительно всех групп сравнения (p<0,01). На протяжении всего эксперимента доя площади железистой ткани была сопоставима с результатами интактных животных. Данные микроскопии и морфометрии подтверждаются результатами химического анализа образцов предстательной железы на определение концентрации гидроксипролина в ткани предстательной железы. Незначимое нарастание от 14,36 мг % до 18,44 мг % (p>0,05) говорит о достаточном сдерживании роста фиброзной ткани у животных, которые получали комбинацию препаратов (рисунок 7).
20 18 16 14 12 10
8 6 4 2 0
18,44
17,3
14,36
4,64
6,2
9,08
1 месяц
3 месяц
6 месяц
Концентрация гидроксипролина (мг%)
Доля ФВ (%)
Рисунок 7 – Доля площади фиброзных волокон и концентрации гидроксипролина у животных Группы 3 на протяжении всего эксперимента
Таким образом, следует считать доказанным факт протективного действия комбинации ресвератрол+диосмин на структуру предстательной железы на фоне хронического венозного полнокровия в условиях эксперимента.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Подводя итог настоящего исследования, можно заключить, что современное состояние вопроса этиологии, патогенеза и лечения хронического простатита до сих пор остается открытым. Недостаточная изученность всех этиопатогенетических механизмов данного заболевания, может снижать эффективность традиционных рекомендованных методов лечения. Использование комбинации антиоксиданта ресвератрола и венотоника диосмина позволило сохранить структуру предстательной железы на фоне персистирующего венозного полнокровия.
ВЫВОДЫ
1. Созданиемоделихроническоговенозногополнокровиямалоготазавозможно путем сочетания пересечения срединой сакральной вены и дополнительного внутримышечного введения 0,2 мл 1% раствора прогестерона в сутки в течение 30-ти суток, начиная за сутки до пересечения срединой сакральной вены. В результате спустя 180 суток от начала эксперимента парапростатические вены оказались шире на 62,7% относительно вен интактных животных (p<0,01). 2. Хроническое венозное полнокровие отрицательно влияет на структуру предстательной железы, вызывая разрастание фиброзных волокон с замещением ими железистой ткани. На 180 сутки от начала эксперимента увеличение доли соединительной ткани в у животных с венозным полнокровием малого таза составило 86,9%, уменьшение железистой ткани 48,8% (p<0,01) относительно здоровых животных. 3. Максимальным протективным эффектом на структуру предстательной железы на фоне хронического венозного полнокровия малого таза обладает комбинация препаратов ресвератрол и диосмин. У животных данной группы зафиксирован минимальный прирост фиброзных волокон на 3% и уменьшение доли железистой ткани на 6% относительно животных без терапевтического воздействия спустя 180 суток от начала эксперимента. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Созданная модель хронического венозного полнокровия малого таза является универсальной и воспроизводимой и может быть рекомендована к использованию для дальнейшего изучения его влияния на органы малого таза. 2. Факт развития склероза простаты на фоне хронического венозного полнокровия малого таза обуславливает необходимость учета данного фонового фактора в диагностике и лечении хронических воспалительных заболеваний предстательной железы. 3. Полученный положительный протективный эффект применения комбинации венотоника и антиоксиданта на структуру простаты на фоне хронического венозного полнокровия малого таза позволяет предложить дальнейшее продолжение экспериментальных и клинических исследований данной терапии при хронических воспалительных заболеваниях простаты.