Патофизиологические механизмы макрофагальной регуляции образования внеостровковых инсулин-позитивных клеток поджелудочной железы при экспериментальном сахарном диабете второго типа : диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук : 14.03.03

Актуальность темы исследования и степень её разработанности.
Сахарный диабет второго типа (СД2) – прогрессирующее метаболическое
заболевание, характеризующееся хронической гипергликемией, возникающей
вследствие нарушения секреции инсулина на фоне развития
инсулинорезистентности [293, 294]. Широкая распространённость СД2 и
неуклонно увеличивающееся количество больных по всему миру
обуславливают актуальность изучения патогенеза СД2 и необходимость поиска
новых подходов к его лечению. Инсулинорезистентность снижает секреторные
возможности бета-клеток (β-клеток) островков Лангерганса поджелудочной
железы, что приводит к нарастанию гипергликемии и прогрессированию
диабета [4, 9]. Дисфункция β-клеток, по-видимому, занимает крайне важное
место в патогенезе СД2, что нашло отражение в сформулированной в 2016 году
β-клеточно-ориентированной модели развития СД2 [278], согласно которой
прогрессирующее снижение массы и функционального резерва β-клеток
является одним из основных патогенетических механизмов развития СД2. В
последнее время исследователи приходят к заключению, что дисфункция β-
клеток при СД2 может быть отчасти компенсирована образованием новых
инсулин-продуцирующих клеток. В связи с этим, всё большее внимание
привлекают расположенные вне островков Лангерганса клетки, содержащие
инсулин. В современной научной литературе их принято называть инсулин-
позитивными клетками (ИПК) по результатам иммуногистохимического
исследования ткани поджелудочной железы с использованием антител к
инсулину [65, 131, 166, 252]. В литературе отмечено сниженное по сравнению
с β-клетками количество GLUT2 рецепторов на мембране внеостровковых ИПК
[65] и их меньшая уязвимость по сравнению с β-клетками островков в условиях
аллоксанового СД [5]. В ряде работ продемонстрирована нормализация
гипергликемии при СД на фоне увеличения количества внеостровковых ИПК
[164, 169]. Однако морфофункциональная характеристика внеостровковых
ИПК в условиях СД2 в литературе отсутствует. Возможно, они являются
частью диффузной эндокринной системы, значение и функции которой в норме
и при патологии не известны.
В литературе рассматриваются два потенциальных источника данного
типа клеток: дифференцировка стволовых клеток и трансдифференцировка
клеток экзокринного и протокового эпителия поджелудочной железы,
возможная благодаря их функциональной пластичности. Ацинарные клетки
являются привлекательной мишенью для трансдифференцировки в ИПК в силу
своей многочисленности, единства происхождения с β-клетками [145, 188] и
наличия общих для всех клеток поджелудочной железы транскрипционных
факторов, определяющих их дифференцировку и созревание [98, 234].
Факты, подтверждающие пластичность клеток поджелудочной железы в
постнатальном периоде, широко описаны в литературе [234]. Предполагают,
что ключевыми регуляторами дифференцировки панкреоцитов являются
факторы транскрипции Pdx1, Neurogenin3 (Ngn3) и MafA, что подтверждается
трансдифференцировкой ацинарных и протоковых клеток поджелудочной
железы в ИПК путём усиления экспрессии представителей триады этих генов
[208, 303]. Основная роль в развитии поджелудочной железы в эмбриональном
и постнатальном периоде принадлежит Pdx1 [212, 304], присутствие которого
обязательно не только для дифференцировки клеток железы в инсулин-
продуцирующие, но и для их функционирования, что подтверждается
регистрируемым увеличением содержания Pdx1 в зрелых β-клетках [245]. У
взрослых животных активность гена pdx1 снижается в экзокринной части
железы и выражена только в зрелых β-клетках [147].
Вопрос образования ИПК из плюрипотентных стволовых клеток [187,
254] является дискуссионным. На пролиферацию гемопоэтических стволовых
клеток и их миграцию из костного мозга в повреждённые органы, регенерации
которых они способствуют, оказывает влияние состояние SCF/c-kit оси. Фактор
стволовой клетки (SCF) – цитокин, продуцируемый стволовыми клетками
костного мозга и фибробластами, является лигандом рецептора фактора роста
тучных и стволовых клеток с-kit (CD117). Предполагают, что активация SCF/c-
kit оси является одним из механизмов регуляции регенерации, результатом
которой является выход гемопоэтических стволовых клеток из костного мозга
и их миграция в ткани повреждённого органа. Однако известно, что экспрессия
c-kit дифференцированными клетками является органоспецифической [14].
Ранее на моделях повреждения печени и почек было показано, что вещества,
синтезируемые макрофагами, могут способствовать выходу стволовых клеток
из костного мозга и их миграции к повреждённому органу, что может
способствовать репарационным процессам в тканях [14, 16].
Механизмы и условия, способствующие образованию внеостровковых
ИПК, до конца неизвестны. Предположение об участии макрофагов в
регулировании образования внеостровковых ИПК поджелудочной железы при
СД2 можно обосновать рядом фактов. Во-первых, известно, что СД2 является
хроническим воспалительным заболеванием и его развитие сопровождается
макрофагальной инфильтрацией поджелудочной железы [75, 113]. Между тем,
показано, что репрограммирование экзокринных клеток поджелудочной
железы в инсулин-продуцирующие возможно лишь при ограничении
выработки макрофагами провоспалительных цитокинов [221]. Во-вторых,
доказано, что макрофаги способствуют рекрутированию стволовых клеток и их
миграции в повреждённые органы [14, 47], а также сами способны
вырабатывать SCF [250]. В-третьих, доказано влияние активности макрофагов
на пролиферацию β-клеток островков Лангерганса [80, 124, 173, 224].
Наличие доказательств участия макрофагов в образовании инсулин-
продуцирующих клеток ставит вопрос о конкретных механизмах их влияния на
внеостровковые ИПК поджелудочной железы. Среди множества биологически
активных веществ, секретируемых макрофагами, для исследования механизмов
воздействия макрофагов на внеостровковые ИПК поджелудочной железы при
СД2 особый интерес представляют те, с помощью которых макрофаги могут
влиять на функционирование и пролиферацию островковых β-клеток. При СД2
IFN-γ, действуя совместно с другими цитокинами, в частности, с TNF-α,
индуцирует апоптоз β-клеток островков Лангерганса [142]. TNF-α является
провоспалительным цитокином, повышенная секреция которого усугубляет
развитие инсулинорезистентности при СД2 [9, 59]. Макрофаги высвобождают
TNF-α в условиях воспаления и в постпрандиальный период. TNF-α действует
на β-клетки, изменяя выработку и секрецию инсулина [101]. Напротив, TGF-β1
способствует пролиферации β-клеток, он высвобождается макрофагами в
островках Лангерганса при снижении количества β-клеток. Представители
семейства TGF-β могут модулировать развитие поджелудочной железы,
участвуя в регуляции количественного баланса эндокринных и экзокринных
клеток железы. Моноциты и макрофаги являются основными источниками
белков TGF-β [25]. Предполагают, что макрофаги могут использовать TGF-β1
как сигнальную молекулу, способствующую пролиферации β-клеток и
регенерации поджелудочной железы [92, 101]. Показано, что совместное
действие лиганда TGF-β активина и ретиноевой кислоты регулирует развитие
эпителия поджелудочной железы [180]. На более поздних этапах
эмбрионального развития белки TGF-β выступают в качестве сигнальных
молекул, влияющих на то, будет ли клетка дифференцироваться в экзо- или
эндокринную [234, 267].
Таким образом, предположение о том, что макрофаги, активно
принимающие участие в процессах воспаления и регенерации, могут
регулировать образование и функционирование внеостровковых ИПК
поджелудочной железы при СД2, вполне обосновано и подтверждается
экспериментальными данными. Изучение внеостровковых ИПК
поджелудочной железы и механизмов регуляции их образования и активности
со стороны макрофагального звена являются важными направлениями, которые
могут иметь прикладное значение для терапии СД2.
Нельзя не отметить, что специфическое воздействие на макрофаги in vivo
не является тривиальной задачей. В качестве агента, изменяющего активность
макрофагального звена, была выбрана натриевая соль 5-амино-2,3-
дигидрофталазин-1,4-диона (аминофталгидразид натрия), идентификационный
номер в PubChem (PubChemCID) 9794222, InChI Key: JKEBMURXLKGPLR-
UHFFFAOYSA-N, основной фармакологической мишенью которого являются
макрофаги. Аминофталгидразид натрия (далее – АФГ) изменяет
функционально-метаболическую активность макрофагов in vitro и in vivo,
подавляя продукцию воспалительных цитокинов [1, 30, 176, 195].
Цель исследования – выявить отдельные патофизиологические
механизмы макрофагальной регуляции образования и функционирования
внеостровковых инсулин-позитивных клеток поджелудочной железы при
экспериментальном сахарном диабете второго типа и при коррекции
аминофталгидразидом натрия.
Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:
1. Дать сравнительную характеристику локализации, количества,
размеров и функциональной активности внеостровковых инсулин-позитивных
клеток поджелудочной железы в норме и при экспериментальном сахарном
диабете второго типа.
2. Дать оценку влияния макрофагов и изменения их активности под
действием аминофталгидразида натрия на локализацию, количество, размеры и
функциональную перестройку внеостровковых инсулин-позитивных клеток
поджелудочной железы в условиях экспериментального сахарного диабета
второго типа.
3. Оценить вклад макрофагов и изменения их активности под действием
аминофталгидразида натрия в регуляцию образования внеостровковых
инсулин-позитивных клеток поджелудочной железы под действием цитокинов
и ростовых факторов в крови и ткани железы при экспериментальном сахарном
диабете второго типа.
4. Оценить влияние макрофагов и изменения их активности под
действием аминофталгидразида натрия на регуляцию количества клеток в
составе ацинусов и в эпителии протоков поджелудочной железы,
экспрессирующих транскрипционный фактор Pdx1 и рецептор к фактору
стволовой клетки (c-kit).
5. Проанализировать отдельные патофизиологические механизмы
макрофагальной регуляции образования и функционирования внеостровковых
инсулин-позитивных клеток поджелудочной железы при экспериментальном
сахарном диабете второго типа.
Научная новизна. В ходе исследования впервые дана характеристика
субпопуляций инсулин-позитивных клеток (ИПК) в составе ацинусов и в
эпителии протоков поджелудочной железы крыс, включающая их количество,
размеры и функциональную активность, в норме и при развитии
экспериментального сахарного диабета второго типа. Установлено, что
большая часть внеостровковых ИПК поджелудочной железы локализована в
ацинусах железы, тогда как в эпителии протоков их количество значительно
меньше.
Впервые проанализировано влияние макрофагов на содержание Pdx1-
позитивных клеток в составе ацинусов и в эпителии протоков поджелудочной
железы. Выявлено, что снижение макрофагальной инфильтрации ацинарной
части поджелудочной железы, наблюдаемое при воздействии
аминофталгидразида натрия, способствует увеличению количества Pdx1-
позитивных клеток в паренхиме неэндокринной части железы и
сопровождается ростом содержания TGF-β1 в ткани железы. Сочетание этих
факторов приводит к увеличению количества ИПК в эпителии ацинусов и
протоков железы, а также возрастанию их функциональной активности.
Отмеченные изменения ИПК могут являться одной из причин увеличения
продукции инсулина, снижения гипергликемии и инсулинорезистентности,
наблюдаемых при воздействии на функциональное состояние макрофагов при
СД2.
Впервые проанализировано влияние со стороны макрофагального звена
на количество клеток в составе ацинусов и в эпителии протоков поджелудочной
железы, экспрессирующих рецептор к фактору стволовой клетки в условиях
экспериментального СД2.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные
результаты носят фундаментальный характер. Они расширяют существующие
представления об ИПК поджелудочной железы и о роли макрофагов в их
образовании и функционировании. Полученные данные свидетельствуют о том,
что при развитии СД2 количество как ацинарных, так и протоковых ИПК
снижается, несмотря на выраженную макрофагальную инфильтрацию органа.
Воздействие на макрофаги амнофталгидразидом натрия приводит к
уменьшению макрофагальной инфильтрации ацинарной части железы без
существенного изменения количества макрофагов в её протоках, что
способствует увеличению как количества внеостровковых ИПК, так и
усилению их функциональной активности.
Выявлено влияние макрофагов на образование и функционирование
внеостровковых ИПК через увеличение содержания в ацинарных клетках и
клетках эпителия протоков белка Pdx1 – основного фактора транскрипции,
контролирующего образование ИПК, а также через воздействие на продукцию
TGF-β1, одного из факторов, регулирующего трансдифференцировку клеток
поджелудочной железы в эндокринные.
Проведенное исследование создает теоретическую основу для разработки
методов стимулирования образования и функциональной активности ИПК
путем изменения функциональной активности макрофагов. Результаты
исследования могут быть использованы при разработке новых способов
терапии инсулин-дефицитных состояний.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. При развитии экспериментального сахарного диабета второго типа
одиночные или собранные в группы инсулин-позитивные клетки
обнаруживаются в составе ацинусов и в эпителии протоков поджелудочной
железы в тех же соотношениях, что и у интактных животных. Снижение общего
количества внеостровковых инсулин-позитивных клеток при развитии
экспериментального сахарного диабета второго типа инвариантно к их
локализации.
2. Снижение количества внеостровковых инсулин- и Pdx1-
позитивных клеток при экспериментальном сахарном диабете второго типа
происходит на фоне усиления макрофагальной инфильтрации ацинусов,
сопровождаемого ростом содержания TNF-α и IFN-γ и снижением
концентрации TGF-β1 в ткани железы.
3. Уменьшение макрофагальной инфильтрации ацинусов
поджелудочной железы, снижение концентрации TNF-α и увеличение
продукции TGF-β1 в ткани железы под действием амнофталгидразида натрия
сопровождается ростом числа Pdx1-позитивных клеток, количества и
функциональной активности инсулин-позитивных клеток в составе ацинусов и
в эпителии протоков.
4. Макрофагальная регуляция образования и функционирования
внеостровковых инсулин-позитивных клеток поджелудочной железы
осуществляется посредством изменения содержания в ткани железы
провоспалительных цитокинов, ростовых факторов, количества Pdx1-
позитивных ацинарных и протоковых клеток.
Внедрение результатов исследования в практику. Результаты
диссертационной работы используются в учебном процессе курса «Патохимия,
диагностика» на кафедре медицинской биохимии и биофизики Института
естественных наук и математики ФГАОУ ВО «Уральский федеральный
университет имени первого Президента России Б.Н. Ельцина» Министерства