Патогенетическое обоснование новых подходов к лабораторному мониторингу функции трансплантата печени

Нами было проведено два этапа клинического исследования, которые включали в себя ретроспективный анализ 44 историй болезней реципиентов после ОТП и проспективное исследование 29 пациентов до и после ОТП (рис. 1).
Рисунок 1 – Распределение пациентов по группам
Все исследуемые реципиенты поступали в гастроэнтерологическое отделение ГАУЗ СО «Свердловская областная клиническая больница No 1» (главный врач – Трофимов И.М.), г. Екатеринбург, с 2018 по 2020 гг. для выполнения ОТП. Показаниями к трансплантации явились цирроз печени невирусной этиологии – 21%, цирроз печени в исходе вирусных гепатитов –70%, гепатоцеллюлярная карцинома на фоне вирусной этиологии – 7%, другие показания – 2%. Диагноз ставился на основании стандартных клинико- лабораторных критериев, степень тяжести определяли по шкалам MELD и Child- Pugh.
Поскольку не существует четких и общепринятых лабораторных критериев дисфункции трансплантата, то распределение пациентов проводилось нами на основе оценки общего состояния реципиента и длительности изменений биохимических показателей. Группу с дисфункцией трансплантата представили пациенты, у которых наблюдалось длительное повышение биохимических маркеров (более 3 месяцев) и при этом были исключены все другие виды осложнений: сосудистые, билиарные, инфекционные. В группу с благоприятным течением послеоперационного периода входили реципиенты с краткосрочными

изменениями биохимических показателей (не более 10 дней). В группу со
смертельным исходом включали реципиентов, умерших в течение 21 дня (то есть в период госпитализации) после операции в результате различных хирургических осложнений, в том числе по причине тяжелой дисфункции.
В ретроспективном исследование все реципиенты в зависимости от исходов были разделены на три группы: 1 группу составили 16 реципиентов печени с благоприятным посттрансплантационным периодом; 2 группу вошли 18 реципиентов с развившейся в посттрансплантационном периоде дисфункцией трансплантата; 3 группу представили 10 реципиентов со смертельным исходом после ортотопической трансплантации печени.
В проспективное исследование было включено 10 человек из листа ожидания (1 группа), 11 реципиентов с благоприятным течением послеоперационного периода (2 группа), 8 реципиентов с дисфункцией трансплантата (3 группа).
Экспериментальное исследование было проведено на 60 самцах белых мышей в возрасте 7-8 месяцев, массой 24-31 г. Все исследования проводили с соблюдением принципа гуманной методологии медико-биологических экспериментов на животных, учитывая требования ГОСТ Р ИСО 10993.2-99 от 01.07.2010, главы 25, ст. 245 УК РФ. Дизайн экспериментального исследования, его новизна, допустимость и приемлемость были утверждены на заседании локального этического комитета ФГБОУ ВО УГМУ Минздрава России (протокол No 4 от 19.04.2019). Всем животным была проведена частичная гепатэктомия (ЧГ) печени в более подробном описании C. Mitchell и H. Willenbring (2014). Манипуляция выполнялась в условия контролируемого наркоза (0,1 мл ксилазина 2% + 0,1 мл золетила 100, и доводили до 1 мл 0,9% раствором натрия хлорида). В зависимости от проводимой манипуляции мыши были разделены на три группы наблюдения: 1-ая группа – интактные мыши (n = 20); 2-ая — контрольные мыши: ЧГ + 0,9% раствор натрия хлорида, 3-я (основная) группа – ЧГ + внутрибрюшинно препарат цитофлавин в дозе 0,014 мл/10 г массы тела в течение 7 суток ежедневно (n = 20).
Лабораторные исследования
Гематологические исследования. Общий анализ крови реципиентов и здоровых доноров проводился в соответствии со стандартными процедурами с помощью гематологического анализатора Cell Dyn 3500 (Abbott, USA). Для изучения АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов использовали комбинированный агрегометр Chronolog 590 (USA).
Для оценки кроветворной системы у лабораторных животных в экспериментальной части был использован автоматизированный гематологический анализатор МЕК 6400 J/K (Nihon Kohden Corporation, Japan). Кроме того, проводили цитологическое исследование костного мозга лабораторных животных по стандартной методике.
Биохимическое исследование. Для оценки функции печени у реципиентов учитывали следующие биохимические показатели: аспартатаминотрансфераза (АСТ), аланинаминотрансфераза (АЛТ), общий билирубин, альбумин. Весь спектр исследований был выполнен на автоматическом анализаторе AU 5800 (Beckman Coulter, USA).
Иммунохимический анализ. В плазме пациентов определяли концентрацию цитокинов: IL-12, IL-4, IL-6, TNF-alpha/beta, GM-CSF, IL-15, IL- 1RA, IL-7, IL-8, IL-10, MIP 1 alpha, RANTES, NGF, BDNF, EGF, FGF, HGF, LIF, PDGF, PIGF, VEGF-A,D, IFN, IL-13, IL-1, IL-2, IL-5, IL-18, IL-17a, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27, IL-9, IFN alpha/gamma, IL-31, IL-1 alpha/beta, TNF, Eotaxin, GRO, MCP-1, MIP-1, SDF, SCF методом мультипараметрического флуоресцентного анализа с магнитными микросферами (технология xMAP, Luminex 200, USA) с использованием тест-системы ProcartaPlex Human Cytokine / Chemokine / и ProcartaPlex Simplex Human Growth Factor (Invitrogen, USA) согласно протоколу производителя. Концентрацию каждого цитокина подсчитывали на основе средней интенсивности флуоресценции частиц (MFI) с использованием программного обеспечения xPONENT и ProcartaPlex.
У лабораторных животных определяли концентрацию гепатоцитарного фактора роста (HGF) методом твердофазного иммуноферментного анализа с
использованием набора HGF Mouse–ab100687 (Abcam/USA) и
трансформирующий фактор роста (TGF) методом мультипараметрического флуоресцентного анализа с магнитными микросферами (технология xMAP, Luminex 200, USA) с использованием тест-системы ProcartaPlex MouseTGF (Invitrogen, USA) согласно протоколу производителя.
Морфологические исследования. Для оценки восстановительных процессов в тканях проводили морфологическое исследование. Для этого животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом через 3, 7 сутки после операции. Приготовление гистологических препаратов осуществляли по стандартной методике с помощью автоматизированной заливочной станции MICROM EC 350-2 (Thermo Fisher Scientific, USA) и автоматизированного микротома LEICA RM 2245 (Leica Biosystems Nussloch GmbH, Germany).
Для морфометрического анализа данных использовали компьютерную программу анализа изображений (Phenix Phmias 3.0). Производилась оценка следующих морфометрических показателей гепатобиоптатов: количество двуядерных клеток (‰), количество дистрофически измененных клеток (‰), митотический индекс (МИ, ‰), площадь гепатоцита (мкм2), площадь ядра (мкм2), площадь цитоплазмы (мкм2) и ядерно-цитоплазматический индекс (ЯЦИ).
Статистическая обработка. Полученные результаты обрабатывали на основании принципов вариационной статистики. Выборки не подчинялись закону нормального распределения, поэтому использовали непараметрические критерии: медиана (Ме) и 25-й ,75-й квартиль (Q1; Q3). Для выявления различий количественных признаков двух независимых выборок использовали непараметрический двусторонний критерий Манна-Уитни, в двух зависимых выборках – критерий Вилкоксона. Корреляционный анализ использовали для установления взаимосвязей между параметрами (критерий Спирмена).
Для объективной оценки клинической ценности лабораторного теста использовали ROC-анализ (Receiver Operator Characteristic) с расчетом

диагностической чувствительности (ДЧ), специфичности (ДС) и площади под
ROC кривой (AUC).
Обработку результатов проводили с использованием компьютерной
статистической программы Statistica версия 10.0 (Dell (StatSoft), USA). Для решения графических задач использовали пакет EXEL 2007 (Windows 7: Home Premium, Microsoft, USA).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
При оценке результатов гематологического исследования реципиентов в периоперационном периоде были установлены следующие изменения после ОТП: анемия, лейкоцитоз и тромбоцитопения гипердеструктивного типа, которая прослеживалась как до операции, так и в пострансплантационном периоде.
Оценка изменения уровня РLT у реципиентов в первые 10 дней после ОТП позволяет считать, что характер изменений уровня тромбоцитов является показателем, отражающим состояния трансплантата. Критическое снижение PLT: cut-off более 41% от исходного уровня (ДЧ=82, ДС=91, AUC=0,81) на 3 сутки относительно дооперационных значений и резкое повышение более 40% (ДЧ=65, ДС=72, AUC=0,66) к 10-ым суткам позволяет прогнозировать дисфункцию трансплантата (рис. 2).
Рисунок 2 – Динамические изменения количества тромбоцитов у реципиентов с дисфункцией трансплантата и с благоприятным исходом

Изменение количества тромбоцитов сопровождалось снижением их
агрегационной способности на 30% под влиянием АДФ. Вместе с тем, оценивая динамические изменения количества тромбоцитов, стоит обратить внимание на повышение на 3 сутки расчетных гематологических индексов нейтрофилы/лимфоциты (NLR), тромбоциты/лимфоциты (PLR), средний объем тромбоцитов/тромбоциты (MPV/PLT) в группе с ДТ, что, скорее всего, связано с воспалительным ответом и ИПР при ОТП.
Наряду с параметрами клинического анализа периферической крови были исследованы АЛТ, АСТ, билирубин, альбумин и МНО. На этом основании выявили, что ранний посттрансплантационный период у реципиентов с ДТ характеризуется синдромом печеночно-клеточной недостаточности и цитолитическим синдромом. Однако значения АЛТ и АСТ не превышали 1500 МЕ/мл ни на 3 сутки, ни на 10 сутки, что свидетельствует о недостаточной чувствительности данных параметров как ключевых маркеров, определяющих дисфункцию трансплантата (рис. 3), как это считали некоторые авторы (Neves D. B. et al., 2016).
Рисунок 3 – Изменения биохимических показателей 0-3-10 сутки
На основании существующих противоречивых данных о иммунологических механизмах повреждения печени при трансплантации, нами была впервые проведена оценка цитокинового профиля пациентов в ЛО и реципиентов после ОТП.

У реципиентов до трансплантации было выявлено снижение уровня PDGF
в 1,4 раза (р<0,05) и повышение концентрации GM-CSF в 44 раза относительно контрольной группы (р<0,05). Так же было установлено увеличение уровня провоспалительных цитокинов – IL-6, IL-8, обусловливаемое глубоким и необратимым повреждением паренхимы печени. Снижение концентрации BDNF, возможно, связано с энцефалопатией, развившейся при тяжелой печеночной недостаточности. У реципиентов после ОТП было выявлено снижение уровня как про- , так и противовоспалительных цитокинов — IL-1RA, IL-10, IL-4, IL-12, LIF, MIP-alpha, VEGF, BDNF (рис. 4). Указанные сдвиги связаны с иммунодепрессией, а также отражают и развивающиеся в посттрансплантационном периоде нарушения. Так, низкие значения VEGF связаны с эндотелиальной дисфункцией в результате ИПР. Рисунок 4 – Концентрации VEGF и BDNFу реципиентов в ЛО и после ОТП (пг/мл) Проведя анализ цитокинового статуса в зависимости от исхода ОТП, достоверные различия между группами пациентов с ДТ и с благоприятным исходом были выявлены по уровню IL-8. ROC-анализ выявил высокие значения ДС и ДЧ метода, что свидетельствует о достаточной клинической ценности и возможности использования его в клинической практике для оценки функции трансплантата после ОТП (рис. 5). Рисунок 5 – Концентрация интерлейкин-8 у реципиентов печени (пг/мл) В процессе проведенного исследования нами было изучено 60 лабораторных параметров пациентов до и после трансплантации печени. Оценив клиническую информативность тестов, нами были выделены наиболее ценные маркеры, которые в сочетании уже с использующимися параметрами и шкалами смогли бы повысить эффективность лабораторного мониторинга. Таким образом, нами был разработан алгоритм, который мы рекомендуем включать в рутинные обследования пациентов до и после трансплантации для диагностики и прогнозирования ДТ (рис. 6). Рисунок 6 – Алгоритм лабораторного мониторинга для оценки функции трансплантата печени Установление новых патогенетических механизмов ДТ вызвало желание разработать способ патогенетического лечения. Проанализировав полученные ранее результаты клинического исследования и данные литературы, нами была рассмотрена возможность коррекции фармакологическими средствами, действие которых было направлено на разные звенья патогенеза данного осложнения. При ДТ кроме воспалительного ответа в результате ИПР происходит одновременное снижение количества тромбоцитов и уменьшение массы функционирующих гепатоцитов, а оставшиеся клетки испытывают энергодефицит на фоне длительной гипоксии и дисциркуляторынх нарушений. При этом осуществить полноценный адаптационный рост без адекватного пластического и энергетического обеспечения невозможно в сложившейся ситуации. Поэтому при выборе препарата для стимуляции регенерации печени мы руководствовались его метаболическим потенциалом. Одним из средств с известными антигипоксантными и антиоксидантными свойствами является цитофлавин, компоненты которого активно участвуют в цикле трикарбоновых кислот (Доровских В. А. и др., 2017). Кроме того, в клиническом исследовании нами была выявлена способность данного препарата оказывать корригирующее влияние на агрегационную способность тромбоцитов. Поскольку апробацию препарата было невозможно провести в клиническом исследовании, а экспериментальной модели ДТ не существует, то нами была рассмотрена возможность в качестве первого этапа оценить влияние препарата на печень с использованием модели адаптивного роста после оперативного повреждения в условиях инициированной регенерации ЧГ. Кроме того, ее применение считается актуальным для клинических сценариев, в которых количество функционирующей ткани является ограничивающим фактором. В ходе экспериментального исследования нами были выявлены увеличение МИ и снижение уровня гепатоцитов с дистрофией, что сопровождается изменением баланса факторов роста с разнонаправленным действием на регенерацию печени. Данные результаты свидетельствуют о положительном влиянии цитофлавина на восстановительные процессы в печени. С одной стороны, это было обусловлено стимуляцией компонентами цитофлавина энергетического обмена, что усилило клеточную и внутриклеточную регенерацию. Гипертрофия проявлялась увеличением площади цитоплазмы и ядра гепатоцитов. Клеточная регенерация характеризовалась увеличением количества митозов на 3 сутки после ЧГ. Вместе с тем наблюдалось выраженное снижение дистрофически измененных клеток. Все вышеописанные изменения были на фоне сохраненной архитектоники органа (рис. 7). Рисунок 7 – Митотическая активность и число дистрофически измененных гепатоцитов у лабораторных животных после ЧГ на 3 сутки (‰) С другой стороны, за счет действия препарата на рецепторы SUCNR1, расположенные на тромбоцитах и звездчатых клетках. В результате взаимодействия SUCNR1 с сукцинатом происходила активация тромбоцитов, которые самостоятельно начинали секретировать HGF. Вместе с тем активированные тромбоциты взаимодействовали с HSC, подавляя продукцию TGF из звездчатых клеток. Таким образом, увеличение уровня основного митогена гепатоцитов HGF и снижение концентрации TGF, который отвечает за ингибирование восстановительных процессов в печени, приводило к улучшению восстановительных процессов в печени после ЧГ (рис. 8). Рисунок 8 – Концентрации гепатоцитарного и трансформирующего факторов роста в плазме крови лабораторных животных на 3 после ЧГ (пг/мл) На основании данных литературы и проведенных исследований, нами были сформулированы основные патогенетические пути влияния цитофлавина на состояние печени (рис. 9). Рисунок 9 – Механизмы влияния препарата цитофлавин на восстановительные процессы в печени после частичной гепатэктомии Проанализировав морфологические и лабораторные данные, можно заключить об эффективности препарата «Цитофлавин» в качестве стимулятора адаптивного роста после повреждения печени. Вместе с тем одним из главных критериев для апробации фармакологического средства в клинической практике у пациентов после ОТП является его совместимость с основным иммуносупрессивным препаратом (такролимусом), который назначается всем пациентам в посттрансплантационном периоде. Используя онлайн сервис https://checkmedicament.tk/, мы оценили совместимость этих препаратов. В результате негативных взаимодействий между ними обнаружено не было. Поэтому мы считаем возможным в дальнейшем решение вопроса о применении цитофлавина в клинической практике для коррекции дисфункции трансплантата печени. Объединив выявленные новые патогенетические механизмы, влияющие на развитие ДТ, с уже имеющимися литературными данными клинических и экспериментальных исследований, мы представили обобщенную схему патогенеза дисфункции трансплантата печени (рис. 10). Рисунок 10 – Патогенез развития дисфункции трансплантата после ортотопической трансплантации печени Таким образом, успехи в развитии концепции патогенеза, лабораторного мониторинга помогут своевременно стратифицировать пациентов с дисфункцией трансплантата и назначить соответствующее лечение, что в дальнейшем снизит риск ретрансплантации или смерти и увеличит эффективность трансплантационной помощи. ВЫВОДЫ 1. Дисфункция трансплантата печени сопровождается характерной тромбоцитарной реакцией, которая проявляется критическим снижением уровня тромбоцитов и их агрегационной функции и нарушением соотношения клеток и форменных элементов крови (индексы нейтрофилы/лимфоциты, тромбоциты/лимфоциты, средний объем тромбоцитов/тромбоциты) в периоперационном периоде. 2. Повышение активности АЛТ, АСТ >1500 МЕ/мл после трансплантации не может рассматриваться как бесспорный биомаркер дисфункции трансплантата печени, cut-off требует уточнений.
3. У реципиентов после трансплантации печени наблюдается цитокиновый дисбаланс, что обусловлено как особенностями течения посттрансплантационного периода у пациента, так и действием иммуносупрессивной терапии. Нарушение продукции IL-8 у реципиентов можно рассматривать как один из ведущих триггеров повреждения трансплантата печени. Установлено, что для посттрансплантационного периода характерно снижение уровня плазменных факторов роста (фактор роста эндотелия сосудов, мозговой нейротрофический фактор) у реципиентов печени.
4. Разработанный алгоритм лабораторного мониторинга, основанный на определении динамических изменений количества тромбоцитов, их агрегационной функции, гематологических индексов (нейтрофилы/лимфоциты, тромбоциты /лимфоциты, средний объем тромбоцитов/тромбоциты) в ранние послеоперационные сроки и уровня интрелейкина-8 спустя 3 месяца, позволяет своевременно оценивать функцию трансплантата печени и прогнозировать развитие дисфункции трансплантата.
5. Цитофлавин стимулирует репаративные процессы в поврежденной печени посредством участия в регуляции продукции факторов роста: увеличение уровня гепатоцитарного фактора роста (HGF) и снижение содержания фиброгенного фактора – трансформирующего фактора роста (TGF-b).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Установленные закономерности о иммунологических реакциях и реакциях системы крови при дисфункции трансплантата печени необходимо внедрить в учебный процесс на кафедрах патологической физиологии при изучении тем «Патофизиология печени», «Патофизиология воспаления» и в дисциплину «Клиническая лабораторная диагностика» при изучении раздела «Лабораторная диагностика болезней печени».
2. Определение количества тромбоцитов, их агрегационной функции в периоперационном периоде до операции (0 сутки), 3 и 10 сутки после трансплантации, уровня интерлейкина-8 спустя 3 месяца после ОТП рекомендуется использовать в целях лабораторного мониторинга в посттрансплантационном периоде для раннего выявления дисфункции трансплантата печени.
3. Цитофлавин необходимо использовать в разработке новых способов экспериментальной терапии болезней печени.