Потенциометрия в исследовании антиоксидантных и антирадикальных свойств веществ : диссертация на соискание ученой степени доктора химических наук : 02.00.02

Процессы жизнедеятельности организма неразрывно связаны с образованием активных кислородных метаболитов (АКМ) радикальной и нерадикальной природы, являющихся промежуточными продуктами реакции четырех-электронного восстановления кислорода до воды. АКМ вовлекаются в два глобальных типа процессов: с одной стороны, реализация защитных реакций организма; с другой стороны, избыточное образование АКМ и их вторичных продуктов приводит к состоянию, называемому «окислительный стресс» организма. Развитию «окислительного стресса» в организме препятствуют вещества с антиоксидантными свойствами как эндогенного, так и экзогенного происхождения. На сегодняшний день, пожалуй, нельзя найти ни одной области медицины, биохимии, биофизики, фармации, пищевой технологии, в которой не изучались бы процессы свободно-радикального окисления и антиоксидантного действия. Тематика исследования антиоксидантных свойств веществ носит междисциплинарный характер и направлена на улучшение здоровья человека и увеличение продолжительности жизни. Одним из актуальных направлений в этой области является создание подходов к определению интегральных параметров антиоксидантной и антирадикальной емкости/активности, т.к. эффективность функционирования антиоксидантной системы организма может быть не связана с содержанием конкретного соединения, а отражает свойство системы в целом.
В условиях техногенного развития общества, ухудшения экологической ситуации, роста патологических состояний населения риск возникновения окислительного стресса резко возрастает, а, следовательно, исследования антиоксидантных свойств различных объектов, как биологических жидкостей, так и продуктов питания, становятся еще более востребованными.
К настоящему времени круг существующих подходов к определению интегральных параметров антиоксидантной/антирадикальной
8
емкости/активности достаточно широк и по способу регистрации сигналообразующей реакции чаще всего используются спектральные методы (спектрофотометрия, флюорометрия, хемилюминесценция, электронный парамагнитный резонанс). Однако, принимая во внимание, что с химической точки зрения действие антиоксидантов сводится к электронно-протонно- донорному механизму, применение электрохимических методов исследования для интегральной оценки антиоксидантных свойств является более целесообразным. Помимо соответствия принципов методов природе антиоксидантного действия, электрохимические методы обладают рядом преимуществ перед спектроскопическими, такими как доступность, простота эксплуатации, экспрессность, чувствительность, возможность исследования мутных и окрашенных соединений, возможность реализации как в портативном, так и в проточном вариантах анализа.
Степень разработанности темы диссертационной работы
Методики определения интегральных параметров антиоксидантной/антирадикальной емкости/активности базируются в основном на применении моделей окислителей (i) с участием свободных радикалов, которые можно подразделить на модели с использованием стабильных радикалов и радикал – генерирующих систем, или (ii) с участием химических реагентов нерадикальной природы, изменяющих какие-либо физико-химические свойства системы при взаимодействии с АО исследуемого образца. Разработанные для удобства использования и быстрого скрининга большого количества объектов, многие современные подходы к исследованию интегральных антиоксидантных параметров имеют как концептуальные, так и технические ограничения. Поскольку результаты исследования антиоксидантных свойств и выводы относительно эффективности АО в конечном итоге необходимо интерпретировать по отношению к живым организмам, то подходы к исследованию антиоксидантных свойств целесообразно рассматривать не с позиции метода регистрации

9
сигналообразующей реакции, а с позиции механизмов образования АКМ и действия АО в биологических средах. В целом, можно сформулировать следующие основные требования, которые желательно учитывать при разработке методик определения интегральных параметров антиоксидантной/антирадикальной емкости и от которых, в конечном итоге, будет зависеть широта их распространения:
1. обоснованность выбора модели окислителя;
2. физиологичность условий проведения измерения, включая
используемые реагенты, рН и т.д.;
3. реализация одного из механизмов действия антиоксидантов в
организме;
4. качество аналитических характеристик методик (простота реализации,
доступность аппаратурного оформления, воспроизводимость, чувствительность, экспрессность измерения, возможность анализа широкого круга объектов, в том числе мутных и окрашенных).
Существующие методики интегральной оценки антиоксидантных свойств редко ориентируются на удовлетворение всех требований. Таким образом, проблема потребности в методиках, дающих надежные и корректные результаты, остается до конца нерешенной, а создание новых подходов для определения интегральных параметров антиоксидантной/антирадикальной емкости/активности до сих пор является востребованным.
Целью работы является развитие теории и практики потенциометрического метода в комплексной оценке антиоксидантных и антирадикальных свойств веществ и создание новых методологических подходов для количественного определения антиоксидантной/антирадикальной емкости различных объектов, основанных на механизмах химического действия АО в организме.
Достижение поставленной цели требует решения следующих задач:

10
– сформулировать общие принципы, теоретические и практические подходы к использованию потенциометрии в интегральной оценке антиоксидантных/антирадикальных свойств веществ;
– теоретически обосновать и экспериментально подтвердить выбор модели окислителя в реакциях электронного и электронно-протонного переноса с АО;
– обосновать использование потенциометрии для количественной оценки результата реакций электронного и электронно-протонного переноса с АО на модельный окислитель в виде параметров антиоксидантной и антирадикальной емкости (АОЕ и АРЕ), установить взаимосвязь структура АО – АОЕ/АРЕ;
– разработать экспрессные методики определения АОЕ и АРЕ индивидуальных веществ и многокомпонентных объектов;
– разработать методики определения интегральных параметров АОЕ и АРЕ различных объектов (лекарственных средств, экстрактов растительного сырья, пищевых продуктов, биологических жидкостей), рассчитать основные аналитические и метрологические характеристики;
– провести корреляционные исследования антиоксидантных свойств с использованием новых и известных методик, основанных на разных физико- химических принципах регистрации аналитического сигнала.
Научная новизна работы
1. Сформулированы и теоретически обоснованы критерии выбора модельной системы окислителя для исследования антиоксидантных свойств веществ.
2. Развита концепция применения потенциометрии в изучении реакций электронного и электронно-протонного переноса для решения конкретных аналитических задач, связанных с определением интегральных параметров АОЕ и АРЕ различных объектов.

11
3. Изучены закономерности протекания реакции K3[Fe(CN)6] с АО, показана возможность использования изменения окислительно- восстановительного потенциала системы K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] для количественной оценки антиоксидантных свойств веществ, установлена взаимосвязь структуры АО и его антиоксидантной емкостью.
4. Исследовано влияние хелатирующей способности АО на величину интегрального параметра АОЕ.
4. Изучены закономерности изменения окислительно- восстановительного потенциала системы K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] при протекании реакции генерирования пероксильных радикалов, показана возможность использования потенциометрии для количественной оценки кинетических параметров этой реакции (скорости и константы скорости генерирования).
5. Изучены закономерности изменения окислительно- восстановительного потенциала радикал генерирующей системы на модели 2,2′-азобис(2-амидинопропан) дигидрохлорида (AAPH) в качестве источника пероксильных радикалов в процессах их генерирования и ингибирования антиоксидантами, показана возможность использования потенциометрии для количественной оценки этих процессов.
6. Предложены новые подходы для потенциометрического определения интегральных параметров АОЕ и АРЕ различных объектов.
Новизна предлагаемых подходов подтверждена 4 патентами РФ.
Теоретическая и практическая значимость работы
1. На основании сформулированных принципов разработана методология потенциометрического исследования антиоксидантной/антирадикальной емкости объектов, основанная на закономерном изменении окислительно- восстановительного потенциала системы, состоящей из модельного окислителя и исследуемого образца, в процессе реакций электронно- протонного переноса.

12
2. Сформулированы и теоретически обоснованы критерии выбора модельной системы для исследования антиоксидантных/антирадикальных свойств веществ.
3. Разработана оригинальная потенциометрическая методика определения АОЕ индивидуальных АО и многокомпонентных объектов, основанная на реакции АО с окисленным компонентом системы K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6], рассчитаны стехиометрические коэффициенты реакций.
4. Предложен новый подход к определению скорости и константы скорости реакции генерирования пероксильных радикалов, подобных радикалам, образующимся в организме с использованием потенциометрического метода.
5. Разработана оригинальная потенциометрическая методика определения АРЕ индивидуальных АО и многокомпонентных объектов, основанная на реакции АО с генерируемыми пероксильными радикалами, образующимися в результате термического распада AAPH, рассчитаны коэффициенты ингибирования.
6. Разработаны и запатентованы алгоритмы количественного определения АОЕ, АРЕ, кинетических параметров реакции генерирования пероксильных радикалов с использованием потенциометрии, определены рабочие условия проведения анализа, исследовано большое количество объектов (индивидуальные вещества природного происхождения и синтезированные, экстракты растительного сырья, лекарственные препараты, пищевые продукты, биологические жидкости), проведены корреляционные исследования с привлечением независимых способов.
7. Оценены аналитические и метрологические характеристики разработанных методик.
8. Аттестованы методики количественного определения антиоксидантной емкости пищевых продуктов, продовольственного сырья,

13
БАД, витаминов, биологических материалов (крови и ее фракций) по ГОСТ Р 8.563.
9. Получен акт внедрения разработанных методик в образовательный процесс.
Методология и методы диссертационного исследования
Методологической основой при выполнении диссертационного исследования послужили теоретические знания и современные методы исследования антиоксидантных / антирадикальных свойств соединений с использованием моделей окислителей радикальной и нерадикальной природы.
При выборе модельных окислителей руководствовались современными наработками в области исследования механизмов химических реакций АО с АКМ, данными по термодинамическим и кинетическим характеристикам. При исследовании электрохимической обратимости систем и окислительно- восстановительных свойств соединений использовали метод циклической вольтамперометрии. В качестве основного метода исследования АОЕ, АРЕ и кинетики генерирования радикалов использован потенциометрический, как наиболее простой, информативный, более полно отвечающий природе изучаемых процессов. В корреляционных исследованиях в качестве методов сравнения использованы спектрофотометрический метод исследования противорадикальной активности на модели стабильного радикала DPPH, спектрофотометрический метод оценки общего содержания полифенолов с использованием реактива Фолина-Чокальтэу (Folin–Ciocalteu), как наиболее точные, утвержденные ГОСТ методы анализа, фотохемилюминесцентный метод определения антиоксидантной активности на модели фотоокисления глицил-триптофана (Gly-Trp) с использованием рибофлавина (RF) в качестве фотосенсибилизатора, хемилюминесцентный метод определения сверхслабого свечения продуктов перекисного окисления липидов, спектрофотометрический метод определения общего антиоксидантного статуса TAS Randox.

14
Основные положения, выносимые на защиту:
 Методология комплексного исследования антиоксидантный свойств веществ, основанная на механизмах действия АО в организме.
Обоснование выбора потенциометрии и модельных окислителей K3[Fe(CN)6] и ААРН в реакциях переноса электрона и атома водорода соответственно, для определения интегральных параметров антиоксидантной/антирадикальной емкости.
Результаты исследования взаимодействия АО с выбранными окислителями методом потенциометрии, определение стехиометрических коэффициентов в реакциях электронного переноса и коэффициентов ингибирования в реакциях электронно-протонного переноса.
Закономерности изменения окислительно-восстановительного потенциала системы K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] при протекании реакции окисленного компонента с индивидуальными АО, количественная оценка этого взаимодействия в виде параметра АОЕ, измеренная потенциометрическим методом.
Результаты исследования кинетики генерирования пероксильных радикалов на модели термического распада азоинициатора ААРН потенциометрическим методом в условиях, близких к физиологическим, количественная оценка скорости и константы скорости генерирования.
Закономерности изменения окислительно-восстановительного потенциала радикал генерирующей системы на модели AAPH в качестве источника пероксильных радикалов в процессах их генерирования и ингибирования антиоксидантами, количественная оценка этого взаимодействия в виде параметра АРЕ, измеренная потенциометрическим методом.
 Новые потенциометрические методики количественного определения интегральных параметров АОЕ и АРЕ, отличающиеся простотой,

15
экспрессностью, точностью, воспроизводимостью и их применение в анализе широкого круга модельных веществ и реальных объектов.
Результаты определения АОЕ и АРЕ индивидуальных АО и реальных объектов (индивидуальные вещества природного происхождения и вновь синтезированные, экстракты растительного сырья, лекарственные препараты, пищевые продукты, биологические жидкости).
Результаты корреляционных исследований антиоксидантных свойств, полученных с использованием новых потенциометрических и известных методик, основанных на разных физико-химических принципах регистрации аналитического сигнала.
Степень достоверности и апробации результатов
Достоверность научных положений, полученных результатов и сформулированных в работе выводов обеспечена использованием современных методов исследования и оборудования для электрохимических и спектроскопических измерений, высокой степенью корреляции полученных экспериментальных результатов с теоретически ожидаемыми и с независимыми методами исследования, согласованностью с литературными данными, высокими показателями метрологических характеристик.
Разработанные методики количественного определения антиоксидантной емкости пищевых продуктов, продовольственного сырья, БАД, витаминов, биологических материалов (крови и ее фракций) аттестованы по ГОСТ Р 8.563 и внедрены в образовательный процесс.
Основные положения диссертационной работы доложены на XV, XVI научно-технической конференции «Датчик» (Судак, 2003, 2004 гг); на VI, VII, VIII и IX Всероссийских конференциях с международным участием «Электрохимические методы анализа» (Уфа, Екатеринбург, Россия, 2004, 2008, 2012, 2016 гг.); 6 – м симпозиуме «Биосенсоры и биоаналитическая техника в экологическом и клиническом анализе» (Рим, Италия, 2004 г.); на Научно-технической конференции «Высокоэффективные пищевые

16
технологии, методы и средства для их реализации» (Москва, 2004 г.); на Всероссийской научной конференции с международным участием «Электроаналитика-2005». (Екатеринбург, 2005 г.); на 4-ой научно- практической конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека», (Смоленск, 2005 г.); на I Международной конференции «Traditional medicine and dietology – a way to caucasian longevity» (Likani, Georgia, 2006 г.); на Международном конгрессе по аналитическим наукам ICAS-2006 (Москва, Россия, 2006 г.); на XVIII, XX Менделеевских съездах по общей и прикладной химии (Москва, Екатеринбург, Россия, 2007, 2016 гг.); на Международных симпозиумах «Последние достижения в анализе пищевых продуктов» (Prague, Czech Republic, 2007, 2015 гг.); на II Международном Форуме «Аналитика и Аналитики» (Воронеж, 2008 г.); на III Всероссийской конференции с международным участием «Аналитика России» (Краснодар, 2009 г.); на XV конференции по электроанализу (Инсбрук, Австрия, 2009 г.); на симпозиуме с международным участием «Теория и практика электроаналитической химии (Томск, Россия, 2010 г.); на VIII Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2010 г.); на IV химическом конгрессе (Prague, Czech Republic, 2012 г.); на IX, X Всероссийской конференции «Химия и медицина» (Уфа, Россия, 2013, 2015 гг.); на II, III Съездах аналитиков России (Москва, 2013, 2017 гг.); на Международной научно-практической конференции «Свободные радикалы и антиоксиданты в химии, биологии и медицине» (Новосибирск, 2013 г.); на конференции «Электроанализ 2015» (Бордо, Франция, 2015 г.); на I Всероссийской конференции с международным участием «Химический анализ и медицина» (Москва, 2015 г.); на XX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Екатеринбург, 2016 г.); на международной конференции «Analytical and Bioanalytical Chemistry» (Барселона, Испания, 2018 г.); на III, IV Междисциплинарном Симпозиуме по Медицинской, Органической и Биологической Химии и Фармацевтике

17
МОБИ-ХимФарма (Севастополь, Новый Свет, Судак, Крым, 2017, 2018, 2019 гг.).
Публикации. По результатам диссертации опубликовано 132 работы, в том числе 16 статей в рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК, 4 патента РФ, 2 учебных пособия и тезисы более 100 докладов всероссийских и международных научных конференций.
Личный вклад автора в исследования, проводимые в рамках диссертационной работы, заключается в обосновании методологии исследования антиоксидантных свойств веществ на основании действия АО в организме, развитии теории потенциометрического исследования реакций электронно-протонного переноса, в теоретическом обосновании выбранных моделей окислителей и создании на этой основе новых подходов к определению антиоксидантной и антирадикальной емкости индивидуальных веществ и объектов со сложной матрицей. Работы, выполненные в соавторстве и включенные в диссертацию, состояли в постановке целей и решении задач исследования, интерпретации полученных экспериментальных данных, систематизации результатов исследования.
Работа выполнена при финансовой поддержке: Международной ассоциации по содействию сотрудничеству с учёными независимых государств бывшего Советского Союза INTAS (проект No 00-273, 2001 – 2004 гг.), Министерства Образования РФ (проект No 14024, 2005 г.), Международного научно-технического центра МНТЦ (проект No 2132, 2003- 2005 гг.), Российского Фонда Фундаментальных Исследований (проект No 07- 03-96071-р_урал_а, 2007-2009 гг.), Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно – технической сфере (ГК No 4140р/6479, 2006 – 2007 гг.), в рамках госбюджетной темы Н687.42Г.002/12 (проект No 4.9514.2017/БЧ, 2017-2019 гг.), Российского Научного Фонда (проект No 16-13-00008, 2016- 2018 гг.)

18
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав, заключения, списка литературы, приложений. Текст диссертации изложен на 350 страницах, содержит 89 рисунков, 85 таблиц, 3 приложения и 412 библиографических ссылок.
Во введении сформулирована актуальность и степень разработанности темы диссертационной работы, поставлены цели и задачи исследования, показана научная новизна и практическая значимость, а также положения, выносимые на защиту.
Первая глава посвящена обзору литературы, в котором раскрыты механизмы биологического действия АО, показана связь с механизмами химического превращения АО и рассмотрены основные подходы к исследованию антиоксидантных свойств веществ, которые классифицированы в соответствии с механизмами. Проведен анализ существующих способов и обоснована необходимость разработки новых подходов в исследовании интегральных параметров антиоксидантных свойств веществ.
Во второй главе описаны применяемые методы исследования, приборы и используемые методики. Представлены сведения о используемых реактивах и объектов исследования, а также способах математической обработки полученных результатов.
Третья глава посвящена развитию теоретических подходов к исследованию реакций переноса электрона с АО на модельный окислитель с использованием потенциометрии. Теоретически и экспериментально обоснован выбор модели окислителя для определения интегрального параметра антиоксидантной емкости, основанного на реакции переноса электрона, а также условий реализации данной реакции. Представлены результаты исследования модельных индивидуальных АО, показано, что величина АОЕ коррелирует с числом функциональных антиоксидантных групп изучаемых молекул. На основании проведенных исследований предложена новая потенциометрическая методика определения АОЕ.

19
Исследовано влияние хелатирующей способности АО в величину интегрального параметра АОЕ.
В четвертой главе описаны теоретические подходы к исследованию реакций переноса атомов водорода с АО на модельный окислитель с использованием потенциометрии. Обоснован выбор радикал-генерирующей системы и изучена кинетика реакции термического распада 2,2′-азобис(2- амидинопропан) дигидрохлорида (AAPH) (определены скорость и константа скорости реакции). Изучены закономерности изменения окислительно- восстановительного потенциала радикал генерирующей системы на модели AAPH в качестве источника пероксильных радикалов в процессах их генерирования и ингибирования антиоксидантами. Предложены новые потенциометрические методики определения кинетических параметров реакции генерирования радикалов и величины антирадикальной емкости. Приведены экспериментальные данные по определению АРЕ индивидуальных АО на модели выбранной радикал-генерирующей системы, изучено влияние различных факторов (ионная сила раствора, буферная емкость) на результаты определения.
В пятой главе представлены результаты определения АОЕ и АРЕ различных реальных объектов– индивидуальных природных АО, синтезированных АО, продуктов питания (ягод, фруктов, овощей, чая, спиртных напитков), лекарств, витаминов, экстрактов растений, биологических объектов (плазма, сыворотка, эритроцитарная масса, диализная жидкость). Осуществлен выбор рабочих условий проведения анализа и разработаны алгоритмы определения АОЕ и АРЕ. Оценены аналитические и метрологические характеристики разработанных методик: величина относительного стандартного отклонения, показатели повторяемости и воспроизводимости, интервал относительной систематической погрешности. Представлены результаты корреляционных исследований, полученных с использованием новых потенциометрических и известных методик, основанных на других физико-химических принципах.

20
В заключении диссертации резюмированы результаты и подведены итоги проведенного исследования.
В приложениях к диссертации представлены «Методика определения антиоксидантной активности пищевых продуктов, продовольственного сырья, БАД и витаминов методом потенциометрии с применением анализатора МПА- 1» (свидетельство УНИИМ – No 224.04.10.063/2007), «Методика определения антиоксидантной активности проб биологических материалов методом потенциометрии с применением анализатора МПА-1» (свидетельство УНИИМ – No 224.11.10.067/2007), акт внедрения разработанных методик в учебный процесс.