Психотропная активность адамантовых производных ГАМК и альфа-пирролидона

В первой главе проведен анализ отечественных и
зарубежных литературных источников по теме диссертации.
Представлены основные группы препаратов для лечения тревожно-
депрессивных расстройств, одобренные для клинического
применения. Представлен современный взгляд на проблему
тревожно-депрессивных нарушений. Рассмотрены основные
механизмы и системы, лежащие в основе развития данных
расстройств, на основании этого сформулирована концепция
данного исследования.
Во второй главе диссертации описаны материалы и методы
исследования (Рисунок 1). В работе проводилось изучение 7-ми
новых производных ГАМК и альфа-пирролидона под следующими
лабораторными шифрами ANR, IE, BKM и TIM. Все исследуемые
соединения были синтезированы на кафедре органической химии
Самарского государственного технического университета (Самара,
Россия). Лабораторные шифры, структурные формулы и
молекулярные массы исследуемых соединений представлены ниже
(Таблица 1).
Таблица 1. Структуры адамантановых производных ГАМК

Адамантановые производные ГАМК
№ШифрСтруктурная формулаMr

ANR-03
(R)-(3-адамант-1-ил)-4-
1273
аминобутановаякислота
хлоргидрат

ANR-04
(S)-(3-адамант-1-ил)-4-
2273
аминобутановаякислота
хлоргидрат

BKM-22
34-(адамантан-1-ил)-4-273
аминобутановая кислота

Адамантановые производные альфа-пирролидона

ANR-10
44-(1-адамантил) пирролидин-219
2-он рацемат

IE-1
51-(3-гидроксиадамантан-1-235
ил)пирролидин-2-он

TIM 2
61-(адамантан-1-219
ил)пирролидин-2-он
TIM 3
(3aS,10aS)-декагидро-
74,8:6,10-205
диметаноциклонон[b]пиррол-
2(1H)-он)
Экспериментальные исследования осуществлялись на 380
крысах самцах линии «Wistar» массой 200–250 г, а также на 330
самцах и 30 самках мышей весом 18-25 г. Животные содержались в
условиях вивария кафедры фармакологии и фармации Института
НМФО ВолгГМУ, с естественным световым режимом при
относительной влажности воздуха 40-50% и температуре 22-24˚С на
стандартной полнорационной диете для лабораторных животных
(ГОСТ 50258-92). Содержание животных и экспериментальные
манипуляции отвечали директивам 2010/63/EU Европейского
Парламента и Совета Европейского Союза от 22.09.2010 г по охране
животных, используемых в научных целях. Все эксперименты были
одобрены к проведению Региональным независимым этическим
комитетом при ГБУ «Волгоградский медицинский научный центр»
(протокол №2021/034 от 19.04.2021 года).
В качестве препаратов сравнения использовались:
Фонтурацетам (Фенотропил) – 20 мг/кг (синтезирован на кафедре
органической химии Российского государственного педагогического
университета им. А.И. Герцена (Санкт-Петербург, Россия), Диазепам
– 1 мг/кг (Simplex pharma Pvt. Ltd., Индия), Флуоксетин 20 мг/кг
(Флуоксетин-Канон, капс; ЗАО «Канонфарма продакшн», Щелково,
Россия), Имипрамин 15 мг/кг (ОАО Фармацевтический завод ЭГИС,
Будапешт, Венгрия), Фенибут 20 мг/кг (субстанция, получена на каф.
органической химии РГПУ им. А.И. Герцена, Санкт-Петербург,
Россия), Амантадин 60 мг/кг (Merz Pharma, Германия), Цитиколин
500 мг/кг (Феррер Интернасьональ С.А.). На этапе скрининга
исследуемые соединения вводились однократно перорально в
эквимолярных дозах (в соотношении 1/40, 1/20, 1/10 и 1/5 от Mr).
Проведённое исследование психотропной активности на этапе
скрининга позволило выявить наиболее активные соединения и их
наиболее эффективные дозы.
Рисунок 1. Дизайн экспериментального изучения психотропных
свойств адамантановых производных ГАМК и альфа-
пирролидона

На первом этапе для изучения психотропных свойств
адамантановых производных ГАМК и альфа-пирролидона
использовали следующие поведенческие тесты: «Открытое поле»
(ОП) (Воронина Т. А., 2000, 2012; Островская Р.У., 2012);
«Приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ) (Воронина Т.А.,
2000, 2012; Островская Р. У., 2012).
Для изучения влияния ряда исследуемых соединений на
когнитивную и мнестическую функцию использовались тесты:
«Условная реакция пассивного избегания» (УРПИ) (Воронина Т. А.,
Островская Р.У., 2005) и тест «Экстраполяционного избавления»
(ТЭИ) (Воронина Т. А., Островская Р. У., 2005).
Дляболееподробногоизучениявыявленной
психоактивирующей,ноотропной,противотревожнойи
антидепрессантной активности исследуемых соединений было
проведено исследование их психотропных свойств в наиболее
эффективных дозах в сравнении с референтными препаратами.
Подтверждениевыявленнойанксиолитическойактивности
осуществлялось при помощи дополнительно проведенного теста:
«Конфликтной ситуации» (Vogel) (Vogel J. R., 1971), а для
подтверждения выявленной антидепрессантной активности:
«принудительное плаванье по Porsolt» (Porsolt R. D., 2001) и
«Подвешивание мышей за хвост» (ПМХ) (Миронов А. Н., 2012)
Оценка острой токсичности исследуемых соединений была
выполнена в соответствии с руководством по экспериментальному
(доклиническому) изучению новых фармакологических веществ
(Воронина Т.А., 2000, 2012; Островская Р.У., 2012).
С целью более подробного изучения антидепрессантного
действия исследуемых соединений в условиях патологического
процесса, осуществляли формирование у лабораторных мышей
депрессивно-подобного состояния посредством моделирования
социальной депрессии (Рисунок 2) (Ясенявская А. Л.,
Хамидуллаевна М. В., 2017).
Для оценки выраженности депрессивного состояния у
животных, проводилась батарея поведенческих тестов (Рисунок 2):
поведенческое отчаянье оценивали в тестах «принудительное
плаванье по Porsolt» (Porsolt R. D., 2001) и «подвешивание за хвост»
(Миронов А. Н., 2012) уровень социализации животных оценивался
в тесте «социального взаимодействия»; (Liu X., et al., 2018) уровень
тревожности оценивали в тесте «Приподнятый крестообразный
лабиринт» (ПКЛ) (Воронина Т.А., 2000, 2012; Островская Р. У.,
2012); двигательную и исследовательскую активности оценивали в
тесте «Открытое поле» (Воронина Т. А., 2000, 2012; Островская Р.У.,
2012).
После подтверждения наличия симптомов развившегося
депрессивного состояния, начинался этап 10 дневного лечения,
которое проводилось на фоне продолжения ежедневных социальных
конфронтаций. При этом за 60 минут до начала манипуляций, в
зависимостиотгруппы(n=10),животныеполучали
соответствующие вещества: «Интакт», «Депрессия+физ.р-р» – 0,9%
раствор NaCl, «Депрессия+ВКМ-22» – ВКМ-22 в дозе 14 мг/кг,
«Депрессия»+TIM-2 в дозе 11 мг/кг, «Депрессия+Имипрамин» –
Имипрамин в дозе 15 мг/кг. Доза исследуемых соединений была
выбрана, как наиболее эффективная по результатам предыдущих
исследований, доза препарата сравнения выбрана по литературным
данным (Ramirez K., Sheridan J. F., 2016).
Спустя 10 дневной терапии, животные повторно проходили
батарею поведенческих тестов в той же последовательности, что и
ранее, но уже с целью оценки эффективности исследуемых веществ.

Рисунок 2. Дизайн моделирования социальной депрессии

Влияние исследуемых соединений на психоневрологический
дефицит изучали на животных, которым моделировали необратимую
окклюзию общих сонных артерий под золетил-ксилазиновым
наркозом (20 и 8 мг/кг соотв.) (Волотова Е. В., и др., 2016).
Оценивали влияние их курсового введения на выраженность
неврологического дефицита (при начале лечения через 24 часа после
операции и 7 дней введения), а также на уровень тревоги, депрессии
и социализацию (при начале лечения через 40 суток после операции
и 14 дней введения) у животных с нарушением мозгового
кровообращения.
Фармакологический анализ заключался в изучении
взаимодействия адамантановых производных ГАМК и альфа-
пирролидона с дофаминергической системой (по влиянию на
выраженность вертикализации, вызванной апоморфином и по
влиянию на каталептогенный эффект галоперидола) (Воронина Т. А.,
Островская Р. У., 2005); с холинергической системой (по влиянию на
ареколиновый и никотиновый тремор) (Миронов А.Н., 2012); с
серотонинергической системой (по влиянию на 5-окситриптофан
индуцированный гиперкинез) (Воронина Т. А., 2008); с ГАМК-
ергической системой (по влиянию на судороги, вызванные
пикротоксином и коразолом) (Воронина Т. А., Островская Р. У.,
2005).
Статистическую обработку результатов исследования
проводили с использованием пакетов следующих программ:
Microsoft Office Excel 2016 (Microsoft, США) и Prism 6 (GraphPad
Software, США). Для проверки распределения на нормальность
использовали критерий Шапиро-Уилка. В зависимости от
распределения данных использовали следующие методы
статистического анализа: однофакторный дисперсионный анализ
(One-Way ANOVA) либо ранговый однофакторный дисперсионный
анализКраскела-Уоллисаспоследующимприменением
апостериорных (post hoc) критериев (t критерия Стьюдента с
поправкой Бонферрони либо критерия Дана).
В третьей главе представлены результаты собственных
исследований изучения психотропной активности адамантановых
производных ГАМК и альфа-пирролидона. В ходе проведенного
фармакологического скрининга среди исследуемых соединений
были выявлены наиболее активные под лабораторными шифрами
ВКМ-22 (4-(адамантан-1-ил)-4-аминобутановая кислота) и TIM-2 (1-
(адамантан-1-ил)пирролидин-2-он), которые обладают выраженной
антидепрессантной активностью в тестах подвешивание мышей за
хвост и принудительное плаванье по Porsolt, антифобической
активностью в условиях переменной стрессогенности теста ПКЛ, а
также ноотропными свойствами по результатам теста Условная
реакция пассивного избегания и теста Экстраполяционного
избавления.
Послепроведённогоскрининговогоисследования
осуществлялось изучение острой токсичности наиболее активных
соединений, так показатель LD50 для соединения ВКМ-22 составлял
2860±128 мг/кг, а для соединения TIM-2 1820 ±205 мг/кг.
В четвертой главе представлены результаты углубленного
изучения антидепрессантной активности исследуемых соединений
ВКМ-22 и TIM-2 на модели социальной депрессии (Таблица 2 и
Таблица 3).

Таблица 2. Показатели поведения животных в тесте «Открытое
поле», «принудительное плаванье по Porsolt», «подвешивание за
хвост» и «социальное взаимодействие» до и после лечения
ГруппыИнтактДепрессияДепрессияДепрессияДепрессия
+физ.р-р+ВКМ-22+TIM-2+Имипрамин
Тест «принудительного плаванья по Porsolt». Продолжительность иммобилизации в секундах

До154±12421±15#395±12434±15403±11
лечения
После240±10397±58#113±6*242±18*138±12*
лечения
Тест «подвешивание за хвост. Продолжительность иммобилизации в секундах

До208±12287±16#421±13396±21423±27
лечения
После205±7475±10#125±10*422±45130±8*
лечения
Тест «социального взаимодействия». Количество подходов к партнеру.

До5,7±0,31,4±0,2#2,1±0,31,8±0,41,4±0,2
лечения
После7,6±0,60,9±0,1#5,8±0,5*2±0,6*2,9±0,2*
лечения
Продолжительность взаимодействия с партнером в секундах. Тест «социального
взаимодействия»
До23,8±1,83,9±0,4#4±0,63,8±0,34±0,4
лечения
После18,4±22±0,3#12,8±0,7*2,4±0,67,1±0,6*
лечения
Количество пересеченных квадратов. Тест «Открытое поле»

До69,8±2,36,5±1,8#3,8±0,74±0,86,4±1
лечения
После43,6±3,94±2,3#51,6±4,3*26±9*41,2±4,5*
лечения
Ориентировочно-исследовательская активность (сумма стоек и норок). Тест «Открытое
поле»
До18,3±1,80,3±0,2#0,1±0,10,4±0,30,4±0,2
лечения
После3,3±0,50,3±0,2#12,3±1,2*5±2*7,2±1,4*
лечения
Примечание: * – отличия от группы «Депрессия+физ. р-р» статистически
значимы (р<0,05, критерий Краскелла-Уоллиса с постобработкой критерием Дана); # - отличия от группы интакт статистически значимы (р <0,05, критерий Манна-Уитни); Таблица 3. Показатели поведения животных в тесте приподнятый крестообразный лабиринт до и после лечения Латентный период выхода в открытый рукав (ПКЛ, сек) ИнтактДепрессияДепрессияДепрессияДепрессия +физ.р-р+ВКМ-22+TIM-2+Имипрамин До92±28,5169±11#180±0180±0164,1±15,9 лечения После107,9±28,6180±0#78,9±29,9*123±22*161,3±3 лечения Продолжительность нахождения в открытых рукавах (ПКЛ, сек) До23,2±123,1±3,1#0±00±00,2±0,2 лечения После12,1±6,70±0#28,3±9,8*31±11*3,4±3,4 лечения Продолжительность нахождения в центральной зоне (ПКЛ, сек) До37,6±3,8161,1±7,4#141,1±18148±13128,2±18,8 лечения После31,7±2,4102,8±29,7#33,6±4,6*74±9*47,9±3,8* лечения Количество пересечений центральной зоны (ПКЛ) До5,9±0,52,1±0,5#2,3±0,42,7±0,33±0,2 лечения После3,8±0,30,5±0,2#4,9±0,4*3,8±0,5*4,9±0,4* лечения Продолжительность нахождения в закрытых рукавах (ПКЛ, сек) До119±13,615,8±6,1#38,9±1832±1651,6±18,8* лечения После136,2±7,477,3±29,7#118,1±10,9*75±23128,7±2,8* лечения Количество стоек в закрытых рукавах (ПКЛ) До4,2±0,80±0#0±00±00±0 лечения После2,6±0,20±0#2,8±0,3*0±02,4±0,3* лечения Примечание: * - отличия от группы «Депрессия+физ. р-р» статистически значимы (р<0,05, критерий Краскелла-Уоллиса с постобработкой критерием Дана); # - отличия от группы интакт статистически значимы (р<0,05, критерий Манна-Уитни); 20-дневная социальная конфронтация, построенная на основе сенсорного контакта, вызывает у животных (испытывающих постоянные неудачи и хронический стресс) подавленные состояния, снижение реактивности и активности в виде «выученной беспомощности» и «поведенческого отчаяния». Исследуемое адамантановое производное ГАМК, соединение BKM-22, при курсовом введении животным с депрессий, более эффективно, чем препарат сравнения имипрамин устраняло проявлениедепрессии,восстанавливалодвигательнуюи исследовательскую активность и более выраженно снижало тревогу, а также нормализовало социализацию депрессированных животных. Исследуемоеадамантановоепроизводноеальфа- пирролидона, соединение TIM-2 обладало антидепрессантной активностью в условиях социальной депрессии вызванной ежедневными конфронтациями, однако полученные результаты уступали препарату сравнения имипрамину и исследуемому адамантановому производному ГАМК (ВКМ-22). В пятой главе представлены результаты терапевтического эффекта производного ГАМК ВКМ-22 и альфа-пирролидона (TIM-2) в условиях экспериментальной ишемии головного мозга и проведена оценка влияния терапии на выраженность неврологического дефицита на фоне нарушения мозгового кровообращения (Рисунок 3), а также на тревожно-депрессивное состояние у животных на фоне хронического нарушения мозгового кровообращения (Рисунок 4). Исследуемое адамантановое производное ГАМК (ВКМ-22) и альфа-пирролидона (TIM-2), которые вводили животным на протяжении 7 суток, спустя 24 часа после перевязки общих сонных артерий статистически значимо снижали выраженность сенсорных, моторных и когнитивных нарушений на сопоставимом с референтным препаратом (цитиколин) уровне (Рисунок 3). Рисунок 3. Двигательная и ориентировочно-исследовательская активность животных в тесте Открытое поле (А), время удержания на вращающемся стержне в тесте Ротарод (Б), время обнаружения и снятия стикера в Адгезивном тесте (В) и индекс дискриминации в тесте распознавание нового объекта (Г) При курсовом введении в условиях хронического нарушения мозгового кровообращения, адамантановое производное ГАМК (ВКМ-22) и альфа-пирролидона (TIM-2) способствуют снижению выраженности тревожной и депрессивной симптоматики, а также восстановлению социализации животных на фоне ХНМК (Рисунок 4). Рисунок 4. Продолжительность нахождения в открытых рукавах в тесте ПКЛ (А), продолжительность иммобилизации в тесте Porsolt (Б), продолжительность нахождения животных в левой камере с социальным объектом (В) и правой камере с несоциальным объектом (Г) в Трехкамерном социальном тесте Вшестойглавеотраженырезультаты нейрофармакологическогоанализавзаимодействияс нейротрансмиттерными системами ЦНС (Таблица 4). Для соединения ВКМ-22 было отмечено влияние на дофаминергическую систему: снижение продолжительности каталепсиипривведениигалоперидолаиповышение продолжительности вертикализации при введении апоморфина. Также для соединения ВКМ-22 было выявлено незначительное влияние на систему ГАМК. Полученные результаты позволяют предположить, что механизм антидепрессантного действия производного ГАМК с адамантильным заместителем в гамма-положении – соединение ВКМ-22, связан с его взаимодействием с дофаминергической системой, а умеренная анксиолитическая активность может быть также связана с незначительным влиянием на систему ГАМК. Таблица4. ВзаимодействиесоединенияВКМ-22с агонистами/антагонистамиразличныхнейромедиаторных систем in vivo. ГруппаnРегистрируемый показатель Дофаминергическая система Продолжительность каталепсии через 120 минут после введения галоперидола, с Контроль10105,3±5,1 ВМА-22831,2±8,7* TIM-28109,9±3,9 Продолжительность апоморфиновой вертикализации, мин Контроль1035±2,2 ВМА-22854,8±3,1* TIM-2835,8±1,8 ГАМК-ергическая система Продолжительность тонических судорог при введении коразола, с Контроль1086,2±18,3 ВМА-22852,5±14,5 TIM-2834,4±6,6* Продолжительность тонических судорог при введении пикротоксина, с Контроль1076,3±5,6 ВКМ-22859,5±5,5 TIM-2823,0±2,7* Холинергическая система Продолжительность тремора, вызванного введением никотина, с Контроль10302,7±7,7 ВКМ-228296,7±8,1 TIM-28306,7±6,3 Продолжительность тремора, вызванного введением ареколина, с Контроль10502,8±9,2 ВКМ-228508,8±12,7 TIM-28504,1±8,6 Серотонинергическая система Среднее количество кивательных движений (гиперкинез), через 30 минут после введения 5-окситриптофана Контроль1017,0±1,0 ВКМ-22818,2±0,9 TIM-2815,8±1,6 Примечание: * – различия достоверны относительно группы «Контроль» при p <0,05 (критерий Дана); n – число животных в группе. Для соединения TIM-2 было отмечено влияние на систему ГАМК: при введении коразола и пикротоксина у животных, получивших TIM-2, отмечалось сокращение продолжительности тонических судорог в сравнении с контрольной группой. Учитывая связь судорожного действия коразола и пикротоксина с подавлением тормозящей функции ГАМК, можно предполагать, что выявленные психотропные свойства соединения TIM-2 обусловлены активацией ГАМК-ергической системы. В ходе дальнейшего исследования для соединения TIM-2 не было выявлено взаимодействия с дофаминергической, холинергической и серотонинергической системами. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, в результате исследования психотропной активности ряда адамантановых производных ГАМК и альфа- пирролидона было выявлено низкотоксичное соединение ВКМ-22 (4-(адамантан-1-ил)-4-аминобутановаякислота),которое посредством активирующего влияния на дофамин- и ГАМК- ергическуюсистемупроявлялоанксиолитическую, антидепрессантную и ноотропную активность у интактных животных, а также в условиях экспериментальной депрессии и при нарушении мозгового кровообращения. Полученные данные свидетельствуют о целесообразности дальнейшего углубленного изучения его терапевтического потенциала с целью разработки нового лекарственного препарата для лечения тревожно- депрессивных и когнитивных расстройств. ВЫВОДЫ 1. Среди новых адамантановых производных ГАМК и альфа- пирролидона выделено соединение с адамантаном в гамма- положении ГАМК (ВКМ-22), обладающее выраженной антидепрессантной, ноотропной и умеренной анксиолитической активностью, а также производное альфа-пирролидона с адамантаном в первом положении (TIM-2), обладающее выраженной анксиолитической, умеренной антидепрессантной и ноотропной активностью. 2. Адамантановые производные ГАМК и альфа-пирролидона при однократном пероральном введении обладают низкой токсичностью (LD50 составляло 2860±128 мг/кг и 1820±205 мг/кг для ВКМ-22 и TIM-2 соответственно). 3. Адамантановое производное ГАМК (ВКМ-22) обладает выраженной антидепрессантной активностью при курсовом введении в условиях социальной депрессии. Антидепрессантное действие ВКМ-22 было сопоставимо с таковым у имипрамина, но при этом соединение ВКМ-22 также способствовало снижению выраженности тревоги и повышению уровня социализации животных. 4. У животных, с экспериментальной ишемией головного мозга, курсовое введение адамантанового производного ГАМК (ВКМ- 22) и альфа-пирролидона (TIM-2) выраженно снижали сенсорно- моторные, тревожно-депрессивные, когнитивные нарушения и способствовали повышению социализации животных. 5. Адамантановое производное ГАМК (ВКМ-22) реализует свои фармакологические эффекты посредством стимулирующего влияния на дофамин- и ГАМК-ергическую систему, а адамантановоепроизводноеальфа-пирролидона(TIM-2) реализует свои эффекты посредством стимулирующего влияния на ГАМК-ергическую систему. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Целесообразно продолжить дальнейший поиск соединений с различными психотропными свойствами в ряду адамантановых производных ГАМК и альфа-пирролидона с различными заместителями. 2. Соединения ВКМ-22 (4-(адамантан-1-ил)-4-аминобутановая кислота) и TIM-2 (1-(адамантан-1-ил)пирролидин-2-он) являются перспективными для дальнейшего углубленного изучения, с целью разработки на их основе лекарственных средств, обладающихантидепрессантным,противотревожными ноотропным действием.