Оглавление
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Аналитические методы определения простагландинов и их производных ………………..16

1.1.1. Иммунохимические методы …………………………………………………………………………….16
1.1.2. Хроматографические методы …………………………………………………………………………..17
1.2. Пробоподготовка биологических образцов ……………………………………………………………..26

1.3. Валидация методик определения эндогенных соединений в биологических матрицах32

1.3.1. Селективность …………………………………………………………………………………………………32
1.3.2. Калибровочный диапазон…………………………………………………………………………………32
1.3.3. Эффект переноса ……………………………………………………………………………………………..34
1.3.4. Правильность и прецизионность ………………………………………………………………………34
1.3.5. Эффект матрицы ……………………………………………………………………………………………..34
1.3.6. Степень извлечения …………………………………………………………………………………………36
1.3.7. Стабильность …………………………………………………………………………………………………..36
1.4. Фармакокинетическая характеризация биогенных препаратов …………………………………37

1.5. Изучение метаболизма ЛС на основе эндогенных соединений …………………………………38

1.6. Метаболомных подходов для изучения безопасности и эффективности ЛС ……………..42

ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 1
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Реактивы и оборудование ……………………………………………………………………………………….49

2.1.1. Стандартные образцы ………………………………………………………………………………………49
2.1.2. Реактивы …………………………………………………………………………………………………………49
2.1.3. Приготовление растворов и буферов ………………………………………………………………..50
2.2. Изучение метаболизма нитропростона в условиях in vitro………………………………………..59

2.2.1. Дизайн эксперимента……………………………………………………………………………………….59
2.2.2. Подготовка образцов ……………………………………………………………………………………….59
2.2.3. Проведение инструментального анализа…………………………………………………………..60
2.3. Фармакометаболомное профилирование …………………………………………………………………61

2.3.1. Дизайн эксперимента……………………………………………………………………………………….61
2.3.2. Нецелевое фармакометаболомное профилирование ………………………………………….62
2.3.2.1. Подготовка биологических проб ………………………………………………………………………62
2.3.2.2. Инструментальный анализ ……………………………………………………………………………….62
2.3.2.3. Контроль качества……………………………………………………………………………………………63
2.3.2.4. Предобработка данных и создание матрицы признаков …………………………………….63
2.3.2.5. Целевое фармакометаболомное профилирование нитропростона ……………………..64
2.3.2.6. Подготовка биологических проб ………………………………………………………………………64
2.3.2.7. Инструментальный анализ ……………………………………………………………………………….64
2.3.3. Статистическая обработка ……………………………………………………………………………….69
2.3.4. Целевое фармакометаболомное профилирование простанита……………………………70
2.4. Методика количественного определения нитропростона и его метаболитов …………….75

2.4.1. Подготовка биологических образцов ………………………………………………………………..75
2.4.2. Инструментальный анализ ……………………………………………………………………………….75
2.4.3. Расчет основных фармакокинетических параметров …………………………………………76
2.5. Методики количественного определения простанита и его метаболитов ………………….77

2.5.1. Подготовка биологических образцов ………………………………………………………………..77
2.5.2. Инструментальный анализ ……………………………………………………………………………….77
2.5.3. Фармакокинетические исследования ………………………………………………………………..78
2.6. Валидация методов …………………………………………………………………………………………………78

ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ МЕТАБОЛИЗМА НИТРОПРОСТОНА И ПРОСТАНИТА

3.1. Исследование метаболизма нитропростона в условиях in vitro …………………………………81

3.1.1. Определение продуктов биодеградации в условиях in vitro……………………………….81
3.1.2. Инкубация нитропростона с биологическими образцами животных и человека ..83
3.2. Метаболомное профилирование эндогенных метаболитов образцов плазмы крови
кроликов после в/в введения ЛС на основе натуральных простагландинов ………………………….86

3.2.1. Результаты нецелевого широкоформатного метаболомного профилирования
эндогенных метаболитов плазмы кроликов после в/в введения нитропростона ………………..86
3.2.2. Результаты целевого метаболомного профилирования ……………………………………..90
3.2.3. Исследование метаболизма нитропростона в условиях in vivo …………………………..92
3.2.4. Определение метаболических путей, ассоциированных с введением
нитропростона ………………………………………………………………………………………………………………..93
3.2.5. Выявленный механизм действия нитропростона ………………………………………………95
3.2.6. Описание метаболических путей, ассоциированных с введением нитропростона 95
3.2.7. Выявленные эндогенные маркеры эффективности нитропростона ……………………96
3.3. Целевое метаболомное профилирование эндогенных метаболитов по трем
метаболомным панелям после в/в введения простанита ………………………………………………………97

3.3.1. Результаты целевого метаболомного профилирования в соответствии с тремя
метаболомными панелями ………………………………………………………………………………………………97
3.3.2. Исследование метаболизма простанита в условиях in vivo ………………………………100
3.3.3. Визуализация метаболических путей, связанных с введением простанита……….101
3.3.4. Выявленные маркеры токсичности и эффективности простанита ……………………103
4.1. Оптимизация условий инструментального анализа и получаемые масс-спектры при
определении ЛС на основе натуральных простагландинов и их метаболитов методом ВЭЖХ-
МС/МС ……………………………………………………………………………………………………………………………106

4.1.1. Оптимизация условий анализа ……………………………………………………………………….106
4.1.2. МС/МС спектры простанита и его метаболитов………………………………………………106
4.2. Валидация методики определения нитропростона и его основных метаболитов в
плазме кроликов ………………………………………………………………………………………………………………110

4.2.1. Селективность ……………………………………………………………………………………………….110
4.2.2. Линейность и калибровочные кривые …………………………………………………………….111
4.2.3. Нижний предел количественного определения ……………………………………………….112
4.2.4. Правильность и прецизионность …………………………………………………………………….112
4.2.5. Эффект матрицы и степень извлечения нитропростона и его метаболитов ………115
4.2.6. Стабильность …………………………………………………………………………………………………116
4.3. Установление основных фармакокинетических параметров нитропростона и его
метаболитов у кроликов при в/в введении ………………………………………………………………………..118

4.4. Разработка методики количественного определения простанита и его метаболитов в
плазме крови кроликов …………………………………………………………………………………………………….121

4.4.1. Оптимизация методики количественного определения простанита и его
метаболитов………………………………………………………………………………………………………………….121
4.5. Валидация методики количественного определения простанита и его метаболитов в
плазме крыс ……………………………………………………………………………………………………………………..123

4.5.1. Установление селективности методики ………………………………………………………….123
4.5.2. Калибровочная кривая ……………………………………………………………………………………125
4.5.3. Нижний предел количественного определения ……………………………………………….127
4.5.4. Эффект переноса ……………………………………………………………………………………………127
4.5.5. Правильность и прецизионность …………………………………………………………………….128
4.5.6. Эффект матрицы и степень извлечения исследуемого аналита ………………………..134
4.5.7. Стабильность …………………………………………………………………………………………………135
4.6. Фармакокинетическое исследование простанита в плазме крови крыс и кроликов ….138

ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ
ОБЩИЕ ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ

В процессе анализа литературных данных установлено, что основными подходами, применяемыми для количественного анализа ЛС эндогенного происхождения в биологическом материале, являются методы жидкостной хроматографии тандемной масс- спектрометрии с предварительной подготовкой биологических образцов методом жидкость-жидкостной экстракции. Изучена имеющаяся в литературе информация о метаболизме простагландинов, заключающаяся в их окислении до 15-кето и 13,14- дигидро-15кето производных. Рассмотрены ключевые методологические аспекты проведения фармакометаболомных исследований, которые необходимо учитывать при проведении нецелевого и целевого метаболомного профилирования.
Материалы и методы исследования
Материалы исследования: в работе при проведении in vitro исследования использовали
образцы крови (плазмы и цельной крови) здоровых добровольцев, полученных в биобанке Первого МГМУ им. И.М. Сеченова, а также образцы плазмы лабораторных животных – крыс породы Спрэгли-Доули и белых Новозеландских кроликов. Эксперимент по изучению in vivo метаболизма и фармакометаболомики нитропростона и простанита, а также по изучению их фармакокинетики проводили на кроликах породы Шиншилла. Установление фармакокинетических свойств простанита проводили на здоровых крысах линии Спрэгли-Доули. В работе использовали стандартные образцы нитропростона (1′,3′- динитроглицериновый эфир 11(S),15(S)-дигидрокси-9-кето-5Z,13E-простадиеновой кислоты, рисунок 1А), простанита (1,3-динитроглицериновый эфир 11(S),15(S)- дигидрокси-9-кето-13E-простаноидной кислоты, рисунок 1Б), 15-кето ПГЕ2, простагландинов (ПГЕ1, ПГБ2 и ПГЕ2) и 1,3-динитроглицерина (1,3-ДНГ) которые были предоставлены лабораторией оксилипинов ИБХ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Стандартные образцы 13,14-дигидро-15кето-ПГЕ2 и 13,14-дигидро-15- кето-ПГЕ1 были получены в Santa Cruz Biotechnology (Даллас, США). ПГЕ2-d4 – Toronto Research Chemicals (Торонто, Канада). Чистота стандартных образцов выше 99,0 %. Реактивы, использованные в ходе работы, включали в себя: ацетонитрил степени очистки
LC-MS (Panreac, Германия) муравьиную кислоту (Sigma-Aldrich, Германия), натрий- фосфатный буфер (Sigma-Aldrich, Германия), метанол степени очистки LC-MS (Merk, Германия).
В работе использовалось
следующее
сверхвысокоэффектиный
жидкостный хроматограф
соединенный с времяпролетным
масс-спектрометром высокого
разрешения, оснащенным ионной
ловушкой и источником
электроспрей ионизации
(УСВЭЖХ-ЭСИ-IT-TOF) (Shimadzu, Киото, Япония); жидкостный хроматограф высокого давления LC 30 Nexera Shimadzu Corporation (Shimadzu, Киото, Япония) c тандемным квадрупольным масс-спектрометрическим детектором LCMS-8050 (Shimadzu, Киото, Япония); жидкостный хроматограф UPLC ACQUITY с тандемным квадрупольным масс- спектрометрическим детектором Xevo TQ-S micro IVD (Waters Corporation, США). Пригодность разработанных методик оценивали на основании следующих валидационных характеристик: селективность, нижний предел количественного определения, функция отклика и калибровочный диапазон (характеристика калибровочной кривой), правильность, прецизионность, эффекты матрицы, степень извлечения аналита, перенос пробы, стабильность аналита в биологической матрице на протяжении всего периода хранения и в условиях обработки. Все работы проводили с учетом принципов надлежащей лабораторной практики (GLP).
Результаты исследования
Диссертационная работа основана на системном подходе к анализу информации с включением гипотетических и формализационных методов. Эмпирические исследования базировались на методах анализа и обобщения, выключающих в себя типичные приемы сравнения, измерения и описания. Анализ большого числа качественных и количественных факторов требовал применения передовых вероятностно-статистических подходов, на основе машинного обучения, кластеризации и предиктивного моделирования.
На первом этапе исследования изучали пути биодеградации нитропростона в условиях in vitro. Анализ образцов плазмы крыс после инкубации с нитропростоном в течение одного часа методом ВЭЖХ-МС/МС высокого разрешения продемонстрировал
оборудование:
А. Б.
–– OO
++ NN
OOO OOO ++
O N O–
OO OO
O N O– CH3
OO
HO OH
HO
OH
CH3
Рисунок 1. А – химическая структура нитропростона; Б – химическая структура простанита.
формирование двух основных метаболитов нитропростона – 1,3-ДНГ и ПГЕ2. В свою очередь, выявлено, что ПГЕ2 подвергается дальнейшей дегидратации, приводящей к образованию ПГБ2. Присутствие данных метаболитов было подтверждено с использованием стандартных образцов. Инкубация нитропростона с плазмой крови крыс и кроликов привела к его быстрому гидролизу с аналогичным образованием двух основных продуктов биодеградации – 1,3-ДНГ и ПГЕ2 и двух минорных производных – ПГА2 и ПГБ2 (рисунок 2 и 3, соответственно). Формирование ПГА2 было незначительным, тогда как концентрация ПГБ2 увеличивалась во времени.
Рисунок 2 – In vitro распад нитропростона ( ) и изменение концентрационных уровней его метаболитов 1,3-ДНГ ( ), ПГЕ2 ( ),ПГА2 ( )иПГБ2 ( ) во времени в плазме крыс
Рисунок 3 – In vitro распад нитропростона ( ) и изменение концентрационных уровней его метаболитов 1,3-ДНГ ( ), ПГЕ2 ( ),ПГА2 ( )иПГБ2 ( ) во времени в плазме кроликов
При инкубации нитропростона в плазме крови человека его концентрация оставалась стабильной первые десять минут и далее постепенно понижалась в течение двух часов. Однако инкубация нитропростона с цельной кровью человека приводила к быстрому распаду ЛС до 1,3-ДНГ и ПГЕ2, что связано с ферментативной активностью клеток крови. Таким образом, на основе разработанной методики in vitro изучения метаболизма нитропростона можно сделать вывод о его быстрой биодеградации в плазме крови лабораторных животных и о формировании эндогенных продуктов метаболизма.
На втором этапе работы проводили нецелевое и целевое метаболомное профилирование эндогенных метаболитов в образцах плазмы крови кроликов после внутривенного введения нитропростона в целях установления его метаболизма, а также
поиска потенциальных маркеров токсичности и эффективности. Для этого сравнивали изменения уровней эндогенных метаболитов тестовой группы кроликов, которой вводили 250 мкг/кг раствора ЛС, с группой контроля, где кроликам вводили равный объем физиологического раствора. Образцы крови отбирали до введения ЛС и через 2,4, 8, 12, 18, 24, 32 и 60 минут после. Анализ полученных образцов выполняли методами нецелевого и целевого метаболомного профилирования.
В результате нецелевого метаболомного профилирования были выявлены и идентифицированы те метаболиты, чей концентрационный уровень значительно изменился после внутривенного введения нитропростона. Наиболее полно были задействованы следующие метаболомные пути: метаболизм пуринов, стероидогенез, распад гомоцистеина, рециклизация аммиака, метаболизм аргинина и пролина. Для количественной оценки измененных метаболитов, а также изучения метаболизма нитропростона проводили целевое профилирование образцов крови кроликов по следующим метаболомным панелям: стероиды, аминокислоты, пурины и простагландины. На основе изученного профиля простагландинов был определен метаболизм нитропростона in vivo. Объединив результаты in vitro и in vivo исследований нитропростона, была составлена схема его метаболизма, представленная на рисунке 4.
Рисунок 4 – Предполагаемая схема метаболизма нитропростона
В результате целевого профилирования установлены эндогенные метаболиты,
которые в крови кроликов статистически значимо (p-value < 0.05) повышались или понижались в ответ на введение нитропростона (таблица 1). Ранее было установлено, что астма ассоциирована с пониженными уровнями мочевой кислоты, серина и аспартата, чей уровень в тестовой группе кроликов значительно повышался. Одновременно, активация стероидогенеза, приводящая к повышению содержания кортикостероидов, оказывает мощное противовоспалительное действие. Таблица 1. Метаболиты, повышенные после введения нитропростона Измене ние ̄ ̄ ̄ ̄ ̄ ПГЕ2 воздействует на аденилатциклазу, катализируя образование циклического аденозин монофосфата (цАМФ) и аденозина, которые в легочной ткани обладают сосудорасширяющим действием. Также ранее было установлено, что аденозин усиливает стероидогенез, увеличивая содержание кортикостероидов в крови, что согласуется с выявленными в работе данными метаболомного профилирования. Кроме того, высвобождающийся оксид азота активирует образование циклического гуанозин монофосфата (цГМФ), а цГМФ аналогично цАМФ обладает вазодилатирующим эффектом, усиливающим эффект нитропростона. Описанный механизм действия подтверждается значительным повышением концентрации мочевой кислоты в тестовой группе кроликов, являющейся конечным продуктом распада пуринов. Таким образом, в результате нецелевого и целевого метаболомного профилирования в работе изучен метаболизм нитропростона в условиях in vivo, и установлены основные маркеры эффективности ЛС. Метаболит Кортизол p-value В целом, существующие на сегодняшний день противоастматические лекарственные средства преимущественно действуют в соответствии с одним из двух известных механизмов, оказывая бронхолитическое или противовоспалительное действие, в то время как нитропростон одновременно влияет на обе мишени, эндогенно воздействуя на стероидогенез и метаболизм пуринов. На основе полученных данных можно сделать вывод, что механизм действия нитропростона связан с его быстрой деградацией, приводящей к высвобождению ПГЕ2 и оксида азота. Кортизон 21-дезоксикортизол Кортикостерон Дезоксикортикостерон Прогестерон Серин Аспартат Гуанин Гуанозин Инозин Аденин Ксантуреновая к-та 3.93 e-10 1.46 e-8 5.03 e-10 1.96 e-9 2.19 e-6 5.91 e-6 4.87 e-4 1.46 e-5 1.75 e-7 5.27 e-18 2.03 e-18 0.011 0.017 14 Третий этап работы посвящен разработке методик целевого метаболомного профилирования образцов плазмы кроликов после введения простанита. Профилирование проводили на двенадцати кроликах, шести из которых вводили 40 мкг/кг простанита, а оставшимся – равный объем физиологического раствора. Отбор образцов крови выполняли до введения ЛС и через 2, 4, 6, 8, 12, 18, 24, 32, 40, 48 и 60 минут после. Метаболомное профилирование проводили по метаболомным панелям аминокислот, пуринов и пиримидинов, стероидов и простагландинов. На основе профилирования панели простагландинов была предложена схема метаболизма простанита в условиях in vivo (рисунок 5). Было установлено, что простанит подвергается быстрому распаду с образованием 1,3-ДНГ и ПГЕ1. ПГЕ1 далее метаболизирует до 15-кето ПГЕ1 и 13,14-дигидро-15кето-ПГЕ1. Изменения в концентрационных уровнях выявленных эндогенных метаболитов свидетельствуют о возможных положительных и отрицательных эффектах воздействия ЛС (таблица 2). Повышенный уровень пуринов указывает на вазодилатирующий эффект простанита. Повышение концентрационных уровней аланина, карнозина и изолейцина связано с общим снижением воспаления и активацией защитной системы. Одновременно, наблюдаемые изменения в концентрационных уровнях 4-гидроксипролина, аспартата и глицина свидетельствуют о Рисунок 5 – Схема метаболизма простанита в плазме крови кроликов Таблица 2. Метаболиты, измененные после введения простанита Изменение Повышенные Аланин Пролин 4-гидроксипролин Изолейцин Фенилаланин Г АМК Аминоизомасляная к- та p-value 0.019 1.49e-5 7.44e-8 3,86e-3 6,57e-4 0.035 3.49e-6 4.04e-7 1.08e-10 7.73e-7 2,71e-4 0.031 4,15е-4 5.55e-11 5.55e-11 4.67e-4 Карнозин Кортикостерон Андростерон Аденозин Гуанозин ̄ Тестостерон ̄ Кортизол ̄ Аспартат ̄ Глицин 15 ряде побочных эффектов простанита, представляя собой потенциальные эндогенные маркеры токсичности. Таким образом, применение методов целевого метаболомного профилирования в исследовании простанита позволило изучить его метаболизм, а также влияние на метаболические пути. В целом примененный в работе фармакометаболомный подход является альтернативным инновационным методом, позволяющим наиболее полно изучить как метаболизм изучаемых ЛС, так и их воздействие на метаболические пути. Такие исследования являются в особенности актуальными при рассмотрении мультицелевых эндогенных ЛС на основе натуральных простагландинов, где установление метаболизма и механизмов действия является затрудненным. Несмотря на быструю биодеградацию нитропростона и простанита, полученные метаболомные результаты подтверждают их воздействие на организм через статистически значимые изменения эндогенных метаболитов. На четвертом этапе исследования проводили разработку и апробацию методики количественного определения нитропростона и его метаболитов в плазме крови кроликов. При разработке методики были оптимизированы условия пробоподготовки и инструментального анализа. Пробоподготовка образцов плазмы представляла собой жидкость-жидкостную экстракцию этилацетатом. Хроматографическое разделение исследуемых аналитов выполняли на колонке Shim-pack FC-ODS 2мкм x 150 мм (Shimadzu, Киото, Япония). Подвижная фаза А представляла собой 0,1 % раствор муравьиной кислоты, а фаза Б – 100 % ацетонитрил (степени очистки «Для хроматографии»). Градиентное элюирование проводили по следующей программе: 0 мин – 20 % Б, 15 мин – 60 % Б, 20 мин – 95 % Б, 25 мин – 20 % Б, 30 мин – 20 % Б, при объеме вводимой пробы составил 3 мкл. Ионизацию молекул выполняли методом электрораспылительной ионизации с нагреваемым потоком распыляющего газа. Температура нагревающего газа составляла 400 oС; температура десольватации – 250 oС; температура интерфейса – 300 oС; скорость потока газа-распылителя – 3 л/мин; скорость потока газа нагревателя – 10 л/мин; скорость потока газа-осушителя – 10 л/мин; режим сбора данных – мониторинг выбранных реакций (МВР). Результаты оценки основных валидационных характеристик разрабатываемой методики представлены в таблице 3. Таблица 3 –Валидационные характеристики методики количественного определения нитропростона в плазме крови кроликов Параметр Селективность и эффект переноса Предел обнаружения (НПКО) и линейный диапазон Прецизионность Правильность Стабильность Степень извлечения Эффект матрицы Результат На хроматограммах среды для разведения пиков не обнаружено. Эффект переноса отсутствует Аналит Нитропростон 1,3 - ДНГ ПГЕ2 ПГ А2 ПГB2 13,14-дигидро-15-кето-ПГE2 НПКО 0.1 нг/мл 0.01 нг/мл Линейный диапазон 0.1-100 нг/мл 0.01-100 нг/мл <15 % 93-104 % Более 90 % Более 90 % Менее 10 % В результате исследования установлено, что разработанная методика может быть использована в клинических исследованиях сравнительной фармакокинетики ЛС, содержащих в своем составе нитропростон, с целью регистрации и внедрения в медицинскую практику на территории Российской Федерации. Разработанную методику применяли для установления фармакокинетики нитропростона. В силу активного метаболизма его определение в плазме кроликов было невозможно уже через 2 минуты после внутривенного введения ЛС кроликам в дозе 0,25 мг/кг. Однако достоверные фармакокинетические профили были получены для 1,3-ДНГ и 13,14-дигидро-15кето-ПГЕ2 (рисунок 6 и 7, соответственно). Одновременно изменения в Таблица 4 – Фармакокинетические параметры метаболитов нитропростона в плазме крови кроликов после внутривенного введения концентрационных уровнях других производных (ПГЕ2, 15кето-ПГЕ2, ПГБ2) не обладали значимыми различиями в силу высокой вариативности полученных результатов. Основные фармакокинетические параметры метаболитов нитропростона 1,3-ДНГ и 13,14-дигидро-15кето-ПГЕ2 Параметры фармакокинетики Смакс[нг/мл] Tmax[мин] T1/2[мин] 1,3-ДНГ 36.5±12.4 4.0±2.0 46.4±8.5 13,14- дигидро- 15кетоПГЕ2 18.4±1.7 2.0±1.1 29.7±6.7 AUC0→∞[нг/мл×мин] 927.0±218.1 298.8±59.1 AUC0→t[нг/мл×мин] 650.1±147.3 247.8±52.6 MRT[мин] 50.8±7.9 31.2±6.1 представлены в Максимальная таблице 4. концентрация 17 метаболита 13,14-дигидро-15кето-ПГЕ2 составила 18,4 нг/мл и достигалась уже через две минуты после внутривенного введения ЛС. 70 60 50 40 30 20 10 Тестовая группа Группа контроля 20 16 12 8 4 0 0 10 20 30 40 50 60 Время, мин Рисунок 7 – Вариации концентраций 13,14- дигидро-15-кето-ПГЕ2 относительно средних значений в плазме крови кроликов после однократного внутривенного введения нитропростона 0 10 20 30 40 50 60 Время, мин Рисунок 6 - Вариации концентраций 1,3-ДНГ относительно средних значений в плазме крови кроликов после однократного внутривенного введения нитропростона На пятом этапе работы разрабатывали методику количественного определения простанита и его метаболитов в плазме крови кроликов, а также применяли ее при фармакокинетическом исследовании ЛС. Параметры пробоподготовки и инструментального анализа методики были полностью оптимизированы. Подготовка образцов проводилась методом жидкость-жидкостной экстракции этилацетатом. Разделение проводили на колонке Shim-pack FC-ODS 2мкм, 150 мм (Shimadzu, Киото, Япония). Подвижная фаза А представляла собой 0,1 % раствор муравьиной кислоты, а фаза Б – 100 % ацетонитрил. Градиентное элюирование проводили по следующей программе: 0 мин – 20 % Б, 15 мин – 60 % Б, 20 мин – 95 % Б, 25 мин – 20 % Б, 30 мин – 20 % Б, при объеме вводимой пробы составил 3 мкл. Ионизацию молекул проводили методом электрораспылительной ионизации с нагреваемым потоком распыляющего газа. Температура нагревающего газа, десольватации и интерфейса – 400 oС, 250 oС и 300 oС, соответственно; скорость потока газа-распылителя и скорость потока газа нагревателя – 10 л/мин и 3 л/мин, соответственно; режим сбора данных – МВР. Результаты оценки основных валидационных характеристик разрабатываемой методики представлены в таблице 5. Экспериментально установлено, что простанит в неизмененном виде отсутствовал в образцах плазмы крови крыс и кроликов уже в первой временной точке из-за высокой скорости его биотрансформации. Концентрация, нг/мл Концентрация, нг/мл Таблица 5 – Основные валидационные характеристики методики количественного определения нитропростона в плазме крови крыс и кроликов Селективность и эффект переноса Предел обнаружения (НПКО) и линейный диапазон Прецизионность Стабильность Степень извлечения На хроматограммах среды для разведения пиков не обнаружено. Эффект переноса отсутствует Метаболит Простанит 1,3 - ДНГ ПГЕ1 13,14-дигидро- 15-кето-ПГE1 НПКО 0.05 нг/мл Менее 13 % Более 89 % Более 95 % Линейный диапазон 0,05 - 10,0 нг/мл 0,05 - 100,0 нг/мл 0,05 - 10,0 нг/мл 0,05 - 10,0 нг/мл Эффект матрицы Менее 5 % Основными продуктами распада простанита, регистрируемыми в плазме крови крыс и кроликов, являлись: метаболит, образованный гидролизом сложноэфирной связи – 1,3-ДНГ, а также производное эндогенного простагландина ПГЕ1 - 13,14-дигидро-15-кето- ПГЕ1. Оба метаболита прослеживались в плазме крови грызунов непродолжительное время и быстро элиминировали. На рисунке 8 и 9 представлены фармакокинетические профили 1,3-ДНГ и 13,14-дигидро-15-кето ПГЕ1 в плазме крыс, соответственно. Образование 1,3-ДНГ происходило сразу после внутрибрюшинного введения простанита крысам и достигало своего максимума через 8 минут. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Тестовая группа Группа контроля 3,5 0 10 20 30 40 50 60 Время, мин 0 10 20 30 40 50 60 Время, мин Рисунок 8. Вариации концентраций 1,3- ДНГ относительно средних значений в плазме крови крыс после однократного в/б введения простанита в дозе 100 мг/кг Рисунок 9. Вариации концентраций 13,14- дигидро-15-кето-ПГЕ1 относительно средних значений в плазме крови крыс после однократного в/б введения простанита в дозе 100 мкг/кг Концентрация, нг/мл Концентрация, нг/мл Элиминирование 1,3-ДНГ из плазмы крови крыс происходило с высокой скоростью, о чем свидетельствует короткий период его полувыведения – 21,6 мин. В то же время формирование метаболита ПГЕ1, 13,14-дигидро-15-кето-ПГЕ1 в плазме крыс наблюдалось сразу после внутрибрюшинного введения простанита, о чем свидетельствовал максимум его концентраций, регистрируемый уже в первой временной точке эксперимента (2 мин) и равный 2,413 нг/мл. Снижение концентраций 13,14-дигидро- 15-кето-ПГЕ1 до базового уровня контрольной группы происходило в период до 1 часа исследования, где достоверных различий между контрольной и подопытными группами животных выявлено не было. Подробная информация о фармакокинетических свойствах стабильных метаболитов простанита представлена в таблице 6. Фармакокинетические Таблица 6 – Основные фармакокинетические параметры метаболитов простанита у крыс профили стабильных метаболитов простанита – 1,3-ДНГ и 13,14- дигидро-15-кето-ПГЕ1 в плазме крови кроликов мужского и женского пола представлены на рисунке 10 и 11, соответственно. Группа контроля (самцы) Группа контроля (самки) Параметр 13,14- дигидро- 15-кето- ПГЕ1 1,3-ДНГ t1/2[мин] Tmax[мин] Cmax[нг/мл] AUC 0-60 [нг/мл×мин] AUC 0-∞ [нг/мл×мин] MRT 0-∞[мин] 10.97 8 2.413 39.376 41.1095 15.76 21.64 8 80.399 1305.979 1429.799 23.02 Тестовая группа (самцы) Тестовая группа (самки) 5 4 3 2 1 0 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 10 20 30 40 50 60 Время, мин 0 10 20 30 40 50 60 Время, мин Рисунок 10. Вариации концентраций 1,3- ДНГ относительно средних значений в плазме крови кроликов после внутривенного введения простанита в дозе 40 мг/кг Рисунок 11. Вариации концентраций 13,14-дигидро-15-кето-ПГЕ1 относительно средних значений в плазме крови кроликов после внутривенного введения простанита в дозе 40 мкг/кг. Концентрация, нг/мл Концентрация, нг/мл Образование метаболита 13,14-дигидро-15-кето-ПГЕ1 в плазме кроликов, наблюдалось сразу после в/в введения простанита, о чем свидетельствовал максимум его концентраций, регистрируемый уже в первой временной точке эксперимента. Основные фармакокинетические параметры стабильных метаболитов простанита в плазме крови самцов и самок представлены в таблице 7. Таблица 7 – Фармакокинетические параметры метаболитов простанита у кроликов Метаболит Пол t1/2[мин] Tmax[мин] Cmax[нг/мл] AUC 0- 60[нг/мл×мин] AUC 0- ∞[нг/мл×мин] MRT 0-∞[мин] 13,14-дигидро-15-кето-ПГЕ1 1,3-ДНГ Самцы 8.970±0.795 2.0 2.825±0.239 44.988±4.235 47.083±4.692 13.827±0.965 Самки 7.670±1.280 3.0±1.1 3.055±0.435 Самцы 9.356±1.808 2.333±0.816 3.948±0.762 Самки 6.744±1.617 2.333±0.816 4.278±0.717 38.729±3.142 29.171±3.790 31.362±3.507 39.851±3.449 33.724±8.305 32.251±3.363 11.514±1.708 10.428±5.797 6.418±0.947 Снижение концентраций контрольной группы происходило различий между контрольной и подопытными группами животных выявлено не было. Метаболит 1,3-ДНГ обнаруживался в плазме крови кроликов в диапазоне концентраций в среднем от 0,116 до 3,925 нг/мл у самок и от 0,090 до 4,224 нг/мл у самцов, при этом максимальные значения фиксировались уже в первой временной точке фармакокинетической кривой. Полученные данные по фармакокинетике простанита соотносятся с общим положением о быстром катаболизме простагландинов в условиях in vivo. ОБЩИЕ ВЫВОДЫ 1. В результате анализа современных подходов в исследовании фармакокинетики, метаболизма и фармакометаболомики лекарственных средств продемонстрирован потенциал методов масс-спектрометрического анализа в изучении и разработке лекарственных средств на основе натуральных простагландинов на стадии доклинических исследований. Проведен сравнительных анализ существующих методов пробоподготовки, инструментального анализа и обработки результатов, применяющихся в исследованиях метаболизма, фармакометаболомики и фармакокинетики. 2. Изучение путей биотрансформации оригинального биогенного ЛС нитропростон в условиях in vitro позволило установить, что при инкубации нитропростона в плазме 13,14-дигидро-15-кето-ПГЕ1 до базового уровня в период до 1 часа исследования, где достоверных крыс и кроликов, а также цельной крови человека происходит его быстрая биодеградация с образованием ПГЕ2 и 1,3-ДНГ. Дальнейшая изомеризация ПГЕ2 приводит к образованию метаболитов ПГА2 и ПГБ2. Было установлено, что нитропростон остается относительно стабильным при инкубации в плазме человека. 3. С целью изучения метаболизма и оценки эффективности и безопасности лекарственного средства нитропростон разработаны методики нецелевого и целевого метаболомного профилирования методом ВЭЖХ-ВРМС. Показано, что в условиях in vivo нитропростон подвергается быстрому гидролизу, приводящему к образованию 1,3-ДНГ и ПГЕ2, который далее распадается до 13,14-дигидро-15кето-ПГЕ2. На основе результатов нецелевого и целевого метаболомного профилирования установлено, что нитропростон значительно повышает эндогенные уровни кортикостероидов, мочевой кислоты, серина и аспартата, являясь маркерами эффективности нитропростона как противоастматического средства. 4. С целью изучения метаболизма, а также предварительной оценки эффективности и безопасности лекарственного средства простанит, разработаны целевые метаболомные панели (скрининг пуринов и пиримидинов, скрининг эндогенных стероидов, скрининг аминокислот) методами ВЭЖХ-МС/МС. Было установлено, что повышение концентрационных уровней аланина, карнозина и изолейцина, а также изменения в уровнях стероидов при введении простанита свидетельствовало об общем снижении воспаления, что позволяет отнести данные эндогенные метаболиты к маркерам эффективности простанита при лечении заболеваний периферических артерий. Показано, что изменения в концентрационных уровнях гидроксипролина, аспаратата и глицина ассоциированы с активацией окислительного стресса и представляют собой маркеры токсичности простанита. 5. Для количественного определения продуктов биотрансформации нитропростона и простанита разработан оптимальный способ пробоподготовки плазмы крови и оптимизированы условия инструментального анализа. Разработаны методики количественного определения основных продуктов биотрансформации нитропростона и простанита, пригодные для изучения их фармакокинетических свойств. Разработанные методики валидированы по всем валидационным критериям, указанным в руководствах по валидации биоаналитических методик. 6. Доказана пригодность разработанных методик для проведения доклинических исследований фармакокинетики лекарственных средств на основе натуральных простагландинов с целью изучения их метаболизма и предварительной оценки эффективности и безопасности. Практические рекомендации Разработанная методика количественного определения нитропростона и простанита может применяться для последующей оценки фармакокинетики и метаболизма рассматриваемых лекарственных средств на стадиях клинических исследований. Предложенный фармакометаболомный подход, включающий комбинацию методик нецелевого и целевого метаболомного профилирования, имеет перспективы дальнейшего применения при изучении эффективности и безопасности лекарственных средств. Перспективы дальнейшей разработки темы Перспектива дальнейшей разработки данной темы может заключаться в оценке метаболизма, фармакокинетики и фармакометаболомики простанита и нитропростона на этапах клинической разработки изучаемых лекарственных средств. Дальнейшее изучение предложенной тематики может быть сфокусировано на изучении механизмов действия ЛС за счет комплексной оценки их метаболомных, транскриптомных и геномных данных.

Актуальность темы исследования
Федеральная научно-техническая программа развития генетических
технологий на 2019 – 2027 годы (утвержденная постановлением Правительства
РФ от 22.04.2019 № 479) ставит перед собой задачу по формированию условий
для развития научной, научно-технической деятельности, получения и внедрения
результатов, необходимых для создания генетических технологий. Программа
фундаментальных научных исследований в Российской Федерации на
долгосрочный период (2021 – 2030 годы), утверждённая распоряжением
Правительства РФ от 31.12.2020 № 3684-р предусматривает изучение
возможностей «омиксных» технологий для разработки персонифицированной
терапии больных социально значимыми заболеваниями. «Омиксные» технологии
(геномика, протеомика, метаболомика, фармакогеномика) предоставляют
возможность проведения комплексной оценки биохимических изменений,
происходящих в организме человека при тестировании новых лекарственных
средств (ЛС). Изучение эффектов ЛС (как терапевтических, так и побочных) при
помощи метаболомных исследований заключается в быстрой
многопараметрической количественной оценке метаболических изменений во
времени в ответ на введение исследуемого ЛС. Активное развитие омиксных
технологий привело к появлению нового направления в оценке метаболизма,
безопасности и эффективности разрабатываемых ЛС, фармакометаболомики.
Фармакометаболомика направлена на изучение влияния ЛС на концентрационные
уровни эндогенных низкомолекулярных соединений, а также оценку
безопасности и токсичности разрабатываемых ЛС.
Изучение фармакокинетики и метаболизма представляет собой
необходимый этап разработки ЛС в рамках доклинической оценки эффективности
и безопасности, являющимися обязательными для их дальнейшей регистрации и
внедрения в медицинскую практику. Основные фармакокинетические
характеристики, а именно степень и скорость всасывания, особенность
распределения, метаболизма и экскреции, отражают способность ЛС
взаимодействовать со своими мишенями. В то же время выявление основных
путей метаболизма исследуемых ЛС дает возможность установить
фармакологическую активность его метаболитов, а также определить долю
вещества, подвергшегося биотрансформации.
Лекарственные препараты на основе натуральных простагландинов
применяются для лечения различных заболеваний, в том числе при повышенном
внутриглазном давлении, легочной артериальной гипертензии, эректильной
дисфункции, облитерирующем тромбангиите и ишемии нижних конечностей.
Таким образом, создание методик изучения метаболизма,
фармакометаболомики и фармакокинетики мультицелевых ЛС на основе
натуральных простагландинов является крайне актуальным.
Диссертационная работа посвящена изучению двух ЛС на основе
натуральных простагландинов – нитропростон и простанит. Нитропростон (1′,3′-
динитроглицериновый эфир 11(S),15(S)-дигидрокси-9-кето-5Z,13Е-
простадиеновой кислоты) представляет собой натуральный ПГЕ2,
модифицированный динитроглицериновым фрагментом. Он был разработан для
ингаляционного применения в качестве бронходилататора при лечении
воспалительных и обструктивных заболеваний верхних дыхательных путей.
Простанит (1′,3′-динитроглицериновый эфир 11 (S),15(S)-дигидрокси-9-кето-13E-
простаеновой кислоты) был разработан для лечения заболеваний периферических
артерий. Системное введение простанита улучшает микроциркуляцию и
периферическое кровообращение, оказывая вазопротекторное и
сосудорасширяющее действие.
Степень разработанности темы исследования
ЛС на основе натуральных простагландинов, нитропростон и простанит,
являются первыми в своем классе ЛС, направленными на мультитаргетное
воздействие на несколько мишеней в рамках одного заболевания. В проведенных
до этого исследованиях нитропростона и простанита были представлены их
фармацевтические композиции для ингаляций и методы получения. В рамках
выполнения доклинических исследований нитропростона и простанита ранее
была изучена их специфическая активность, механизм действия и безопасность, а
также острая, хроническая и специфическая токсичность.
Однако, для последующей регистрации и внедрения на фармацевтический
рынок данных ЛС необходима разработка методик их количественного
определения, направленных на изучение метаболизма и фармакокинетики. В то
же время, широкоформатное фармакометаболомное профилирование в последнее
время используется для описания токсичности и эффективности исследуемых ЛС.
Таким образом, необходимость в разработке методик количественного
определения ЛС на основе натуральных простагландинов и методик их
фармакометаболомного профилирования определило цель и задачи данного
исследования.
Целью исследования является разработка биоаналитических методик для
исследования фармакокинетики, метаболизма и фармакометаболомики
инновационных лекарственных средств на основе натуральных простагландинов
– нитропростон и простанит.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие
задачи:
1. Проанализировать современные тенденции и подходы в изучении
фармакокинетики, метаболизма и фармакометаболомики лекарственных
средств. Изучить основные методы пробоподготовки биологических
образцов и их инструментального анализа, а также обработки полученных
результатов.
2. Исследовать пути биотрансформации инновационного биогенного
лекарственного средства нитропростон в условиях in vitro для установления
его стабильности в плазме крови и межвидовой специфичности.
3. Разработать методики нецелевого и целевого метаболомного
профилирования методом ВЭЖХ-ВРМС с целью изучения метаболизма in
vivo и оценки эффективности и безопасности лекарственного средства
нитропростон.
4. Разработать и валидировать целевые метаболомные панели (скрининг
пуринов и пиримидинов, скрининг эндогенных стероидов, скрининг
аминокислот) методами ВЭЖХ-МС/МС с целью изучения метаболизма in
vivo и предварительной оценки эффективности и безопасности
лекарственного средства простанит.
5. На основании результатов изучения метаболизма разработать и
валидировать методики количественного определения нитропростона и
простанита и их основных продуктов биотрансформации, пригодных для
изучения фармакокинетических свойств.
6. Проанализировать и доказать пригодность разработанных методик для
проведения доклинических исследований лекарственных средств на основе
натуральных простагландинов с целью изучения их метаболизма и
предварительной оценки эффективности и безопасности.
Научная новизна исследования
В работе был впервые изучен метаболизм нитропростона и простанита в
плазме крови лабораторных животных, подтвержденный методом масс-
спектрометрии высокого разрешения. Разработана и валидирована методика
количественного определения продуктов распада нитропростона и простанита в
крови методом ВЭЖХ-МС/МС с высоким уровнем селективности. Разработанная
методика количественного определения позволила установить концентрационные
уровни нитропростона и простанита в плазме крови лабораторных животных для
последующего расчета фармакокинетических характеристик исследуемых ЛС.
Впервые были получены нецелевые и целевые метаболомные профили
нитропростона и простанита, позволяющие провести предварительную оценку
воздействия ЛС на основе натуральных простагландинов на организм
лабораторных животных.
Теоретическая и практическая значимость исследований
Разработаны и валидированы биоаналитические методики количественного
определения лекарственных средств нитропростон и простанит в плазме крови
лабораторных животных методом ВЭЖХ-МС/МС.
Результаты работы вошли в комплексные отчеты о доклинических
исследованиях: по Государственному контракту от 30.09.2016 № 14.N08.11.0119
«Доклинические исследования лекарственного средства на основе
динитроглицеринового эфира простагландина Е1 для лечения тяжёлых стадий
хронических облитерирующих заболеваний периферических сосудов» и
Государственному контракту от 28.08.2015 №14.N08.12.1032 «Доклинические
исследования лекарственного средства на основе NO-генерирующего
простагландина Е2 для купирования приступов бронхиальной астмы». Проведена
апробация разработанных методик при проведении доклинических исследований
лекарственных средств нитропростон и простанит в ООО «Гурус Биофарм».
В ходе проведения широкоформатного фармакометаболомного
профилирования ЛС были установлены потенциальные эндогенные маркеры
токсичности и эффективности нитропростона и простанита. Мониторинг
концентрации нитропростона и простанита в крови лабораторных животных в
соответствии с предложенной методикой позволяет установить особенности
фармакокинетики рассматриваемых ЛС с целью последующего проведения
клинических исследований. Предложенные методики могут быть рекомендованы
для количественного определения других ЛС на основе натуральных
простагландинов.
Методология и методы исследования
Методологическую основу исследования составили работы зарубежных и
российских ученых в области фармацевтической химии, а также в вопросах
доклинических исследований и разработки инновационных ЛС: Фиен О.,
Грушевской Л.Н., Темердашева А.З., Лохова П.Г., Раменской Г.В., Береговых
В.В., Вирюс Э.Д. и др. Были учтены рекомендации, представленные в
руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств
под редакцией А.Н. Миронова и Решения Совета ЕЭК от 03.11.2016 № 81 «Об
утверждении Правил надлежащей лабораторной практики Евразийского
экономического союза в сфере обращения лекарственных средств».
Применяемые в работе методы исследования базировались на результатах
изучения особенностей физико-химических свойств нитропростона и простанита,
а также их основных производных, подборе наиболее оптимальных условий
пробоподготовки и инструментального анализа. Инструментальные методы,
применявшиеся в представленной работе, включали в себя методы ВЭЖХ-
МС/МС и высокоэффективной жидкостной хроматографии – времяпролетной
масс-спектрометрии с ионной ловушкой. Предобработка результатов проводилась
с использованием программного обеспечения Shimadzu Profiling Solution
(Shimadzu, Япония), статистическая обработка данных выполнялась в
программном обеспечении SIMCA (Umetrics, Швеция), Metaboanalyst (Wishart
Research Group, Канада), PK-Solver и доступных пакетов Python.
Методики разработаны в соответствии с Государственной фармакопеей
Российской Федерации (ГФ РФ), Решением Совета ЕЭК от 03.11.2016 № 78 «О
правилах регистрации и экспертизы лекарственных средств для медицинского
применения», Решением Коллегии ЕЭК от 17.07.2018 № 113 «Об утверждении
Руководства по валидации аналитических методик проведения испытаний
лекарственных средств», руководством ICH Q2(R1) «Validation of Analytical
Procedures: Text and Methodology», руководствами FDA и EMA.
Основные положения, выносимые на защиту

– результаты in vitro исследования метаболизма нитропростона;
– результаты предварительной оценки токсичности и эффективности
нитропростона и простанита на основе нецелевого и целевого
метаболомного профилирования;
– результаты in vivo исследования метаболизма нитропростона и простанита;
– результаты разработки биоаналитических методик количественного
определения нитропростона и простанита и их основных метаболитов в
образцах плазмы крови животных методом ВЭЖХ-МС/МС;
– результаты фармакокинетического исследования основных метаболитов
нитропростона и простанита.
Достоверность результатов научных положений и выводов
Достоверность представленных в работе результатов подтверждается
необходимым объемом экспериментального материала; достаточным
количеством повторных измерений, выполненных на поверенном оборудовании, а
также достаточным количеством повторов экспериментов, необходимых для
получения статистически значимых результатов; использованием лабораторных
животных, полученных из сертифицированных питомников; использованием
установленных в ГФ РФ и руководствах ЕЭК, ICH, FDA и EMA методов
исследований; применением корректных методик статистической обработки
данных.
Апробация результатов исследования
Основные положения работы и результаты диссертационного исследования
доложены на: XXVIII International Symposium on Pharmaceutical and Biomedical
Analysis (Мадрид, 2017), VII Всероссийской конференции с международным
участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы» (Москва, 2017), 4th
World Congress & Expo on Pharmaceutics and Drug Delivery Systems (Милан, 2019),
Conference MS-based untargeted proteomics and metabolomics: cancer metabolism,
therapeutic targets and biomarkers (Верона, 2019), MSACL 2019 EU 6th European
Congress & Exhibition (Зальцбург, 2019), VIII Всероссийской конференции с
международным участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы»
(Москва, 2019), IV Всероссийской конференции с международным участием
«Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (Ольгинка, 2020).
Апробация результатов диссертации состоялась на межкафедральной
конференции кафедры промышленной фармации Института профессионального
образования, кафедры фармакологии, кафедры фармацевтической и
токсикологической химии имени А.П. Арзамасцева, кафедры аналитической,
физической и коллоидной химии Института фармации имени А.П. Нелюбина,
лаборатории фармакокинетики и метаболомного анализа Института
трансляционной медицины и биотехнологии, Центра «Цифрового биодизайна и
персонализированного здравоохранения» ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М.
Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), группы компаний
Новартис, ООО «Гурус Биофарм», НИЦ эпидемиологии и микробиологии им.
Н.Ф. Гамалеи и Института проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцева
РАН, протокол № 03 от 15.10.2021 года.
Личный вклад автора
Автор лично сформулировал идею и гипотезу диссертационного
исследования, разработал его детализированный план. Автору принадлежит
ведущая роль в проведении экспериментальных исследований, анализе и
обобщении результатов. Автор лично проводил анализ, статистическую
обработку и интерпретацию результатов. Вклад автора является определяющим
на всех этапах исследования, включая постановку задач, их теоретически-
экспериментальную реализацию до обсуждения результатов в научных
публикациях, докладах и внедрении в практическое использование. Научные
результаты, обобщенные в диссертационной работе, получены автором
самостоятельно и внедрены в практику.
Внедрение результатов исследования
Научно-практические результаты диссертационной работы были внедрены в
работу ООО «ГурусБиофарм» по проведению доклинических исследований (Акт
внедрения от 21.12.2021 г.). Результаты исследования внедрены в учебный
процесс на кафедре промышленной фармации Института профессионального
образования (Акт внедрения от 18.06.2021 г.), на кафедре фармакологии
Института фармации имени А.П. Нелюбина ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М.
Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет) (Акт внедрения от
15.09.2021 г.) и в лаборатории фармакокинетики и метаболомного анализа
Института трансляционной медицины и биотехнологии ФГАОУ ВО Первый
МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет) (Акт
внедрения от 20.01.2021 г.).
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Научные положения диссертации соответствуют паспорту специальности
3.4.2. Фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного
исследования соответствуют области исследования специальности 3.4.2.
Фармацевтическая химия, фармакогнозия.
Связь диссертации с основными научными темами, внедрение результатов
Диссертационная работа выполнена в рамках ФЦП «Развитие
фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации» и
является результатом проделанной работы по 3 этапу Государственного контракта
от 30.09.2016 № 14.N08.11.0119 «Доклинические исследования лекарственного
средства на основе динитроглицеринового эфира простагландина Е1 для лечения
тяжёлых стадий хронических облитерирующих заболеваний периферических
сосудов», и 5 этапу Государственного контракта от 28.08.2015 №14.N08.12.1032
«Доклинические исследования лекарственного средства на основе NO-
генерирующего простагландина Е2 для купирования приступов бронхиальной
астмы». Диссертационная работа выполнена при частичной финансовой
поддержке внутреннего гранта Сеченовского Университета в рамках реализации
Проекта 5-100.
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-
исследовательских работ ФГАОУ ВО Первого МГМУ имени И.М. Сеченова
Минздрава России (Сеченовский Университет) и является фрагментом
исследования по теме «Развитие научных и научно-методических основ, базовых
и инновационных подходов при разработке, внедрении и применении
лекарственных средств» (номер государственной регистрации 01.2.012.61653).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 3 статьи
в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК при Минобрнауки России, 6 –
в журналах, входящих в международные базы данных (индексируемых в Scopus и
Web of Science).
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 166 страницах машинописного текста и состоит из
введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы,
результаты исследований и их обсуждение), выводов, списка литературы,
приложения. Работа иллюстрирована 48 таблицами и 34 рисунками.
Библиографический указатель включает 124 источников, из них 112 –
иностранных.
В приложениях вынесены акты внедрения научных результатов в учебный
процесс ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова (Сеченовский
Университет) и акт внедрения научных результатов в рабочий процесс ООО
«Гурус Биофарм».

Заказать новую

Лучшие эксперты сервиса ждут твоего задания

от 5 000 ₽

Не подошла эта работа?

Закажи новую работу, сделанную по твоим требованиям

Читать

Публикации автора в научных журналах

Rabbit plasma metabolomic analysis of Nitroproston: a multi target natural prostaglandin based-drug

K.M. Shestakova, A. Brito, N.V. Mesonzhnik, N.E. Moskaleva, K.O. Kurynina, N.M.Grestskaya, I.V. Serkov, I.I.Lyubimov, V.V. Bezuglov, S.A. Appolonova // Metabolomics. – 2018, – V. 14(9). – P. [Scopus]Mesonzhnik, N.V. LC-MS/MS Identification and Structural Characterization of Main Biodegradation Products of Nitroproston - A Novel Prostaglandin-based Pharmaceutical Compound / N.V. Mesonzhnik, N.E. Moskaleva, K.M. Shestakova, K.O. Kurynina, P.A. Baranov, N.M. Gretskaya, I.V. Serkov, I.I. Lyubimov, V.V. Bezuglov, S.A. Appolonova // Drug Metabolism Letters. – 2018, – V. 12(1). – P. 54-[Scopus]

In Vivo Targeted Metabolomic Profiling of Prostanit, a Novel Anti-PAD NO-Donating Alprostadil-Based Drug

K.M. Shestakova, N.E. Moskaleva, N.V. Mesonzhnik, A.V. Kukharenko, I.V. Serkov, I.I. Lyubimov, E.V. Fomina-Ageeva, V.V. Bezuglov, M.G. Akimov, S.A. Appolonova // Molecules. – 2020, – V. 25(24). – P. 5[Scopus]Шестакова, К. М. Метаболомный подход в изучении механизмов действия и оценке безопасности лекарственных средств на основе натуральных простагландинов /К. М. Шестакова, Н.В. Месонжник, Н.Е. Москалева, С.А. Апполонова, Н.В. Пятигорская, // Вестник Воронежского государственного университета. Серия: Химия. Биология. Фармация. – 2–T.2 – C.105-[ВАК]

Разработка методики количественного определения производных нитропростона в плазме кроликов

К.М. Шестакова, Н.В. Месонжник, Н.Е. Москалева, C.A. Апполонова, Н.В. Пятигорская // Медико-фармацевтический журнал «Пульс» – 2– T.23(4) – C.43-[ВАК]Шестакова К.М. Разработка и валидация ВЭЖХ-МС/МС методики количественного определения простанита и его метаболитов в плазме крови крыс / К.М. Шестакова, Н.Е. Москалева, Н.В. Месонжник, С.А. Апполонова, Н.В. Пятигорская// Международный научно- исследовательский журнал – 2– Т.5(107). – С.126-[ВАК]

In vivo and in vitro metabolism of the novel synthetic cannabinoid 5F- APINAC

S.A. Appolonova, C. Palacio, K.M. Shestakova, N.V. Mesonzhnik, A. Brito, R.M. Kuznetsov, P. Markin, N.L. Bochkareva, D. Burmykin, M. Ovcharov, G. Musile, F. Tagliaro, S.A. Savchuk // Forensic Toxicology. – 2– T. 38(1). – C. 160-[Scopus]Savchuk, S. In vivo metabolism of the new synthetic cannabinoid APINAC in rats by GC–MS and LC–QTOF-MS / S. Savchuk, S. Appolonova, A. Pechnikov, L. Rizvanova, K. Shestakova, F. Tagliaro // Forensic Toxicology. – 2– T. 35(2). – C. 359-[Scopus]

Pharmacometabolomic Study of Novel Multitarget Drugs Based on Natural Prostaglandins in Terms of Therapeutic Effectiveness

K.M. Shestakova, N.E. Moskaleva, N.V. Mesonzhnik, V.V. Bezuglov, I.I. Lyubimov, I.V. Serkov, S.A. Appolonova // MSACL (Mass Spectrometry & Advances in the Clinical Lab) EU 6th European Congress & Exhibition (22-24 Сентября, 2019 г.), Зальцбург, Австрия, 2– https://www.msacl.org/view_abstract/view_abstract_in_program.php?id=1210&event=2019%20EU Шестакова К.М. Метаболомика как метод оценки эффективности и безопасности лекарственных средств на основе натуральных простагландинов / К.М. Шестакова, Н.В. Месонжник, Н.Е. Москалева, С.А. Апполонова, Н.В. Пятигорская // Материалы конференции (Белград) – 2https://apni.ru/article/813-izuchenie-metabolizma-novogo-sinteticheskogo

Помогаем с подготовкой сопроводительных документов

Совместно разработаем индивидуальный план и выберем тему работы Подробнее

Помощь в подготовке к кандидатскому экзамену и допуске к нему Подробнее

Поможем в написании научных статей для публикации в журналах ВАК Подробнее

Структурируем работу и напишем автореферат Подробнее

Хочешь уникальную работу?

Больше 3 000 экспертов уже готовы начать работу над твоим проектом!

Наличие красного диплома УрГЮУ по специальности юрист. Опыт работы в профессии - сфера банкротства. Уровень выполняемых работ - до магистерских диссертаций. Написан... Читать все

Наличие красного диплома УрГЮУ по специальности юрист. Опыт работы в профессии - сфера банкротства. Уровень выполняемых работ - до магистерских диссертаций. Написание письменных работ для меня в удовольствие.Всегда качественно.

#Кандидатские #Магистерские

60 Выполненных работ

Высшее юридическое образование, красный диплом. Более 5 лет стажа работы в суде общей юрисдикции, большой стаж в написании студенческих работ. Специализируюсь на напис... Читать все

Высшее юридическое образование, красный диплом. Более 5 лет стажа работы в суде общей юрисдикции, большой стаж в написании студенческих работ. Специализируюсь на написании курсовых и дипломных работ, а также диссертационных исследований.

#Кандидатские #Магистерские

158 Выполненных работ

Практический стаж работы в финансово - банковской сфере составил более 30 лет. За последние 13 лет, мной написано 7 диссертаций и более 450 дипломных работ и научных с... Читать все

Практический стаж работы в финансово - банковской сфере составил более 30 лет. За последние 13 лет, мной написано 7 диссертаций и более 450 дипломных работ и научных статей в области экономики.

#Кандидатские #Магистерские

56 Выполненных работ

Серьезно отношусь к тренировке собственного интеллекта, поэтому постоянно учусь сама и с удовольствием пишу для других. За 15 лет работы выполнила более 600 дипломов и... Читать все

Серьезно отношусь к тренировке собственного интеллекта, поэтому постоянно учусь сама и с удовольствием пишу для других. За 15 лет работы выполнила более 600 дипломов и диссертаций, Есть любимые темы - они дешевле обойдутся, ибо в радость)

#Кандидатские #Магистерские

76 Выполненных работ

Более 5 лет помогаю в написании работ от простых учебных заданий и магистерских диссертаций до реальных бизнес-планов и проектов для открытия своего дела. Имею два об... Читать все

Более 5 лет помогаю в написании работ от простых учебных заданий и магистерских диссертаций до реальных бизнес-планов и проектов для открытия своего дела. Имею два образования: экономист-менеджер и маркетолог. Буду рада помочь и Вам.

#Кандидатские #Магистерские

55 Выполненных работ

Красный диплом референта-аналитика информационных ресурсов, 8 лет преподавания. Опыт написания работ вплоть до докторских диссертаций. Отдельно специализируюсь на повы... Читать все

Красный диплом референта-аналитика информационных ресурсов, 8 лет преподавания. Опыт написания работ вплоть до докторских диссертаций. Отдельно специализируюсь на повышении уникальности текста и оформлении библиографических ссылок по ГОСТу.

#Кандидатские #Магистерские

132 Выполненных работы

Работа пишется на основе учебников и научных статей, диссертаций, данных официальной статистики. Все источники актуальные за последние 3-5 лет.Активно и уместно исполь... Читать все

Работа пишется на основе учебников и научных статей, диссертаций, данных официальной статистики. Все источники актуальные за последние 3-5 лет.Активно и уместно использую в работе графический материал (графики рисунки, диаграммы) и таблицы.

#Кандидатские #Магистерские

362 Выполненных работы

Имеют опыт грамотного написания диссертационных работ по медицине, а также отдельных ее частей (литературный обзор, цели и задачи исследования, материалы и методы, выв... Читать все

Имеют опыт грамотного написания диссертационных работ по медицине, а также отдельных ее частей (литературный обзор, цели и задачи исследования, материалы и методы, выводы).Пишу статьи в РИНЦ, ВАК.Оформление патентов от идеи до регистрации.

#Кандидатские #Магистерские

100 Выполненных работ

руководитель успешно защищенных диссертаций, автор около 150 работ, в активе - оппонирование, рецензирование, написание и подготовка диссертационных работ; интересы - ... Читать все

руководитель успешно защищенных диссертаций, автор около 150 работ, в активе - оппонирование, рецензирование, написание и подготовка диссертационных работ; интересы - медицина, биология, антропология, биогидродинамика

#Кандидатские #Магистерские

12 Выполненных работ