Разработка электрохимического иммуносенсора на основе наночастиц серебра для определения антител к вирусу клещевого энцефалита

ВВЕДЕНИЕ ……………………………………………………………………………………………….. 5
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР…………………………………………………………. 11
1.1 Иммуноанализ и иммуносенсоры………………………………………………………. 11
1.2. Классификация иммуносенсоров ……………………………………………………… 12
1.2.1 Оптические иммуносенсоры ……………………………………………………….. 13
1.2.2 Пьезоэлектрические иммуносенсоры …………………………………………… 14
1.2.3 Электрохимические иммуносенсоры …………………………………………… 15
1.3 Элементы распознавания в электрохимических иммуносенсорах ………… 17
1.4 Сигналобразующие металлические метки в электрохимических
иммуносенсорах ……………………………………………………………………………………. 20
1.5 Биоконъюгирование. Общие сведения……………………………………………….. 24
1.6 Способы получения биоконъюгатов ………………………………………………….. 25
1.6.1 Метод физической адсорбции. Нековалентное взаимодействие …….. 25
1.6.2 Ковалентное взаимодействие………………………………………………………. 29
1.7 Клещевой энцефалит. Методы диагностики ……………………………………….. 33
1.8 Перспективы применения электрохимического иммуноанализа для
диагностики флавивирусных инфекций ………………………………………………….. 36
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ …………………………………………….. 40
2.1 Оборудование, электроды, ячейки, посуда …………………………………………. 40
2.2 Реактивы, приготовление растворов ………………………………………………….. 43
2.3 Объекты исследования ……………………………………………………………………… 44
2.4 Методика эксперимента ……………………………………………………………………. 45
2.4.1 Методика получения наночастиц серебра ……………………………………. 45
2.4.2 Получение биоконъюгатов на основе НЧ серебра с антителами к
ВКЭ ………………………………………………………………………………………………….. 46
2.4.3 Получение биоконъюгатов на основе НЧ серебра с фрагментами
расщеплённых антител к ВКЭ …………………………………………………………….. 47
2.4.4 Методика исследования НЧ серебра и их биоконъюгатов методом
катодной инверсионной вольтамперометрии ……………………………………….. 47
2.4.5 Методика исследования НЧ серебра и их биоконъюгатов методом
анодной инверсионной вольтампрометрии ………………………………………….. 48
2.4.6 Методика сборки электрохимического иммуносенсора ………………… 48
2.4.7 Методика определения антител к ВКЭ вольтамперометрическим
методом анализа ………………………………………………………………………………… 52
2.4.8 Методика определения антител к ВКЭ методом ИФА ………………….. 52
2.5 Статистическая обработка результатов ……………………………………………… 54
ГЛАВА 3. СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ ЭЛЕКТРОАКТИВНЫХ
БИОКОНЪЮГАТОВ НА ОСНОВЕ НАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА …………………… 56
3.1 Характеристика полученных НЧ серебра и их биоконъюгатов ……………. 56
3.2 Электрохимические исследования НЧ серебра и их биоконъюгатов ……. 59
3.2.1 Исследование электрохимических свойств НЧ серебра на
электроде с обновляемой поверхностью………………………………………………. 60
3.2.2 Исследование электрохимических свойств НЧ серебра на ИГЭ …….. 62
3.2.3 Выбор рабочих условий определения НЧ серебра на ЗАУСЭ и
ИГЭ методами инверсионной вольтамперометрии ……………………………….. 63
3.2.4 Регистрация электрохимического отклика от биоконъюгатов
методами инверсионной вольтамперометрии ………………………………………. 70
ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОГО
ИММУНОСЕНСОРА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВКЭ С
ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СИНТЕЗИРОВАННЫХ БИОКОНЪЮГАТОВ НА
ОСНОВЕ НЧ СЕРЕБРА …………………………………………………………………………….. 72
4.1 Процедура иммобилизации антигена ВКЭ …………………………………………. 72
4.2 Исследования электрохимического поведения НЧ серебра
конъюгированных с антителами к ВКЭ на разных этапах модификации
электрода ……………………………………………………………………………………………… 74
4.3 Применение биоконъюгатов полученных методом физической
адсорбции (Ab@AgНЧ) для определения антител к ВКЭ ………………………….. 75
4.4 Применение биоконъюгатов полученных методом ковалентного
взаимодействия (AbS@AgНЧ) для определения антител к ВКЭ …………………. 79
ГЛАВА 5. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ РАЗРАБОТАННОГО
ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОГО ИММУНОСЕНСОРА ДЛЯ
КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВКЭ C
ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОКОНЪЮГАТОВ Ab@AgНЧ, AbS@AgНЧ …………… 82
5.1 Установление предела обнаружения антител к ВКЭ с использованием
электрохимического иммуносенсора ………………………………………………………. 82
5.2 Подтверждение линейности градуировочных характеристик
разработанного электрохимического иммуносенсора ………………………………. 83
5.3 Оценка правильности и специфичности разработанного
электрохимического иммуносенсора для определения антител к ВКЭ ………. 87
5.4 Подготовка разработанного электрохимического иммуносенсора для
определения антител к ВКЭ к метрологической аттестации ……………………… 90
ГЛАВА 6. АПРОБАЦИЯ РАЗРАБОТАННОГО ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОГО
ИММУНОСЕНСОРА ДЛЯ АНАЛИЗА РЕАЛЬНЫХ ОБЪЕКТОВ………………… 93
6.1 Определение концентрации антител в препарате иммуноглобулина
человека против КЭ с использованием разработанного
электрохимического иммуносенсора ………………………………………………………. 93
6.2 Определение концентрации антител в модельном растворе сыворотки
крови человека с использованием разработанного электрохимического
иммуносенсора ……………………………………………………………………………………… 95
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ………………………………………………………………………………………… 97
УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ ……………………………………… 99
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ………………………………………………………………………… 100
ПРИЛОЖЕНИЕ А. Алгоритм выполнения расчетов по оценке показателей
качества разработанного электрохимического иммуносенсора …………………… 113
ПРИЛОЖЕНИЕ Б. Расчет показателей качества разработанного
электрохимического иммуносенсора для количественного определения
антител к ВКЭ с использованием биоконъюгата Ab@AgНЧ ………………………. 117
ПРИЛОЖЕНИЕ В. Расчет показателей качества разработанного
электрохимического иммуносенсора для количественного определения
антител к ВКЭ с использованием биоконъюгата AbS@AgНЧ ……………………… 123

Результаты исследования показали возможность применения
разработанного электрохимического иммуносенсора с использованием
биоконюъгатов (Ab@AgНЧ, AbS@AgНЧ) в качестве сигналобразующих меток для
определения антител к ВКЭ в модельных растворах сыворотки крови и
лекарственных препаратах, содержащих иммуноглобулины против КЭ. В работе
представлены два разработанных подхода для определения антител к ВКЭ в
условиях инверсионной вольтамперометрии на ЗАУСЭ и ИГЭ. В качестве метода
сравнения применяли наиболее распространенный метод, используемый в РФ для
определения антител к ВКЭ в биологических объектах – ИФА.
На основании полученных результатов сформулированы следующие
выводы:
1) Получены НЧ (средний размер 5,3±1,2 нм) и оптимизировано
соотношение компонентов при получении биоконъюгатов. С использованием
разных стратегий осуществлен процесс биоконъюгирования с НЧ серебра для
создания электроактивных биоконъюгатов Ab@AgНЧ, AbS@AgНЧ со
специфической активностью к антителам к ВКЭ. Морфология НЧ серебра и их
биоконъюгатов подтверждена методом ПЭМ;
2) Исследованы электрохимические свойства НЧ серебра и их
биоконъюгатов на разных электродах: ИГЭ, ЗАУСЭ методами инверсионной
вольтамперометрии;
3) Исследованы электрохимические свойства биоконъюгатов НЧ серебра на
разных этапах иммобилизации антигена ВКЭ на поверхности ИГЭ;
4) Разработан алгоритм проведения электрохимического иммуноанализа для
определения антител к ВКЭ с использованием биоконъюгатов (Ab@AgНЧ,
AbS@AgНЧ) в качестве меток на широкодоступных материалах электродов.
Показано, что для регистрации аналитического сигнала серебра биоконъюгатов
Ab@AgНЧ методом КИВ, предпочтительнее использовать ЗАУСЭ, где на его
поверхности накапливается труднорастворимое соединение AgCl↓, а для
регистрации аналитического сигнала серебра биоконъюгатов AbS@AgНЧ
предпочтительнее использовать метод АИВ, где происходит окисления Ag0 на
поверхности ИГЭ;
5) Показана специфичность разработанного электрохимического
иммуносенсора с контрольными образцами не содержащими антитела к ВКЭ, и
рассчитаны основные метрологические характеристики разработанного
электрохимического иммуносенсора для количественного определения антител к
ВКЭ;
6) Разработанный иммуносенсор апробирован на реальных объектах
(модельных растворах сыворотки крови человека и лекарственных препаратах,
содержащих иммуноглобулины против КЭ). Результаты анализа совпадают с
результатами, полученными традиционным ИФА методом.
Результаты исследования открывают возможности для дальнейшего
развития дешевых, надежных и простых электрохимических
иммунодиагностических тест – систем с использованием металлических
маркёров, на примере НЧ серебра, как альтернатива ИФА с ферментными
метками. Замена ферментной метки на серебрянную позволит увеличить срок
хранения диагностикумов и не использовать концервирующие реактивы.
Использование недорогих вольтамперометрических анализаторов и
электродных материалов отечественного производства позволит снизить
себистоимость иммунодиагностикумов и решить вопрос с импортозамещением.
Перспективы дальнейщих исследований связаны с проведением испытаний
по использованию разработанного электрохимического иммуносенсора для
совместного определения антител к различным заболеваниям (КЭ, боррелиоз) с
использованием разнотипных металлических меток (Ag, Au, Cu). Полученные
результаты уже могут стать основой для создания электрохимической тест-
системы для определения антител к ВКЭ в полуавтоматическом режиме. Таким
образом, разработанный электрохимический иммуносенсор на основе НЧ серебра
может быть успешно использован в лабораторно-диагностических и медицинских
областях.
УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

ИФА – иммуноферментный анализ
ЭХ – электрохимические
НЧ – наночастицы
БСА – бычий сывороточный альбумин
ЦВА – циклическая вольтамперометрия
ХСЭ – хлорид серебряный электрод
УСЭ – углеродсодержащий электрод
ИГЭ – импрегнированный графитовый электрод
ЗАУСЭ – золото-ансамблевый углеродсодсодержащий электрод
КЭ – клещевой энцефалит
ВКЭ – вирус клещевого энцефалита
Ab@AgНЧ – биконъюгат на основе НЧ серебра с антителами к ВКЭ
AbS@AgНЧ – биконъюгат на основе НЧ серебра с фрагментами
расщеплённых антител к ВКЭ
АИВ – анодная инверсионная вольтамперометрия
КИВ – катодная инверсионнаявольтамперометрия
СКО – среднеквадратичное отклонение