Разработка изолирующей трековой мембраны на основе полиэтилентерефталата для лечения буллезной кератопатии
ВВЕДЕНИЕ ……………………………………………………………………………………………………… 7
ГЛАВА I. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР ……………………………………………………….. 13
1.1. Буллезная кератопатия…………………………………………………………………………… 13
1.2. Консервативные и хирургические способы лечения буллезной
кератопатии …………………………………………………………………………………………………….. 14
1.3. Кератотрансплантация: методы кератопластики, материалы, применяемые
для пересадки роговицы ………………………………………………………………………………….. 15
1.4. Возможность использования искусственных материалов в
кератопластике: органические материалы для изготовления имплантатов……. 16
1.5. Полиэтилентерефталат ………………………………………………………………………….. 20
1.6. Методы изготовления трековых мембран на основе
полиэтилентерефталата ………………………………………………………………………………….. 22
1.7. Трековые мембраны на основе полиэтилентерефталата и перспективы их
использования в кератопластике ……………………………………………………………………… 24
1.8. Методы модификации поверхности полимерных мембран …………………….. 25
1.9. Стерилизация полимерных изделий……………………………………………………….. 27
1.10. Выводы к главе I………………………………………………………………………………….. 29
1.11. Цели и задачи исследования ………………………………………………………………… 30
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ……………………….. 32
2.1. Трековых мембран на основе полиэтилентерефталата ……………………………. 32
2.2. Методика стерилизации мембран: стерилизация в автоклаве, стерилизация
гамма – лучами ……………………………………………………………………………………………….. 32
2.3. Методика воздействия низкотемпературной плазмы на поверхность
мембран при атмосферном давлении ……………………………………………………………….. 33
2.4. Методика испытания на стерильность ТМ из ПЭТФ со стерилизующим
агентом ионизированной плазменной среды ……………………………………………………. 33
2.5. Методы изучения физических свойств мембран …………………………………….. 36
2.5.1. Электронно–микроскопические методы ……………………………………………. 36
2.5.2. Атомная силовая микроскопия ………………………………………………………….. 36
2.5.3. Порометрия исследуемых мембран …………………………………………………… 37
2.5.4. Дифференциальная сканирующая калориметрия ……………………………….. 37
2.5.5. Фазовый анализ и расчет степени кристалличности …………………………… 37
2.5.6. Методы оптической спектроскопии …………………………………………………… 39
2.5.7. Измерение контактного угла и поверхностной энергии. …………………….. 41
2.5.8. ИК–спектроскопия ……………………………………………………………………………. 42
2.5.9. Методы исследования ζ–потенциала трековых мембран ……………………. 43
2.5.10. Исследование проницаемости мембран …………………………………………… 44
2.5.11. Методика исследования прочности и механических характеристик
трековых мембран на основе ПЭТФ ………………………………………………………………… 45
2.5.12. Трибологические испытания трековых мембран ……………………………… 48
2.6. Образцы для исследований: плотность и средний диаметр пор исследуемых
мембран ………………………………………………………………………………………………………….. 50
2.7. Придание мембране формы определенной кривизны ……………………………… 50
2.8. Методика исследования цитотоксичности трековых мембран ………………… 52
2.9. Исследование биосовместимости трековой мембраны на основе ПЭТФ in
vitro на культуре мезенхимальных стволовых клеток……………………………………….. 53
2.10. Методы статистической обработки экспериментальных данных…………… 55
2.11. Выводы к главе II ………………………………………………………………………………… 55
ГЛАВА III. ВОЗДЕЙСТВИЕ ИОНИЗИРУЮЩЕО ОБЛУЧЕНИЯ НА
СВОЙСТВА И СТРУКТУРУ ПЭТФ ТРЕКОВЫХ МЕМБРАН …………………… 57
3.1. Модификация поверхности трековых мембран низкотемпературной
плазмой …………………………………………………………………………………………………………… 57
3.1.1. Исследование поверхностных свойств модифицированных плазмой
трековых мембран …………………………………………………………………………………………… 57
3.1.2. Исследование ζ–потенциала поверхности исходных и
модифицированных плазмой трековых мембран ……………………………………………… 69
3.1.3. Исследование проницаемости исходных и модифицированных плазмой
трековых мембран …………………………………………………………………………………………… 72
3.1.4. Исследование кристалличности исходных и модифицированных
плазмой трековых мембран ……………………………………………………………………………… 73
3.1.5. Оптические характеристики исходных и модифицированных плазмой
трековых мембран …………………………………………………………………………………………… 76
3.1.6. Механические свойства исходных и модифицированных плазмой
трековых мембран …………………………………………………………………………………………… 78
3.1.7. Трибологические испытания исходных и модифицированных плазмой
трековых мембран …………………………………………………………………………………………… 82
3.2. Влияние процессов γ–стерилизации на свойства ПЭТФ трековых
мембран ………………………………………………………………………………………………………….. 87
3.2.1. Поверхностные свойства модифицированных плазмой трековых
мембран после γ–стерилизации ……………………………………………………………………….. 87
3.2.2. Исследование кристалличности трековых мембран после γ–
стерилизации …………………………………………………………………………………………………. 105
3.2.3. Исследование –потенциала поверхности трековых мембран после γ–
стерилизации…………………………………………………………………………………………………. 107
3.2.4. Исследование проницаемости трековых мембран после γ–
стерилизации…………………………………………………………………………………………………. 109
3.2.5. Сравнительные исследования оптических свойств трековых мембран
после γ–стерилизации. …………………………………………………………………………………… 110
3.2.6. Механические характеристики трековых мембран после γ–
стерилизации…………………………………………………………………………………………………. 112
3.2.7. Трибологические испытания трековых мембран после γ–
стерилизации …………………………………………………………………………………………………. 116
3.3. Выводы к главе III ……………………………………………………………………………….. 116
ГЛАВА IV. ВЛИЯНИЕ ПРОЦЕССОВ ПАРОВОЙ СТЕРИЛИЗАЦИИ НА
СВОЙСТВА ПЭТФ ТРЕКОВЫХ МЕМБРАН ……………………………………………. 118
4.1. Поверхностные свойства модифицированных плазмой трековых мембран
после паровой стерилизации. …………………………………………………………………………. 118
4.2. Исследование –потенциала поверхности трековых мембран после паровой
стерилизации …………………………………………………………………………………………………. 130
4.3. Исследование кристалличности трековых мембран после паровой
стерилизации …………………………………………………………………………………………………. 131
4.4. Исследование проницаемости трековых мембран после паровой
стерилизации …………………………………………………………………………………………………. 132
4.5. Сравнительные исследования оптических свойств трековых мембран после
паровой стерилизации ……………………………………………………………………………………. 133
4.6. Механические характеристики трековых мембран после паровой
стерилизации…………………………………………………………………………………………………. 135
4.7. Трибологические испытания трековых мембран после паровой
стерилизации …………………………………………………………………………………………………. 139
4.8. Выводы к главе IV……………………………………………………………………………….. 139
ГЛАВА V. МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ
ТРЕКОВЫХ МЕМБРАН В ЛЕЧЕНИИ БУЛЛЕЗНОЙ КЕРАТОПАТИИ …. 141
5.1. Определение цитотоксичности ПЭТФ трековых мембран…………………….. 141
5.2. Результаты изучения биосовместимости трековых мембран из ПЭТФ in
vitro……………………………………………………………………………………………………………….. 142
5.3. Результаты применения плазменной стерилизации трековых мембран … 146
5.4. Биосовместимость разработанной изолирующей трековой мембраны на
основе ПЭТФ на биологических моделях in vivo ……………………………………………. 150
5.5. Выводы к главе V ………………………………………………………………………………… 151
5.6. Требования к параметрам синтетических трековых мембран на основе
полиэтилентерефалата и рекомендации по их применению в хирургическом
лечении буллезной кератопатии …………………………………………………………………….. 152
ЗАКЛЮЧЕНИЕ …………………………………………………………………………………………… 153
Перечень принятых сокращений ……………………………………………………………………. 156
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ………………………………………………………………………….. 157
ПРИЛОЖЕНИЕ I Экспериментальные исследования биосовместимости
разработанной изолирующей трековой мембраны на основе ПЭТФ in vivo …….. 180
ПРИЛОЖЕНИЕ II Акт результатов внедрения…………………………………………….. 199
ПРИЛОЖЕНИЕ III Патент ………………………………………………………………………….. 201
Буллезная кератопатия является тяжелым, трудно поддающимся лечению прогрессирующим заболеванием, и наиболее распространенной причиной корнеального слабовидения на территории Российской Федерации. В патогенезе буллезной кератопатии ведущую роль играет несостоятельность барьерной функции слоя клеток эндотелия, что ведет к пропитыванию внутриглазной жидкостью стромы с постепенным распространением отека на всю толщу роговой оболочки с образованием пузырей на поверхности, из-за чего нарушается прозрачность роговицы, снижается острота зрения и появляется выраженный болевой синдром.
При лечении буллезной кератопатии широко используются консервативные и хирургические методы, использование которых не всегда обеспечивает высокие и стабильные клинико-функциональные результаты. Одним из перспективных направлений в лечении буллезной кератопатии является применение полупроницаемых мембран, способных к нормализации движения жидкости в роговичной ткани и поддержанию роговицы в слабо дегидрированном состоянии. Попытки использования полупроницаемых трековых мембран (ТМ) на основе полиэтилентерефталата (ПЭТФ) в качестве эксплантодренажа в хирургии некоторых форм вторичной глаукомы были предприняты ранее (П.Ю. Апель, Л.И. Кравец).
ТМ на основе ПЭТФ, получение которых подробно описано в работах Г.Н. Флерова, П.Ю. Апеля, R.L. Fleischer, D. Karl, P.B. Price, R.M. Walker, R. Spohr, представляют особый интерес и в хирургическом лечении буллезной кератопатии. Их способность обеспечивать избирательную проницаемость жидкости может предотвратить излишнюю гидратацию роговицы и поддерживать в ней обменные процессы. Это и определило цель и задачи работы.
Целью диссертационной работы является разработка изолирующей трековой мембраны на основе полиэтилентерефталата, как имплантатов в хирургическом лечении буллезной кератопатии.
8
В соответствии с целью диссертационной работы поставлены следующие
задачи.
1. Разработать медико–технические требования, предъявляемые к имплантатам, используемым в кератопластике и определить возможность использования ТМ из ПЭТФ в лечении буллезной кератопатии.
2. Исследовать морфологию поверхности, структуру и физико- механические характеристики мембран из ПЭТФ, определить их функциональные характеристики: оптические, механические, смачиваемость, поверхностную энергию, транспортные свойства, биологическую совместимость.
3. Изучить влияние воздействия внешней среды и внешних факторов на топографию поверхности, структуру и транспортные свойства мембран: воздействие низкотемпературной плазмы, стерилизации γ–облучением и автоклавированием.
4. Провести экспериментальные исследования биосовместимости и цитотоксичности разработанной изолирующей мембраны на основе ПЭТФ in vitro.
5. Провести исследование стерилизационного эффекта низкотемпературной атмосферной плазмы при её воздействии на поверхность трековых мембран из ПЭТФ.
6. Определить требования к параметрам синтетических мембран медицинского применения, установить возможность использования ПЭТФ трековых мембран при хирургическом лечении буллезной кератопатии.
7. Изготовить прототип имплантата и провести исследования in vivo. Научная новизна работы
1. Показано, что стерилизация низкотемпературной атмосферной плазмой
при режиме обработки 30 секунд оказывает наименьшее деструктивное действие на трековые мембраны из ПЭТФ по сравнению с воздействием γ–лучами и автоклавированием, а также придает материалу гидрофильность за счет увеличения (в 4 раза) полярности поверхности, стабильно сохраняющуюся в течение 21 дня хранения.
9
2. Установлено, что γ–стерилизация в малых стерилизационных дозах (1
кГр и 10 кГр) и паровая стерилизация в температурных режимах 120oС и 130oС приводят к изменениям топографии поверхности ТМ, образованию микродефектов при γ–стерилизации, овальной формы макродефектов поверхности мембраны при автоклавировании, изменению механических свойств материала.
3. Установлено, что низкотемпературная атмосферная плазма обладает стерилизующей способностью при режимах обработки образцов по 30, 60 и 90 секунд.
4. Установлено, что имплантация ТМ из ПЭТФ в строму роговицы при буллезной кератопатии способствует стабилизации патологического процесса в роговой оболочке.
Практическая значимость работы. Разработанная изолирующая трековая мембрана на основе полиэтилентерефталата способствует нормализации движения жидкости в роговичной ткани и поддержанию роговицы в слабо дегидрированном состоянии и может быть использована в качестве роговичного имплантата для барьерной кератопластики в лечении буллезной кератопатии. Разработанный способ щадящей стерилизации ТМ путем воздействия низкотемпературной атмосферной плазмы позволяет достичь необходимого бактерицидного эффекта, придать необходимые физико-химические свойства ТМ и может быть рекомендован к апробации в качестве стерилизующего агента в клинических условиях.
Методы исследования. Методами исследования физико–химических свойств ТМ из ПЭТФ являлись: сканирующая электронная и атомная силовая микроскопия, порометрия, дифференциальная сканирующая калориметрия, рентгенофазовый анализ и расчет степени кристалличности, измерение контактного угла и поверхностной энергии, ИК–спектроскопия, исследование ζ– потенциала поверхности, проницаемости мембран; были использованы, также, методы оптической спектроскопии и исследования механических характеристик ТМ.
10
Медико–биологическое обоснование применения трековых мембран в
лечении буллезной кератопатии было проведено с использованием методик исследования на цитотоксичность и биосовместимость ТМ in vitro и на биологических моделях в экспериментах in vivo.
Статистическая обработка данных проводилась с применением программы «IMB SPSS Statistics 23».
Личный вклад автора состоит в постановке цели диссертации, участие в разработке задач, проведении экспериментальных исследований, обработке полученных результатов, разработке требований к параметрам ТМ на основе ПЭТФ и рекомендаций по их применению при хирургическом лечении буллезной кератопатии, формулировке выводов и положений, выносимых на защиту, подготовке публикаций по теме работы.
Достоверность. Достоверность результатов обеспечена корректностью поставленных задач, их физико–технической и медико–биологической обоснованностью, использованием современных методов исследования, стандартного оборудования, большим массивом экспериментальных данных и их статистической обработкой, сопоставлением полученных результатов с литературными данными.
На защиту выносятся следующие положения:
1. Воздействие γ–облучения изотопа 60Со в стерилизационных дозах на трековые мембраны из ПЭТФ приводит к существенным изменениям их поверхностных свойств: появлению дефектов поверхности со средним размером 0,5 мкм, глубиной 0,4 ± 0,2 мкм; изменению механических характеристик: уменьшению удлинения при разрыве на 33%, модуля Юнга на (11 – 15)%, относительного предела текучести на (62 – 63)%, напряжения при растяжении на (46 – 49)%.
2. Воздействие низкотемпературной атмосферной плазмы приводит к изменению химического состава и реконструкции поверхности трековой мембраны, заключающейся в 9-ти кратном увеличении параметра шероховатости, формировании многочисленных деструктивных областей, увеличению (более чем
11
в 4 раза) поверхностной энергии за счет роста полярной составляющей, росту гидрофильности ТМ; последующее γ–облучение дозой 1кГр приводит к снижению количества деструктивных областей и параметров шероховатости на
47% – 77%.
3. Низкотемпературная атмосферная плазма (плотность мощности –
2 Вт/см2) обладает стерилизующей способностью в режимах обработки образцов по 30, 60 и 90 секунд и может применяться в качестве стерилизующего агента для трековых мембран из ПЭТФ, требующих щадящего стерилизационного режима.
4. Изолирующая трековая мембрана из ПЭТФ толщиной 8 мкм с параметрами: диаметр пор 5 мкм, плотность 5×108 см-2, проницаемость по воде 5 мл/минсм2 при p = 0,1 бар; краевой угол смачивания (30 – 40), поверхностная энергия (120 – 130) мДж/м2, заряд поверхности – отрицательный, подвергнутая воздействию плазмы атмосферного давления в течение 30 с и последующему γ– облучению дозой 1кГр, при имплантации в строму роговицы in vivo при буллезной кератопатии уменьшает степень гидратации стромы роговой оболочки и способствует стабилизации патологического процесса.
Реализация и внедрение результатов работы. Результаты работы внедрены в учебный процесс кафедры офтальмологии в разделе «Патология роговицы» ФГБОУ ВО СибГМУ.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на международной конференции Second International Conference on Radiation and Dosimetry Fields of Research – г. Ниш, Сербия (2014), VII Международной научно-практической конференции «Физико-технические проблемы в науке, промышленности и медицине» – г. Томск (2015), XII Международной конференция студентов и молодых ученых «Перспективы развития фундаментальных наук» – г. Томск (2015, 2016), Научная конференция офтальмологов «Невские горизонты – 2016» – г. Санкт-Петербург (2016), 10-й международной конференции «Ядерная и радиационная физика» – Курчатов (Казахстан, 2015), Всероссийской научной конференции с международным участием «Сопряженные задачи механики реагирующих сред, информатики и
12
экологии» – г. Томске (2016), юбилейной научно-практической конференции, посвященной 20-летию курса офтальмологии ФПК и ППС СибГМУ «Современные технологии диагностики и лечения заболеваний органа зрения» –
г. Томск (2014).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 работ. Из них 5
статьи в научных журналах, входящих в перечень рецензируемых научных журналов и изданий, 3 статьи в зарубежных изданиях, входящих в базу Scopus.
Структура и объем диссертационной работы. Работа состоит из введения, пяти разделов, заключения и списка литературы из 219 наименований и трех приложений. Всего 179 страниц машинописного текста, включая 95 рисунка и 20 таблиц.
Результатом выполненной работы является достижение поставленной цели
по разработке изолирующей трековой мембраны на основе
полиэтилентерефталата как имплантатов в хирургическом лечении буллезной
кератопатии.
На основе анализа выполненных экспериментальных исследований можно
сделать следующие выводы:
1. Воздействие низкотемпературной атмосферной плазмы на поверхность
трековой мембраны приводит к увеличению параметра шероховатости Sa ~ в 9
раз, формированию деструктивных областей в виде многочисленных, хаотично
распределенных по поверхности неровностей, что обусловлено окислительно–
восстановительными химическими реакциями, протекающими в результате
плазменного воздействия и приводящими к резкому (в 4 раза) увеличению
полярности поверхности.
2. Воздействие плазмы на поверхность мембраны приводит к увеличению
cвободной энергии поверхности до 101,58 ± 7,26 мДж/м2 за счет роста полярной
составляющей и уменьшению краевого угла смачивания на 43,9º ± 2,3º, что
увеличивает проницаемость ТМ.
3. Плазменная обработка поверхности ТМ способствует изменению физико-
механических свойств мембраны: уменьшает удлинение при разрыве на (24 –
53)%, модуль Юнга на (7 – 14)%; относительный предела текучести на (43 – 45)%,
напряжение при растяжении на (24 – 31)%.
4. Воздействие на ТМ γ–излучения 60Co приводит к образованию дефектов
поверхности, которые занимают до 10% от общей площади материала и вызваны
разрывом молекулярных связей полимера, а также к некоторому «сглаживанию»
рельефа плазменно-обработанных мембран вследствие сшивки полимерных цепей
в областях разрывов с формированием диэтиленгликоль – сегментов (Sa
уменьшается с 0,103 мкм до 0,055 мкм (обработка плазмой 30 с) при дозе –
облучения 1 кГр и до 0,035 мкм (обработка плазмой 30 с) при дозе –облучения
10 кГр).
5. Стерилизация γ–облучением Co образцов ТМ, модифицированных
плазмой, уменьшает количество полярных функциональных групп, и, как
следствие, смачиваемость поверхности и проницаемость ТМ.
6. Воздействие малыми дозами γ–стерилизации на ТМ незначительно
увеличивает степень кристалличности и составляет 43,71%, что способствует
изменению физико-механических свойств ТМ: . уменьшается удлинение при
разрыве на (27 – 33)%, модуль Юнга на (11 – 15)%, относительный предел
текучести на 62%, напряжение при растяжении на (46 – 49)%.
7. Воздействие горячим паром при давлении меняет топографию
поверхности ТМ: на поверхности образуются крупные овальной формы дефекты
(«выпячивания») высотой (300 – 400) нм плотностью до 0,007 выступов/мкм2 со
средним диаметром – 3,0 мкм; а также увеличивает поверхностную
шероховатость на 40%.
8. Паровая стерилизация способствует увеличению гидрофобности
поверхности мембран, увеличивая краевой угол смачивания на 10º – 20º,
значительно снижает значение поверхностной энергии модифицированных
мембран до 33,08 мДж/м2, что фактически составляет значения исходных мембран
до плазменной обработки. Подобные изменения связаны в первую очередь с
деградацией поверхности и реакцией гидролиза, которая приводит к
декарбоксилации, циклизации и, как следствие, увеличению циклических
тримеров на поверхности материла, что проявляется в изменении шероховатости
и снижении гидрофильности поверхности.
9. Паровая стерилизация ТМ способствует изменению физико-
механических свойств мембраны: уменьшается удлинение при растяжении от
10,2% до 5,3%, модуль Юнга на 396 ± 57 МПа; предел текучести на 21,5 ± 0,5
МПа, напряжение при растяжении с 71 МПа до 38 МПа.
10. ТМ из ПЭТФ до и после плазменной обработки поверхности не
оказывают цитотоксического действия на изолированные клетки костного мозга и
морфологию монослойных культур мезенхимальных стволовых клеток.
11. Низкотемпературная атмосферная плазма обладает стерилизующей
способностью в режимах обработки образцов по 30, 60 и 90 секунд и может
применяться в качестве стерилизующего агента для ТМ из ПЭТФ, которые
требуют щадящего стерилизационного режима.
12. Трековая мембрана из ПЭТФ со следующими характеристиками:
толщина 8 –мкм, диаметр пор – 5 мкм, плотность 5×108 см-2, проницаемость по
воде 5 мл/минсм2 (при p = 0,1 бар), краевой угол смачивания (30 – 40),
поверхностная энергия (120 – 130) мДж/м2, заряд поверхности – отрицательный,
при имплантации в строму роговицы in vivo при буллезной кератопатии
уменьшает степень гидратации стромы роговой оболочки и способствует
стабилизации патологического процесса.
13. Результаты работы внедрены в учебный процесс кафедры
офтальмологии в разделе «Патология роговицы» ФГБОУ ВО СибГМУ.
Перечень принятых сокращений
ПЭТФ – полиэтилентерефталат;
ТМ – трековая мембрана;
ИК–спектроскопия – инфракрасная спектроскопия;
РЭМ – растровая электронная микроскопия;
АСМ – атомно-силовая микроскопия;
ДСК – дифференциальная сканирующая калориметрия;
ТГА – термогравиметрический анализ;
ДДМ – диско-диффузный метод выявления новобиоцин–резистентности;
МТТ–тест – колориметрический тест для оценки метаболической активности
клеток;
УФ – ультрафиолет;
СЭП – свободная энергия поверхности;
ОВРК – Оуэнса-Вендта-Рабел-Кэлби;
ИОЛ – интраокулярная линза;
ЩФ – щелочная фосфатаза;
МСК – мезенхимальные стромальные клетки;
КОЕ – колониеобразующие единицы;
ГРМ–агар – питательный агар для культивирования микроорганизмов;
ГМФ–бульон – питательный бульон для культивирования микроорганизмов;
РФЭС – рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия.
Помогаем с подготовкой сопроводительных документов
Хочешь уникальную работу?
Больше 3 000 экспертов уже готовы начать работу над твоим проектом!
4.8 (211 отзывов)
4.5 (9 отзывов)
4.6 (71 отзыв)
4.3 (248 отзывов)
4.9 (66 отзывов)
5 (44 отзыва)
4.4 (93 отзыва)
4.7 (96 отзывов)
5 (22 отзыва)
