Разработка методов выявления и идентификации возбудителя бактериальной пятнистости тыквенных культур Acidovorax citrulli (Schaad et al.) на основании изучения его биологии и генетики

Глава 1 Обзор литературы
В обзоре литературы приведены общие сведения о возбудителе бактериальной пятнистости тыквенных культур Acidovorax citrulli (Schaad et al.) – фитосанитарный статус, история изучения, систематическое положение, номенклатура, сведения о типовом материале, морфологические характеристики, географическое распространение, перечень поражаемых растений, способы распространения, симптомы заболевания, вредоносность и экономическое значение. Систематизированы основные наработки в области изучения генетики объекта исследования, показана проблематика применения различных диагностических тестов в связи с высокой степенью генетической изменчивости A. citrulli. На основании проанализированных литературных данных о биологии и генетике A.citrulli выделены наиболее актуальные диагностические тесты и пути их разработки и совершенствования.
Глава 2 Материалы и методы
Материалы исследования. В работе использовали 6 штаммов целевой бактерии – A.сitrulli, 50 штаммов нецелевых бактерий из зарубежных коллекций и 141 штамм нецелевых бактерий из коллекции ФГБУ «ВНИИКР». Руководствуясь Международным стандартом PM 7/98 (3), использовали максимально доступное количество бактерий, отличающихся видовой принадлежностью, географическим происхождением и периодом изоляции, выделенных не только из тыквенных культур, но и из других растений. Также использовали максимально доступное число образцов тыквенных культур, свободных от A. сitrulli, – всего 106 образцов, из которых 30 образцов – вегетативные части растений и 76 образцов – семенной материал. В работе использовали химические реактивы, лабораторную посуду, инструменты и оборудование, характеристики которых соответствовали требованиям системы менеджмента качества, применяемой в аккредитованных испытательных лабораториях.
Методы исследования. В работе использовали общепринятые методы приготовления растворов, буферов и питательных сред, а также микробиологического посева, детекции продуктов ПЦР методом электрофореза, чистки ампликонов, измерения концентрации ПЦР-продукта и бактериальных клеток на спектрофотометре и секвенирования. Выделение ДНК проводили с использованием коммерческих наборов «Проба-ГС», «Проба-НК» («АгроДиагностика», РФ), «Фитосорб», «М-СорбТуб-Автомат-48» («Синтол», РФ), «DNeasy Plant Mini Kit» («Qiagen», Германия) согласно инструкциям производителей. ПЦР проводили с использованием 9 различных праймерных систем: ПЦР-РВ Acit 1 F/R, Acit 1-probe, набор «Acidovorax citrulli-РВ»
(«Синтол», РФ), комплект Acidovorax citrulli-Rt («АгроДиагностика», РФ), AC158F/AC158R, SEQ ID 3/4, PL1/PL2, G12AcFwd/G12AcRev, G2AcFwd/G12AcRev и 8UA/519B. Оценку применимости ПЦР-тестов проводили, руководствуясь Международными стандартами PM 7/76 (5) и PM 7/98 (3). Оценка применимости ПЦР-тестов включала в себя определение аналитической чувствительности, аналитической специфичности, селективности, повторяемости и воспроизводимости. Заключение о соответствии параметра аналитической чувствительности делали при значении показателя 102–103 КОЕ/мл. Заключение о специфичности метода делали при значениях показателей инклюзивности и эксклюзивности 99% или выше. Заключение о соответствии селективности, повторяемости и воспроизводимости делали при соответствии значений данных параметров параметру аналитической чувствительности. Оптимизацию проводили для методов, приведенных в действующих НД PM 7/127 (1) Acidovorax citrulli и МР 67-2015 ВНИИКР. Исследования в рамках МСИ проводили в соответствии с инструкциями, предоставленными провайдером.
Разработка селективной питательной среды для изоляции A. citrulli
С целью придания питательной среде селективных свойств, использовали различные вещества; их концентрации и сочетания друг с другом подбирали исходя из методических рекомендаций, информации о биологии A. citrulli и о микробиоте, содержащейся в семенах тыквенных культур, а также опираясь на опыт применения антибиотиков при изоляции других бактерий. В качестве основы использовали среду Кинг Б. Приготовленные среды использовали для посева чистой культуры A. citrulli и зараженного экстракта семян тыквенных культур и последующего изучения динамики роста микроорганизмов.
Разработка метода обогащения образца
Схема разработки метода обогащения образца представлена на рисунке 1.
Для каждого разведения живой и инактивированной культуры A. citrulli в экстракте использовали по 2 растения огурца в фазе 2–3 настоящих листьев и по 2 части (сегмента) плода кабачка, масса каждой из которых составила 12– 14 г. Для инокуляции растений не насквозь прокалывали стебель и основания черешков листьев, а затем наносили на места проколов капли экстракта. Растения, инокулированные экстрактами с различной степенью заражения, и растения, содержащие живую и инактивированную культуру A.citrulli, пространственно изолировали друг от друга. Растения содержали при 27 °C, относительной влажности воздуха 55 % и световом дне продолжительностью 14часов. Части плода кабачка инокулировали следующим способом: в стерильные чашки Петри помещали части плода, предварительно закрыв дно чашек фильтровальной бумагой для абсорбции лишней влаги.
Зараженный экстракт впрыскивали с помощью шприца в 5–7 различных участков сегмента плода кабачка. Затем чашки накрывали крышками и инкубировали при 37 °C без освещения.
Рисунок 1 – Схема разработки метода обогащения образца. 8` (8 разведение) соответствовало концентрации Acidovorax citrulli 100 КОЕ/мл
Через 68 ч. инокулированные растения и части плодов исследовали в соответствии с МР 67-2015 ВНИИКР (вторая редакция).
Разработка ПЦР-теста в режиме «реального времени»
Для поиска мишени
соответствующие кодирующим
A. citrulli и 9 геномных сборок (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/) в сентябре 2019 г. (табл. 1).
белки, сборок RefSeq
использовали аннотированные последовательностям 9 геномных
A. avenae, загруженным с NCBI
С целью получения неизбыточных наборов белков для каждого из геномов каждый набор белковых последовательностей кластеризовали с помощью программы cd-hit при пороге идентичности 90 % и допустимой разнице в длине последовательностей 80 %. Неизбыточные наборы белковых последовательностей 9 штаммов A. citrulli и 9 штаммов A. avenae помечали в соответствии с видом и кластеризовали с помощью программы cd-hit при пороге идентичности в 60% и допустимой разнице в длине последовательностей 80 %. Для идентификации белковых кластеров, присутствующих во всех 9 штаммах A. citrulli и отсутствующих во всех 9 штаммах A. avenae применяли скрипт на языке Python. Полученные белковые кластеры, присутствующие у A. citrulli и отсутствующие у A. avenae, сравнивали с известными белковыми последовательностями (nr) с помощью программы blastp с целью оценки их специфичности для A. citrulli.
Таблица 1. Геномные сборки штаммов Acidovorax citrulli и Acidovorax avenae, использованные для биоинформатического предсказания ПЦР-мишени
Вид
Acidovorax Acidovorax Acidovorax Acidovorax Acidovorax Acidovorax Acidovorax Acidovorax Acidovorax Acidovorax Acidovorax Acidovorax Acidovorax Acidovorax Acidovorax Acidovorax Acidovorax Acidovorax
citrulli citrulli citrulli citrulli citrulli citrulli citrulli citrulli citrulli avenae avenae avenae avenae avenae avenae avenae avenae avenae
Штамм
AAC00-1 KACC17005 M6
DSM 17060 AAC00-1 #5684 AAC00-1 #5596 AAC00-1 #5593 pslb65
tw6
ATCC 19860 T10_61 АА81_1 MD5
SH7 AA78_5 AA99_2 KL3
SF12
Идентификатор RefSeq Assembly
GCF_000015325.1 GCF_002441975.1 GCF_001593665.2 GCF_900100305.1 GCF_003096435.1 GCF_003387255.1 GCF_003664145.1 GCF_000948135.1 GCF_000968215.1 GCF_000176855.2 GCF_001282395.1 GCF_003029685.1 GCF_003029725.1 GCF_003029785.1 GCF_003029805.1 GCF_003029825.1 GCF_003029905.1 GCF_003030005.1
Число предсказанных белков
4581
4442
4178
4167
4619
4546
4541
4157
4267
4659
4574
4701
4345
3958
3769
3580
3532
3636
Специфичными считали белки, имеющие низкое сходство (<70% идентичности) с белками других бактериальных видов, как родственных, так и не родственных A. citrulli. Из анализа исключили фаговые белки, а также белки, имеющие внутривидовую вариабельность у штаммов A.citrulli, как неподходящие в качестве мишени. Праймеры подбирали с использованием программы PrimerBlast. Праймеры и зонд произведены ЗАО «Евроген» (Россия). Глава 3 Результаты исследований и обсуждение Оптимизация методов проведения лабораторного исследования Отмечено, что на среде Кинг Б скорость роста культуры A. сitrulli выше, чем на среде NSA, колонии достигают большего размера и характеризуются морфологическим единообразием. При температурах 25 °С и ниже и 41 °С и выше существенно замедляется скорость роста культуры A.сitrulli и уменьшается колониеобразование. В то же время, при 25 °С наблюдается активный рост других бактерий, представляющих микробиоту тыквенных культур, таких как A.cattleyae, Sphingomonas paucimobilis, Microbacterium phyllosphaerae и Athrobacter sp. Анализ динамики роста бактерий на чашках Петри показал, что температура инкубирования 37–40 °С оказывает сильное ингибирующее воздействие на рост и развитие вышеуказанных сопутствующих бактерий, а для A. сitrulli является наиболее благоприятной. Таким образом, оптимальными условиями для культивирования A. сitrulli является температурный режим 37–40 °С и среда Кинг Б. Опыт по оптимизации подготовки образца семян для анализа показал, что лучшим вариантом является метод, при котором смесь семян и фосфатно- солевого буфера (PBS) в соотношении 1 г семян к 2 мл PBS встряхивают на шейкере при 18–24 °С и режиме 90 об/мин в течение 24 часов, полученный экстракт семян центрифугируют при режиме 1200g, 4°С, 10мин., затем надосадочную жидкость в новых пробирках центрифугируют при режиме 10000 g, 4 °С, 15 мин. и ресуспендируют осадок в 1 мл PBS. Изучение эффективности методов выделения ДНК показало, что среди используемых коммерческих наборов предпочтительными для работы с A.сitrulli являются «Проба-ГС», «Проба-НК» («АгроДиагностика», РФ) и «Фитосорб» («Синтол», РФ). В ходе оптимизации условий проведения ПЦР-тестов установили, что использование в составе реакционной смеси мастер-микса 5x MasCFEMix-2025 («Диалат», РФ) для проведения ПЦР-РВ Acit 1 F/R, Acit 1-probe более эффективно по сравнению с 5x qPCRmix-HS («Евроген», РФ), а использование для ПЦР SEQ ID 3/4 5x MasDDTaqMIX-2025 («Диалат», РФ) более эффективно по сравнению с 5x ScreenMix-HS («Евроген», РФ). Оценка применимости ПЦР-тестов Установлено, что среди изучаемых тестов отсутствуют те, которые обладают высокой чувствительностью и высокой специфичностью одновременно (табл. 2). Таблица 2 – Значения параметров оценки применимости ПЦР-тестов Параметр Аналитическая чувствительность (значение) Аналитическая чувствительность (соответствие) ПЦР-тест 1234567 102, 102, 100% 100% Соотв. Соотв. 102, 104, 100%; 100% 103, 50% Соотв. Не соотв. 105, 100%; 104, 100%; 105, 104, 50% Не соотв. 103, 50% 100% Не Не соотв. соотв. Число достоверных положительных результатов при тестировании штаммов Acidovorax citrulli/ Общее протестированных штаммов Acidovorax citrulli, шт. число 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 Инклюзивность, % 100 100 100 100 100 100 Число достоверных отрицательных результатов при тестировании образцов, не содержащих ДНК Acidovorax citrulli/ Общее число образцов, 124/153 122/153 133/153 145/153 152/153 152/153 153/153 Параметр ПЦР-тест 1234567 шт. Эксклюзивность, % Аналитическая специфичность соотв. (соответствие) Селективность 102, (значение) 100% Селективность (соответствие) Повторяемость 102, (значение) 100% Повторяемость (соответствие) Воспроизводимость 102, (значение) 100% Воспроизводимость (соответствие) 81,0 79,7 86,9 94,8 99,3 99,3 100 Не соотв. Соотв. Соотв. Соотв. 102, 102, 100% 100% Соотв. Соотв. 102, 102, 100% 100% Соотв. Соотв. 102, 102, 100% 100% Соотв. Соотв. 104, 100%; 103, 50% Соотв. 104, 100%; 103, 50% Соотв. 104, 100%; 103, 46% Соотв. —— Соотв. —— Не Не соотв. Не соотв. Соотв. Соотв. 105, 100%; 104, 50% Соотв. 105, 100%; 104, 50% —— Соотв. —— 105, 100%; 104, 50% —— Соотв. —— Примечание. 1 – Acit 1 F/R, Acit 1-probe; 2 – «Acidovorax citrulli-РВ» «Синтол»; 3 – Acidovorax citrulli-Rt «АгроДиагностика»; 4 – AC158F/AC158R; 5 – SEQ ID 3/4; 6 – PL1/PL2; 7 – G12AcFwd/G12AcRev; шт. – штук; Соотв. – соответствует; Не соотв. – не соответствует; «—» – не проводилось. ПЦР-РВ Acit 1 F/R, Acit 1-probe, «Acidovorax citrulli-РВ» «Синтол» и Acidovorax citrulli-Rt «АгроДиагностика» являются высокочувствительными, но ввиду низкой специфичности могут использоваться в диагностике A. citrulli только в качестве отборочных тестов. ПЦР-тест AC158F/AC158R является недостаточно чувствительным для использования в качестве отборочного, кроме того, специфичность данной ПЦР не соответствует требуемому значению специфичности для использования в качестве подтверждающего теста. Тесты ПЦР SEQ ID 3/4, PL1/PL2 и G12AcFwd/G12AcRev являются низкочувствительными, но высокоспецифичными и могут быть применены в качестве подтверждающих диагностических тестов для A. citrulli. Участие в Международных МСИ Целью Международных МСИ по обнаружению и идентификации A. citrulli являлась оценка воспроизводимости диагностических методов лабораториями, осуществляющими деятельность в области фитосанитарного контроля в Италии, Франции, Нидерландах, России, Греции и Турции. Участие в МСИ подразумевало следующие этапы исследования: изоляция A. citrulli на двух полуселективных питательных средах, идентификация A.citrulli и группирование изолятов на основе молекулярных методов, изучение патогенности A. citrulli на растениях дыни и арбуза, использование ПЦР-РВ для обнаружения патогена в семенном экстракте. В результате получены ценные сведения, касающиеся выявления и идентификации A. citrulli, освоены новые методы лабораторной диагностики. Кроме того, анализ совокупности полученной информации позволил определить проблемы имеющихся диагностических тестов и наметить пути проведения улучшений существующего НД по обнаружению и идентификации A. citrulli. Разработка селективной питательной среды для изоляции A. citrulli Установлено, что ряд используемых веществ и их концентраций влияет на динамику роста A. citrulli по сравнению с контролем (табл. 3), а также на развитие сопутствующих микроорганизмов. Сопоставив данные наблюдений за ростом A. citrulli и сопутствующих микроорганизмов на питательных средах с добавлением различных антибиотиков, установили, что сочетание таких веществ, как циклогексимид 200 мг/л и пенициллин G 0,5, 0,8, 1,0 и 4,0 мг/л, придает питательной среде селективные для A. citrulli свойства. Таблица 3 – Динамика роста Acidovorax citrulli на различных средах Размер колоний Acidovorax citrulli, мм В 2 4 6 8 10 12 13 В-ва и их конц., мг/л Ц 200 Ц 200 + Б 100 Ц 200 + Б 150 Ц 200 + Б 200 Ц 200 + Б 250 Ц 200 + П 100 Ц 200 + П 1,0 Ц 200 + П 4,0 Ц 200 + П 0,8 + Т 50 + Г 5,0 Т 50 + Г 5,0 Контроль 12 ч 0 0 0 0 0 0 24 ч 36 ч 48 ч 60 ч 72 ч 84 ч 96 ч 108 ч 1,02,04≥4≥4≥4≥4≥4 0,9 1–1,54 ≥4 ≥4 ≥4 ≥4 ≥4 0 <0,1 1–1,5 4 4 ≥4 ≥4 ≥4 120 ч ≥4 ≥4 ≥4 0 0 <0,1 0,2–1,5 0,2–1,5 0,2–1,5 0,2–1,5 0,2–1,5 0,2–1,5 0 0 0 0 0 <0,1 0,3–0,5 0,3–1 0,5–1,5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Ц 200 + П 0,5 0 0,9 2 4 ≥4 ≥4 ≥4 ≥4 ≥4 ≥4 Ц 200 + П 0,8 0 0,9 2 4 ≥4 ≥4 ≥4 ≥4 ≥4 ≥4 0 <0,1 0 0 0 <0,1 1–1,5 4 ≥4 ≥4 ≥4,0 0,5–1 3,5 4 4 ≥ 4 ≥4 ≥4 ≥4 ≥4 ≥4 ≥4 ≥4 ≥4 ≥4 ≥4 ≥4 ≥4 ≥4 ≥4 ≥4 Ц 200 + П 0,8 + Т 50 0 0,9 2 4 ≥4 ≥4 ≥4 ≥4 ≥4 ≥4 1–1,5 4 ≥4 ≥4,0 ≥4 ≥4≥4≥4 ≥4≥4≥4 0 0,324 124 Примечание: В – вариант; В-ва – вещества; конц. – концентрация; К – контроль; Ц – циклогексимид; Б – бацитрацин; П – пенициллин G; Т – 2,3,5- трифенилтетразолий хлористый; Г – генцианвиолет. При этом отмечено ингибирование роста A.citrulli в вариантах с концентрациями пенициллина G 1,0 и 4,0 мг/л, в то время как более низкие концентрации оказывают подавляющее воздействие только на сопутствующие микроорганизмы. Через 48 ч. после посева на чашки со средой варианта 8 экстрактов семян, зараженных A. citrulli в концентрациях 102 и 103 КОЕ/мл, культура пригодна для проведения скрининга, а сопутствующие микроорганизмы отсутствуют. В то же время в контрольном варианте целевую культуру сложно выделить из сопутствующих (рис. 2). I II III Рисунок 2 – Культура Acidovorax citrulli через 48 часов после посева зараженного экстракта. I – вариант 8, 102 КОЕ/мл; II – вариант 8, 103 КОЕ/мл; III – контроль, 102 КОЕ/мл Использование 2,3,5-трифенилтетразолия хлористого (ТТХ), как в варианте 11, контрастно выделяет целевые колонии, упрощая процесс проведения скрининга (рис. 3). Рисунок 3 – культура Acidovorax citrulli на среде варианта 11 14 Применение среды Кинг Б с добавлением циклогексимида 200 мг/л в сочетании с пенициллиномG 0,8мг/л и ТТХ 50мг/л позволит проводить процесс изоляции культуры A. citrulli из семян тыквенных культур даже с низким уровнем заражения. Разработка метода обогащения образца При проведении ПЦР-РВ получены значения пороговых циклов (Ct), характеризующих концентрацию целевой ДНК-матрицы в образцах. Значения Ct (табл. 4) показывают, что: ПЦР-РВ отрицательна с образцами ДНК из частей плодов, инокулированных нежизнеспособной культурой A. citrulli и положительна со всеми образцами ДНК из частей плодов, инокулированных живой культурой A.citrulli, причем концентрация целевой ДНК-мишени увеличена на несколько степеней. Таблица 4 – Значения Ct для образцов ДНК, выделенной из зараженных экстрактов, растений и частей плодов тыквенных культур после инокуляции После инокуляции растений После инокуляции частей плодов Состояние бактерий экстракте для клеток суспензия в экстракте инокуляции Acidovorax citrulli, КОЕ/мл Инактивированная 100 культура Инактивированная 101 культура Инактивированная 102 культура Инактивированная 103 культура Инактивированная 104 культура Инактивированная 105 культура Живая культура 100 Живая культура 101 Живая культура 102 Живая культура 103 Живая культура 104 Живая культура 105 Незараженный экстракт – Повторности 1212 в этими экстрактами Концентрация Исходная – – – – – – – – – 30,1 – – 28,2 – – 24,8 – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – –– 30,0 24,1 – –– 22,7 23,0 – –– 21,4 23,3 29,5 –– 18,3 19,2 27,5 –– 18,2 18,0 24,6 29,0 29,1 17,7 17,4 15 Для применения метода обогащения образца более пригодны части плодов тыквенных культур, чем растения. Результатом инкубирования в течение 3 суток при 37 °C стало разрушение молекул ДНК инактивированных клеток A. citrulli в частях плодов тыквенных культур. В то же время при аналогичных условиях живая культура патогена увеличила число клеток на 3–4 степени. Схожие данные получены в каждом из повторов эксперимента. Метод обогащения на практике позволит получить достоверную информацию о наличии или отсутствии живой культуры A.citrulli в исследуемом образце. Метод является как минимум в 3–4 раза более быстрым, чем аналогичные методы, требующие ожидания появления симптомов на тканях инокулируемого растения или плода. Разработка ПЦР-теста в режиме «реального времени» В результате кластеризации белковых последовательностей 9 штаммов A. citrulli и 9 штаммов A. avenae идентифицированы 4744 белковых кластера, содержащих 2 и более белков. Из них 153 кластера (размером от 60 до 1389 аминокислот) присутствовали во всех 9 штаммах A. citrulli и отсутствовали во всех 9 штаммах A.avenae. В результате сравнения полученных белковых кластеров с известными белковыми последовательностями (nr), многие из них отбросили в качестве кандидатов на ПЦР-мишень, поскольку они имели высокое сходство с белками других бактериальных видов и родов (таких как Variovorax, Ottowia, Stenotrophomonas, Bordetella и др.), хотя их кодирующие последовательности и отсутствовали в геноме близкородственного вида A. avenae. Таким образом идентифицирован белок S-box PAS домена длиной 524 аминокислотных остатка (WP_011796953.1). Данный белок показал идентичность во всех 9 штаммах A. citrulli и не имел сходства с другими белками выше 70%. Кодирующую последовательность A.citrulli штамма AAC00-1 # 5596 (NZ_QUNC01000001.1), соответствующую белку WP_011796953.1 (locus_tag="C8E07_RS00895”), в дальнейшем использовали для разработки праймеров. Подобраны праймеры и зонд на ген S-box PAS домена (локус C8E07_RS00895) A.citrulli штамма AAC00-1 #5596 (NZ_QUNC01000001.1) (табл. 5). Таблица 5 – Последовательности праймеров (F, R) и зонда (P) на локус C8E07_RS00895 Праймер/ зонд Последовательность (5’-3’) Tm Цепь Начало в AAC00-1 #5596 Конец в AAC00-1 #5596 F CCAAAGCCAGCACGAGGAGA 62.45 + R GAACAGCGAGACGGAGTGGT 62.14 – FAM- P ACGCGCATCAACGGCGTCATC 62 + 208579 208598 208735 208716 позволяет детектировать A.citrulli в образце в концентрации 103 КОЕ/мл. 16 208600 208622 Оценка аналитической чувствительности показала, что новый тест G-BHQ1 Оценку аналитической специфичности нового метода проводили с образцами ДНК в концентрации 107 генетических копий/мл в трехкратной повторности для каждого образца. Со всеми 6 штаммами A. citrulli из коллекции ФГБУ «ВНИИКР» получены положительные результаты ПЦР-РВ, а с 188 нецелевыми бактериальными штаммами получены отрицательные результаты ПЦР-РВ. Таким образом, новый тест ПЦР-РВ, основанный на нуклеотидной последовательности гена S-box PAS домена, позволяет проводить выявление и идентификацию A.citrulli, избегая перекрестных реакций с нецелевыми бактериями. Разработка новой схемы диагностики A. citrulli Результаты проведенных опытов позволили разработать новую схему выявления и идентификации A. citrulli (далее – Схема) (рис. 4). Рисунок 4 – Новая схема диагностики Acidovorax citrulli 17 Схема включает только обязательные к исполнению этапы лабораторного исследования образца подкарантинной продукции. 1. Проводят отбор лабораторной пробы от поступившего на исследование образца подкарантинной продукции (семена, плоды, вегетативные части растений и целые растения тыквенных культур). Если образец представляет собой растительный экстракт или бактериальную культуру, переходят к выделению ДНК. Если образец представляет собой препарат ДНК, переходят к идентификации методом ПЦР-РВ. 2. Проводят подготовку аналитической пробы. 3. Проводят выделение ДНК из 200 мкл аналитической пробы, используя набор «Проба-ГС», «Фитосорб» или «Проба-НК» согласно инструкции производителя. К оставшейся после отбора 200 мкл пробе добавляют 1–2 капли глицерина и помещают на хранение при -18–(-22) °С. 4. С выделенной ДНК проводят один из отборочных тестов: ПЦР-РВ Acit 1 F/R, Acit 1-probe, «Acidovorax citrulli-РВ» «Синтол» (РФ) и Acidovorax citrulli- Rt «АгроДиагностика» (РФ). При получении отрицательного результата отборочного теста делают заключение об отсутствии Acidovorax citrulli в образце. При получении положительного результата отборочного теста проводят подтверждающие ПЦР-тесты. 5. Проводят подтверждающие тесты: ПЦР-РВ PAS F/R, PAS-P и ПЦР SEQ ID 3/4 с реамплификацией. При получении отрицательного результата подтверждающего теста считают, что A. citrulli в образце не выявлен. При получении положительного результата подтверждающего теста переходят к методу обогащения образца. 6. Проводят метод обогащения образца. Инокулированные образцы инкубируют при 37 °C и анализируют через 2 суток. Полученные образцы используют для подготовки аналитических проб, выделения ДНК и проведения подтверждающих тестов: ПЦР-РВ PAS F/R, PAS-P и ПЦР SEQ ID 3/4. При получении отрицательного результата подтверждающих тестов делают заключение об отсутствии живых клеток и о наличии генетического материала A. citrulli в образце. При получении положительного результата подтверждающего теста переходят к изоляции культуры A. citrulli. 7. Проводят изоляцию культуры A. citrulli из проб после обогащения на среде Кинг Б с добавлением циклогексимида 200 мг/л в сочетании с пенициллином G 0,8 мг/л и ТТХ 50 мг/л. Через 24 ч. после посева и инкубирования при 37 °С проводят осмотр чашек на наличие колоний A. citrulli. Осмотр проводят в течение 5 суток после посева. С типичными колониями проводят один из подтверждающих ПЦР-тестов: ПЦР-РВ PAS F/R, PAS-P и ПЦР SEQ ID 3/4. При получении положительного результата делают заключение о выявлении A. citrulli в образце. Заключение о выявлении A. citrulli делают при получении положительного результата хотя бы одного из подтверждающих тестов при анализе изолированных колоний или проб, полученных при обогащении образца. Предложенная схема представляет собой центральное звено нового диагностического протокола – МР 67-2015 ВНИИКР (третья редакция). Методические рекомендации по выявлению и идентификации возбудителя бактериальной пятнистости тыквенных культур Acidovorax citrulli (Schaad et al.). – 2020», рекомендуемого к внедрению и использованию в лабораториях, осуществляющих свою деятельность в области фитосанитарного контроля, а также при исследовании фитопатогенов тыквенных культур. Практическое применение диагностических методов В 2018 г. проводили обследование посадок арбуза в Центральной части Крымского полуострова. В период проведения обследований растения находились в фазе плодоношения. При сборе образцов особое внимание уделяли растениям с проявлениями хлорозов, некротических пятен и растрескиваний, а также плодам с гнилями. Отобранные образцы исследовали согласно МР No 67-2015 ВНИИКР (вторая редакция) на показатель бактериальная пятнистость тыквенных культур Acidovorax citrulli (Schaad et al.) в испытательной лаборатории филиала ФГБУ «ВНИИКР» в Республике Крым. Обследование провели на площади посадок арбуза около 70 га. В процессе проведения обследований обнаружили растения с симптомами в виде пятнистостей, гнилей, увяданий, хлоротических и некротических повреждений. От таких растений отобрали 38 образцов, представлявших собой здоровые ткани вегетативных частей (листьев и плетей), части растений с симптомами и части плодов арбуза. Тестирование образцов показало, что A.citrulli в исследуемых образцах отсутствует. В 2020 г. проводили исследование образца семян огурца, поступившего из Китайской Народной Республики. Исследование проводили в соответствии со Схемой (рис. 4). Тестирование методами ПЦР-РВ Acit 1 F/R, Acit 1-probe, ПЦР-РВ PAS F/R, PAS-P и ПЦР SEQ ID 3/4 показало положительный результат. Исследование образца методами изоляции и обогащения показало, что в семенах отсутствуют живые клетки A.citrulli. Тогда, в качестве подтверждающего метода, провели секвенирование продукта ПЦР SEQ ID 3/4. В результате сравнения полученной последовательности с бактериальными геномами, размещенными в NCBI, установлено 100 % сходство выявленной в образце семян огурца ДНК с аналогичной последовательностью генома A. citrulli (рис. 5). Рисунок 5 – Результат выравнивания полученной путем секвенирования последовательности в NCBI Аналогично продвигалось исследование образца семян дыни, поступившего из Италии. Таким образом, установили наличие генетического материала A. citrulli в указанных образцах. Выявление A. citrulli в образцах продукции тыквенных культур произведено в практической деятельности карантинной службы РФ впервые. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 1. Проведена апробация, оценка применимости и совершенствование существующих диагностических методов для A. сitrulli, в том числе в рамках участия в Международных МСИ. Сравнение агаризованных питательных сред показало, что наиболее оптимальной для A.сitrulli является среда КингБ. Установлено, что температура 37–40 °С является оптимальной для A. сitrulli, при этом оказывая сильное ингибирующее воздействие на развитие сопутствующих микроорганизмов. Оптимизирован способ подготовки аналитических проб из семян, при этом установлено, что данный способ не приводит к снижению эффективности выделения A. сitrulli. Установлено, что среди коммерческих наборов для выделения ДНК высокоэффективными являются «Проба-ГС», «Проба-НК» и «Фитосорб». Оптимизирован состав реакционной смеси для проведения классических ПЦР и ПЦР-РВ. Установлено, что применяемые мастер-миксы для ПЦР оказывают существенное влияние на чувствительность тестов. Наиболее эффективным из изучаемых миксов для ПЦР-РВ Acit 1 F/R, Acit 1-probe является 5x MasCFEMix-2025, «Диалат» (РФ), а для классической ПЦР SEQ ID 3/4 – 5x MasDDTaqMIX-2025, «Диалат» (РФ). Установлены критерии применимости существующих ПЦР-тестов. В соответствии с полученными данными, отборочными тестами, ввиду их высокой чувствительности, следует считать ПЦР-РВ Acit 1 F/R, Acit 1-probe, набор «Acidovorax citrulli-РВ» «Синтол» и комплект Acidovorax citrulli-Rt «АгроДиагностика». Подтверждающими тестами, ввиду их высокой специфичности, следует считать ПЦР SEQ ID 3/4, PL1/PL2 и G12AcFwd/G12AcRev. 2. Разработана селективная питательная среда для изоляции культуры Acidovorax citrulli, что позволяет проводить изоляцию бактерии с максимальной эффективностью даже при низком уровне заражения образца. 3. Впервые разработан метод обогащения образца, что позволяет успешно проводить выявление и идентификацию A. citrulli даже при низком содержании фитопатогена в образце и существенно сокращает время, необходимое для проведения диагностики. 4. Разработан тест на основе ПЦР-РВ для идентификации A.citrulli, оценка аналитической специфичности которого показала лучшие результаты по сравнению с имеющимися тестами ПЦР-РВ. 5. На основании данных, полученных в результате настоящего исследования, составлена новая схема проведения процедуры выявления и идентификации возбудителя бактериальной пятнистости тыквенных культур Acidovorax citrulli (Schaad et al.) в образцах подкарантинной продукции. Данная схема позволяет проводить диагностику фитопатогена максимально эффективно, достоверно, быстро и с минимальными затратами. 6. Впервые в Российской Федерации проведены обследования посадок тыквенных культур на территории Республики Крым, в результате которых A. сitrulli не выявлен. Кроме того, при использовании новой диагностической схемы впервые в практической деятельности карантинной службы РФ произведено выявление A.citrulli в образцах импортной подкарантинной продукции.