Разработка состава, технологии получения и фармацевтический анализ гемостатических лекарственных форм, в том числе с использованием наночастиц железа

Глава 1 Обзор литературы
Общая концепция обзора литературы представлена по трем направлениям: сведения о современных гемостатических средствах, присутствующих на фармацевтическом рынке; новые технологии разработки и создания гемостатических лекарственных средств; особенности технологии получения и использования наночастиц в медицинской практике. Обзор литературы отражает основные положения создания местных гемостатических форм, в том числе содержащих наночастицы железа.
Глава 2. Объекты и методы исследования
Во второй главе дана характеристика объектов исследования, вспомогательных материалов, реактивов и оборудования. Приведены методики, используемые для получения и стандартизации местного гемостатического лекарственного средства в двух лекарственных формах.
Объекты исследования. Для проведения диссертационного исследования были использованы: аминокапроновая кислота (ФС.2.1.0001.15, ГФ XIII изд.), железа (III) хлорид 6- водный (ТУ 2152-003-68879995-2014, ГОСТ 4147-74), наночастицы железа, покрытые углеродом Fe@C (ГОСТ Р 56748.1-2015, ГОСТ Р 57909-2017), наночастицы оксида железа Fe3O4 (ГОСТ Р 56748.1-2015, ГОСТ Р 57909-2017).
Методы исследования. В рамках данного исследования были использованы различные методы, среди которых можно выделить:
1. Организационно-управленческие – для определения актуальности разработки новых гемостатических форм (контент-анализ, социологическое исследование);
2. Технологические и физико-химические – для обоснования оптимального состава и определения качественного и количественного содержания действующих веществ в разработанных формах, а также для разработки технологии их получения (фазовая диаграмма состояния, функция желательности, изучение растворимости, водородного показателя, реологических характеристик, содержания наночастиц, установление срока годности);
3. Биофармацевтические – для установления микробиологической чистоты и изучения специфической гемостатической активности разработанных форм (микробиологические и фармакологические исследования).
Для обработки результатов, полученных в экспериментальных исследованиях и валидации методик анализа, были использованы математико-статистические методы.
Алгоритм диссертационного исследования по разработке состава и технологии получения местного гемостатического средства, в том числе с наночастицами, представлен на рисунке 1.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 3. Разработка состава и технологии получения лекарственных форм в том числе
с использованием наночастиц
Обоснование состава гемостатических лекарственных форм местного применения. На основании данных государственного реестра лекарственных средств был проведен анализ фармацевтического рынка. Проведенный контент-анализ номенклатуры ассортимента фармацевтического рынка зарегистрированных гемостатических лекарственных средств Российской Федерации, представленный группой «B02 Гемостатические препараты» показал, что в нее входит 25 действующих веществ под международным непатентованным наименованием (МНН) и 68 торговых наименований. Группа «B02 Гемостатические препараты» представлена 2 подгруппами: «B02A – Ингибиторы фибринолиза» и «B02B – Витамин К и другие гемостатики». Анализ подгрупп показал, что наибольшее количество МНН содержит подгруппа «B02B – Витамин К и другие гемостатики». Также было установлено, что подгруппа «B02A – Ингибиторы фибринолиза» представлена 29 фирмами-производителями; а подгруппа «B02B – Витамин К и другие гемостатики» – 94 фирмами-производителями.
Доля отечественных фирм-производителей на рынке гемостатических препаратов составляет 69,1%. Доля импортных – 30,9%. Анализ по количеству стран-производителей показал, что лидерами на рынке являются: Россия (68,75%), Германия (6,25%), США (4,46 %). Наибольший удельный вес занимает форма выпуска – лиофилизат для приготовления раствора для внутривенного введения (24,29%). Наибольшее место в структуре ассортимента занимают факторы свертывания крови (60,0 %).
Несмотря на многообразие выпускаемых форм, можно отметить, что гемостатические препараты в виде растворов имеются, но представлены недостаточно. В то время как мягкие а мягкие лекарственные формы, содержащие наночастицы не зарегистрированы на территории России. Все это позволяет сделать вывод о необходимости создания новых гемостатических средств.
При выборе состава гемостатического средства принимался во внимание тот факт, что аминокапроновая кислота является известным препаратом и используется в медицине в виде раствора для инфузий (концентрация составляет 5,0%) и в форме салфеток для остановки кровотечения Активтекс АКФ(в составе аминокапроновая кислота, фурагин). Аминокапроновая кислота в составе ингибирует активаторы профибринолизина и тормозит его превращение в фибринолизин, стимулирует образование тромбоцитов, сенсибилизирует тромбоцитарные рецепторы к тромбину, тромбоксану А2 и другим эндогенным агрегантам. В связи с этим, разрабатывались формы для местного применения с концентрацией аминокапроновой кислоты в составе 5,0%.
Рисунок 1 – Дизайн диссертационного исследования
При выборе компонентов при создании гемостатической формы руководствовались тем, что ион железа входит всостав многих гемосодержащих соединений (оксидаз, цитохромов, миоглобина, гемоглобина), выполняющих в организме каталитическую и регуляторную функции. Ионы трехвалентного железа при контакте с кровью вызывают мгновенное осаждение белков крови, тем самым образуя сгусток. Кроме того, ион железа оказывает противоанемическое действие, повышает содержание железа в организме, стимулирует эритропоэз, обратимо связывает кислород и регулирует окислительно-
восстановительные реакции организма.
Наночастицы на основе металлов, в частности железа, являются одним из
перспективных направлений в медицине и фармации. Существуют публикации в зарубежных и отечественных источниках, в которых отражены антисептические, ранозаживляющие, репаративные свойства наночастиц железа. Следовательно, существует большой потенциал для дальнейших разработок в области применения наночастиц железа, в том числе для создания новых препаратов, обладающих выраженным гемостатическим действием. Таким образом, в качестве исходных ингредиентов были выбраны следующие фармацевтические субстанции: кислота аминокапроновая, железа (III) хлорид 6-водный и наночастицы железа двух видов.
Обоснование состава раствора для наружного применения. Методом обоснования состава раствора для наружного применения служит метод построения фазовой диаграммы (диаграммы состояния). С целью подбора оптимального соотношения компонентов была приготовлена серия композиций различного количественного состава. В серию вошло 243 состава гемостатического средства. Результаты эксперимента представлены в виде концентрационного треугольника на рисунке 2.
Рисунок 2 – Фазовая диаграмма водных растворов компонентов тройной системы «Железа (III) хлорид 6-водный – Аминокапроновая кислота – Натрия хлорид»
Примечание. Зона No1 – стабильность системы, Зоны No2,3,4 – нестабильность системы
Проанализируем ход растворимости, рассматривая диаграмму против часовой стрелки с верхней вершины треугольника (вершина B).
Область гомогенного раствора, зона No1 (рисунок 2), находящаяся в центральной части фазовой диаграммы, ограничена линиями выпадения осадков. Данная зона (зона термодинамического равновесия) характеризуется пропорциональными концентрациями аминокапроновой кислоты (0,1 – 0,3 аб. ед.), железа (III) хлорида 6-водного (0,2-0,3 аб. ед.) и натрия хлорида (0,2 – 0,4 аб. ед.). С химической точки зрения это обусловлено образованием комплексной соли железа (III) и аминокапроновой кислоты.
Для зоны No2 (рисунок 2) характерно минимальное содержание аминокапроновой кислоты. В связи с этим, pH среды жидкой лекарственной формы сдвигается в щелочную сторону. Можно предположить, что с течением времени в водном растворе гемостатического средства происходит гидролиз железа (III) хлорида 6-водного с выпадением бурого осадка гидроксида железа III.
Для зоны No3 (рисунок 2) характерно максимальное содержание аминокапроновой кислоты (0,4 – 0,5 гмл) и минимальные концентрации железа (III) хлорида 6-водного и натрия хлорида (0,1-0,2 гмл). Данная зона также гетерогенна. Термодинамическую нестабильность можно объяснить тем, что с течением времени происходит распад комплекса железа с аминокапроновой кислотой (рис.4). В связи с чем, в дальнейшем происходит выпадение осадка гидроксида железа (III) и выделение свободной аминокапроновой кислоты.
Зоне No 4 (рисунок 2) соответствует наименьшей концентрации натрия хлорида (0,1-0,2 гмл) и наибольшим концентрациям железа (III) хлорида 6-водного и аминокапроновой кислоты (0,4 – 0,5 гмл), растворы являются гетерогенными. Термодинамическую

нестабильность можно объяснить образованием соли между аминокапроновой кислотой и ионами натрия. В связи с чем, происходит сдвиг рН раствора в щелочную сторону и выпадение осадка гидроксида железа (III).
Анализ фазовой диаграммы изученной системы показал различное влияние природы гемостатического средства на взаимную растворимость в нем компонентов. В тройной системе «Железа (III) хлорид 6-водный – Аминокапроновая кислота – Натрия хлорид» выявлена зависимость стабильности лекарственной формы от мольного соотношения компонентов. Наиболее стабильными при хранении показали себя системы с пропорциональными концентрациями действующих веществ. С химической точки зрения это обусловлено образованием комплексной соли железа (III) и аминокапроновой кислоты.
Обоснование состава мягких лекарственных форм, в том числе с наночастицами железа. Методом обоснования состава разрабатываемых мягких гемостатических лекарственных форм служит метод построения обобщенной функции желательности Харрингтона. Учитывая приведенные критерии выбора формообразующих основ и вспомогательных веществ, а также индивидуальные особенности многокомпонентных форм, было изучено 6 модельных образцов (таблица 1). Все мягкие ЛФ представляли собой массу темно-коричного цвета, без видимых механических включений, обладающую вязкоупругими свойствами. Выборка для каждого образца мягкой формы составила 10 опытов. Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием t-критерия Стьюдента и пакета стандартных программ Statistica. Исследуемые показатели качества для образцов мягкой лекарственной формы представлены в таблице 1.
Таблица 1 – Значения каждого параметра оптимизации для модельных составов
Состав
Органолептические показатели
Пластическая вязкость, Па×с
0,27±0,02 0,39±0,03 0,40±0,03 0,43±0,03 0,49±0,03 0,47±0,03
Эффективная вязкость, мПа×с
9,2±0,20 12,5±0,30 14,8±0,20 15,63±0,50 16,30±0,30 15,50±0,20
Количественное содержание, %*
99,8±0,10 98,3±0,20 97,9±0,30 98,0±0,15 98,4±0,17 97,9±0,19
Размер частиц, мкм 42,23±3,25 44,13±3,01 40,11±4,25 42,48±3,15 36,48±3,22 54,02±3,12
1 5,0±0,20
2 4,5±0,10
3 3,8±0,10
4 3,2±0,20
5 4,3±0,20
6 2,1±0,10
Примечание: * указано усредненное значение количественного содержания аминокапроновой кислоты и железа (III) хлорида 6-водного, %.
Параметры yi можно связать с частной функцией желательности, описываемой уравнением: = [− (− ′ )], где yi′ – некоторая безразмерная величина, связанная с параметром оптимизации yi линейным законом: ′ = 0 + 1 1
Для определения коэффициентов b0 , b1 использован следующий прием: худшему значению параметра оптимизации присваивали значение желательности (di), равное 0,37, а лучшему – значение желательности, равное 0,98. Для параметра оптимизации y1 имеем:
0,37 = exp [−exp(− ,)], отсюда , = 0
0,98 = exp [−exp(− ,)], отсюда , = 3,922
Согласно линейному закону для параметра оптимизации y1 имеем систему уравнений для определения коэффициентов b0, b1 где 2,1 – худшее значение параметра оптимизации y1, зафиксированное для образца 6; 5,0 – лучшее значение показателя, зафиксированное у образца 1:

0 + 1 ∗ 2,1 = 0
0 + 1 ∗ 5,0 = 3,922 2,1 1 − 5,0 1 = −3,922;
Аналогично найдены значения коэффициентов для остальных параметров оптимизации (таблица 2). Ранжирование образцов в порядке убывания значения обобщенной функции желательности представлено на рисунке 3.
Далее производим расчёт функции желательности Харрингтона (D) по формуле:
D=√d1∗d2 ∗⋯∗dq
Значения функции желательности каждого параметра оптимизации образцов представлены в таблице 3.
{
−2,9 1 = −3,922; 1 = 1,35
0 + 1,35∗2,1=0;b0 =-2,84
Таблица 2 – Данные для расчета коэффициентов параметров оптимизации
Параметр оптимизации
yi d1 y, i
2,10 0,37 0 5,00 0,98 3,92 0,49 0,37 0 0,27 0,98 3,92 16,30 0,37 0 9,20 0,98 3,92 97,90 0,37 0 99,80 0,98 3,92 54,02 0,37 0 40,11 0,98 3,92
b1 b0 1,35 -2,84
-18,59 9,02 -0,55 9,00 2,06 -202,09
-0,28 15,23
y1 y2 y3 y4 y5
Таблица 3 -Значение обобщенной функции желательности (D) для образцов
Составd1d2d3d4d5 D
1 2 3 4 5 6
0,98 0,98 0,98 0,98 0,63 0,8971 0,87 0,63 0,85 0,87 0,63 0,7611 0,63 0,63 0,76 0,37 0,98 0,6424 0,63 0,63 0,65 0,87 0,63 0,6762 0,83 0,37 0,37 0,87 0,87 0,6122 0,37 0,63 0,65 0,37 0,37 0,4607
Проанализировав полученные значения обобщенной функции желательности Харрингтона, было выявлено, что наилучшим составом следует признать образец No1 следующего состава (железа (III) хлорид 6-водный – 2,0; аминокапроновая кислота – 5,0; ПЭГ 400 – 74,4; ПЭГ 1000 – 18,6; наночастицы Fe@C или Fe3O4 – 0,01).
В результате проведенных методических подходов обоснованы и выбраны для дальнейшего изучения следующие составы (таблица 4).
Разработка технологии получения местных гемостатических форм.
Технологическая схема производства раствора для наружного применения.
Разработку технологической схемы раствора (рисунок 7.1) для наружного применения проводили, принимая во внимание, что средство представляет собой водный раствор твердого вещества. Технологический процесс получения раствора состоит из таких стадий как санитарная подготовка производства, подготовка сырья, непосредственно приготовление раствора путем растворения субстанций в необходимом объеме растворителя, стерилизация, контроль качества готовой лекарственной формы (качественный, количественный анализ, объем содержимого упаковки). Полученный раствор для наружного применения
Рисунок 3 – Шкала ранжирования образцов мази в порядке убывания значения обобщенной функции желательности Харрингтона

Действующее вещество Аминокапроновая кислота
Железо (III) хлорид 6-водный ПЭГ-400
ПЭГ-1000 Наночастицы Fe@C Наночастицы Fe3O4 Натрия хлорид
Вода очищенная Итого:
Раствор, г 2,0 4,0
–
–
–
–
0,1 93,9 100,0
Мазь No 1, г 5,0
2,0 74,4 18,6 0,01
–
–
– 100,0
Мазь No 2, г 5,0
2,0 74,4 18,6
–
0,01
–
– 100,0
расфасовывают во флаконы из оранжевого стекла с винтовой горловиной (ГОСТ 19808-86) по 100 мл, затем пачки картонные.
Технологическая схема производства мягких лекарственных форм. Процесс получения состоит из нескольких стадий (рисунок 7.2). На первом этапе добавляют наночастицы магнетита к раствору ПЭГ-400. Производится диспергирование полученной смеси при помощи УЗ-генератора. На втором этапе производят растворение кислоты аминокапроновой и железа (III) хлорида 6-водного в воде очищенной путем перемешивания. Третьим этапом служит приготовление мазевой основы: в емкость загружают необходимое количество ПЭГ-1000, которое предварительно плавили в течение 10 мин, при температуре 65±5oС. На четвертом этапе проводят смешивание смеси ПЭГ-400 и наночастиц магнетита со смесью действующих веществ, добавляют полученную композицию к расплавленному компоненту (ПЭГ-1000). Производят перемешивание компонентов до однородной консистенции. На пятом этапе полученную композицию обрабатывают ультразвуком, осуществляя процесс гомогенизации. Полученный продукт расфасовывают в алюминиевые тубы по 25 г по ТУ 64-7-678-90, покрытые внутри лаком на основе клея БФ-2 или лаком ЭП- 5186 или в полиэтиленовые банки по 50 г.
Таблица 4 – Предложенные составы местных гемостатических форм
Глава 4. Фармацевтический анализ разрабатываемых лекарственных форм, в том числе содержащих наночастицы
Были изучены следующие показатели: описание, растворимость (ОФС.1.2.1.0005.15), прозрачность (ОФС.1.2.1.0007.15), цветность (ОФС.1.2.1.0006.15), рН (ОФС.1.2.1.0004.15), подлинность, содержание действующих веществ, реологические характеристики (ОФС 1.2.1.0015.15), динамика высвобождения действующих веществ, микробиологическая чистота (ОФС 1.2.4.0002.15), определены сроки годности (ОФС1.1.0009.18) и условия хранения.
Оценку подлинности проводили с помощью качественных реакций, рекомендуемых ГФ XIV для анализа веществ, входящих в композицию (аминокапроновая кислота, железо (III) хлорид 6-водный, натрия хлорид). Количественное определение действующих веществ в полученных лекарственных форм проводили несколькими методами: фотометрическими, спектрофотометрическими, методом Фарадея. Методика анализа проходила в несколько этапов:
Определение аминокапроновой кислоты. Для определения концентраций кислоты аминокапроновой применена методика, основанная на образовании красителя при взаимодействии с нингидрином. В качестве метода выбрана прямая спектрофотометрия при длине волны 568 нм. (рисунок 4.1.). Содержание аминокапроновой кислоты C6H13NO2(X) в 1 мл гемостатического препарата вычисляли по формуле:
= А лп∗ ∗ ст∗3 = лп∗а ст , где
А ст∗а лп∗3∗250∗100 А ст∗а лп
А лп – оптическая плотность гемостатического средства; А ст – оптическая плотность раствора стандартного образца аминокапроновой кислоты; а лп – навеска гемостатического средства, мл; а ст – навеска стандартного образца, г; V – объем мерной колбы для приготовления разведения препарата, мл.
Определение железа (III) хлорида 6-водного. Для определения концентраций железа (III) хлорида 6-водного применена методика, основанная на образовании красителя при взаимодействии с сульфосалициловой кислотой. В качестве метода выбрана фотометрия при длине волны при 510 нм. (рисунок 4.2.). По градировочному графику рассчитывают концентрацию ионов железа – (при использовании уравнения кривой y = 0,1461x – 0,0507).
Далее производят расчет количественного содержания иона железа III по формуле:
=
2 1=
,где:
( 3+)∗ ∗
( 3+)∗250∗250
1000∗10∗10
1000∗
C (Fe3+)– концентрация ионов железа III, вычисленная с использованием градуировочного графика, мгмл; V1 – объем мерной колбы, мл; V2 – объем мерной колбы, мл; Vn – объем раствора, взятый из мерной колбы для анализа, мл.
Рисунок 4.1 – Схема протекания нингидриновой пробы
Рисунок 4.2 – Реакция железа с сульфосалициловой кислотой
Методики валидированы по показателям: специфичность, аналитическая область,
линейность, правильность и промежуточная (внутрилабораторная) прецизионность (таблица 5).
Таблица 5 – Валидационные характеристики методик определения
Характеристи ка
Линейность
Прецизионнос ть
Правильность
Специфичнос ть Аналитическа я область
Результат для Результат для железа (III) Статистические аминокапроновой кислоты хлорида 6-водного
характеристики Раство Мазь Мазь Раство Мазь Мазь р No1 No2 р No1 No2
Уравнение прямой
y= 0,0422x + 0,0007
y= 0,0582x + 0,0184
y= 0,0243x + 0,0062
y= 0,0109 x+ 0,0402
y= 0,0582x + 0,0184
y= 0,0853x + 0,0642
Наклон (а) Отрезок на оси ординат (b) Коэффициент корреляции (R2) Наименьшее значение, %
0,0422 0,0582 0,0243 0,0109 0,0007 0,0184 0,0062 0,0402
0,9991 0,9953 0,9901 0,997
0.0582 0853 0,0184 0,0642
0,9953 0,9975
99,3845 99,1859 99,1391 86,26 99,1859 99,5321
Наибольшеезначение, 100,451 100,533 100,421 98,260 100,533 100,313 % 701002
Среднее значение, %
Стандартное отклонение,% Показатель правильности, % Специфичнанеспецифи чна
99,9181 0,1067 0,9805
0,03- 0,05
99,9913 0,9805 0,9953
99,7801 92,260 0
0,9562 0,9722 0,9842 0,9952 Специфична
99,9913 0,9805 0,9962
99,9227 0.9623 0,9874
0,04-0,06 0,02- 0,04-0,1 0,05
Примечание: мазь No1 – НЧ 0,1% Fe3O4; мазь No2 – НЧ 0,1% Fe@C.
Определение концентрации наночастиц. В мягкие формы были введены наночастицы
железа. В связи с этим, встает вопрос их количественного определения в составе. Для изучения магнитных свойств наночастиц был использован метод Фарадея. Суть данного метода заключается в измерении механической силы, действующей на образец с магнитным моментом, помещенным в неоднородное магнитное поле (таблица 6).
Таблица 6- Концентрация наночастиц железа по методу Фарадея
Тип наночастиц
Концентрация
После приготовления, мг
1,02±0,02 0,113±0,02 0,010±0,001 1,031±0,02 0,115±0,002 0,012±0,0008
После 5 месяцев, мг
0,29 ± 1,08*10-2
0,02 ± 0,18*10-2 0,002 ± 0,07*10-2 0,335 ± 0,67*10-2 0,0295 ± 0,06*10-2 0,006 ± 0,06*10-2
1,00% Fe@C 0,10% 0,01% 1,00% Fe3O4 0,10% 0,01%
Для проведения магнитных измерений использовали весы Фарадея с максимальной напряженностью магнитного поля 0,9 Т и вибрационный магнитометр модели «7404 VSM» фирмы «Lake Shore Cryotronics, Inc.» (США) в интервале температур 8-420 К и магнитных полях напряжённостью до 1,3 Т. Измерения кривых магнитного гистерезиса в обоих случаях проводили при температуре 300 К. Из данных таблицы 6 видно, что содержание наночастиц в образцах снижается с течением времени, вследствие разрушения нанокомпонентов. Наночастицы за счет внутримолекулярных связей с полиэтиленгликолем встраиваются в комплекс полимерной матрицы, оставшиеся, свободные наночастицы являются градиентом и способствуют проникновению действующих веществ в составе мази.
Изучение реологических свойств разработанных мягких лекарственных форм с наночастицами. Для проведения реологических исследований были отобраны образцы разработанного гемостатического средства с двумя видами наночастиц (Fe3O4 или Fe@C), следующего состава: образец 1 и 4 (концентрация НЧ 0,01%), образец 2 и 5 (0,10%), образец 3 и 6 (1,00%) и контрольный образец.
Реологические исследования экспериментальных образцов проводили при комнатной температуре с помощью ротационного вискозиметра Вискотестер Haake VT550.
По рассчитанным значениям эффективной вязкости для каждого образца мази строили графики зависимости средних значений касательного напряжения сдвига и эффективной вязкости от градиента приложенной скорости, по которым судили о типе течения системы (рисунок 5.1).
образец 1 и 4 (НЧ 0,01%) образец 2 и 5 (НЧ 0,1%) образец 3 и 6 (НЧ 1,0%) базовая кривая (контроль)
скорость сдвига, с-1
Рисунок 5.1 – Кривые вязкости образцов гемостатической мази (общий вид)
Рисунок 5.2. – Реограмма течения образца гемостатической мази No1 и 4 (общий вид)
Проведенные исследования зависимости величины эффективной вязкости от скорости сдвига образцов показали, что вязкость резко падает с возрастанием скорости сдвига, то есть наблюдается обратно пропорциональная зависимость значений эффективной вязкости от значений скорости сдвига во всем интервале скоростей (0-300 с-1). Данные типы кривых характерны для неньютоновских жидкостей смешанного типа с конденсационно- кристаллизационными связями, разбавленными коагуляционными связями гетерогенных частиц (наночастицы железа).
Полученные кривые образцов мази No1 и No4 (реограммы течения, рисунок 5.2.) имеют нелинейный характер и описываются восходящей и нисходящей кривыми, образуя так называемую «петлю гистерезиса». Восходящая кривая показывает разрушение и устойчивость системы к приложенным нагрузкам. Мазь сохраняет остаточную деформацию после разрушения структуры под влиянием ранее приложенного напряжения. Нисходящая кривая показывает восстановление структуры образца при уменьшении воздействия. На основании данного свойства можно предполагать хорошую намазываемость и способность выдавливаться из туб. Таким образом, проведенные исследования показали, что образец No1 и 4 (концентрация наночастиц 0,01 %) характеризуются наилучшими реологическими свойствами.
Построение кривой высвобождения действующих веществ из мягкой лекарственной формы. В целях изучения высвобождения действующих веществ (аминокапроновой кислоты и железа (III) хлорида 6-водного) из изучаемого состава использовался модифицированный метод равновесного диализа по Крувчинскому. В качестве
вязкость, Па*с
приемного раствора использовалась вода очищенная. Выбор среды высвобождения обусловлен способностью действующих веществ растворяться в данном растворителе. Система термостатировалась при температуре 37±1 °С, пробы объемом 5 мл отбирали через 10, 20, 30, 40, 50, 60, 90, 120, 150, 180, 240 мин., 12 ч. и 24 ч., восполняя объем приемного раствора. Измерения проводились в шести параллелях и проведена статистическая обработка результатов.
Для объективного контроля скорости высвобождения методики количественного определения были изменены к определению вещества в диализате, также проведена её валидация по показателям линейность, правильность и воспроизводимость. Для изучения высвобождения были построены соответствующие кинетические кривые (рисунок 6).
120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00
0 10 20
АК
40 50
60 90 120
150 180
240 12 ч. 24 ч.
Время, мин.
ЖХ АК (контроль)
ЖХ (контроль)
Рисунок 6 – Кинетический профиль высвобождения аминокапроновой кислоты и железа (III) хлорида 6-водного из мази. Примечание: АК – аминокапроновая кислота, ЖХ –
железо (III) хлорид 6-водный
Наилучшие результаты по высвобождению действующих веществ получены в образцах мазей с наночастицами железа, что статистически достоверно отличало от показателей высвобождения из контрольных образцов (р<0,05). Таким образом, на основании биофармацевтических исследований, установлено что разработанный состав гемостатической мази с наночастицами равномерно высвобождает действующие вещества в течение 24 часов, что подтверждает правильность выбора основы при разработке состава и технологии лекарственных форм. В целом, комплекс проведенных исследований показал соответствие предлагаемых гемостатических форм требованиям ГФ и подтвердили правильность выбора ингредиентов и их соотношение в составе гемостатического средства. Анализ разработанных гемостатических форм на соответствие требованиям ГФ XIV представлен в таблице 9. Глава 5. Микробиологическое и фармакологическое исследования разработанных нанокомпонентных лекарственных форм Изучение микробиологической чистоты разработанных лекарственных форм. В связи с требованиями нормативной документации изучена микробиологическая чистота разработанных лекарственных форм. При анализе микробиологической чистоты использовались методы, предлагаемые ОФС 1.2.4.0002.18 «Микробиологическая чистота» ГФ XIV. Испытание на определение микробиологической чистоты включает способы подготовки различных форм, отбор образцов для анализа, методы количественного определения жизнеспособных микроорганизмов, выявление и идентификацию отдельных Степень высвобождения, % видов бактерий, наличие которых недопустимо или ограничено в лекарственных средствах, а также питательные среды, растворы и реактивы, необходимые для проведения испытаний. В качестве объектов исследования выступало 7 образцов мягкой формы с разным содержанием наночастиц, а именно, 0,01, 0,1, 1%, образец жидкой лекарственной формы и контрольный образец. Испытание проводили в асептических условиях, образцы готовили в условиях лаборатории, используя стерильную лабораторную посуду и исходные ингредиенты. Полученные образцы переносили в алюминиевые тубы (флаконы из темного стекла) и герметично упаковывали. В результате было установлено отсутствие в разрабатываемых ЛФ грамположительных кокков Staphylococcus aureus и грамотрицательных бактерий Pseudomonas aeruginosa при хранении в течение 24 месяцев в условиях холодильной камеры. Оценка гемостатической активности и предполагаемый механизм действия разработанных лекарственных форм. Оценку гемостатической активности разработанных форм проводили методом электрокоагулографии донорской крови здоровых доноров- добровольцев (in vitro). В исследование включены 9 добровольцев в возрасте от 20 до 43 лет (30,3±4,8 года), из них 77,78% женщин, 22,22% мужчин, не имеющих в анамнезе патологии системы гемостаза. Исследования осуществляли с применением экспресс - коагулометра КуЛабс Электрометр Плюс ("qLabs® ElectroMeter Plus", Китай). Измерения проводили в трех параллелях с постановкой контрольного опыта. В качестве контроля выступала донорская кровь без добавления реагентов, раствор для инфузий аминокапроновой кислоты и мазь на основе полиэтиленгликолей без добавления действующих веществ. Полученные данные были обработаны статистически с вычислением средних величин и их средних ошибок. Состояние системы гемостаза оценивали унифицированными методами, позволяющими охарактеризовать основные фазы свертывающего процесса: активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), протромбиновое время (ПВ), международное нормализованное соотношение. Результаты выявления гемостатической активности разработанных ЛФ в виде раствора для наружного применения представлены в таблице 7; для мазей в таблице 8 соответственно. При проведении коагулопатических исследований по выявлению гемостатической активности разработанных гемостатических форм доказано, что все они обеспечивают сокращение времени свертывания крови. Максимально выраженный гемостатический эффект среди растворов проявил образец No2 (3,0 г железа (III) хлорида 6-водного; 4,0 г аминокапроновой кислоты и 0,1 г натрия хлорида). Наиболее высокий гемостатический эффект среди мазей проявили образцы с минимальной концентрацией нанокомпонента (0,01%), причем вид нанокомпонента на данный эффект не оказывает значимого влияния. Из этого можно сделать вывод, что увеличение концентрации наночастиц не оказывает статистически значимого влияния на гемостатические свойства препарата, максимально эффективной концентрацией с необходимым фармакологическим эффектом можно считать концентрацию наночастиц 0,01%. На основании исследования гемостатической активности разработанных лекарственных форм можно сделать заключение, что наиболее информативными показателями являются АЧТВ, протромбиновое время и МНО. Полученные результаты свидетельствуют о том, что разработанные гемостатические формы обладают выраженной гемостатической активностью и могут быть рекомендованы в качестве средств для остановки кровотечений. Таблица 7 - Показатели коагулограмм при изучении кровоостанавливающей активности раствора для наружного применения No образца 2 4 5 Референтное значение Состав образца ЖХАКНХВО, г 0,2 ,2 ,4100 0,3 ,4 ,1100 0,2 ,4 ,2100 - ,5 -100 Контроль Показатель коагулограммы АПТВ 18±1 15 ±2 21±1 38±4 35±4 25,4-38,4 МНО 1,04±0,4 0,95±0,3 1,01±0,4 1,15±0,6 1,14±0,4 0,90-1,20 ПВ 9,52±0,4 8,63±0,3 10,90±0,4 10,23±0,6 10,45±0,4 9,0-11,0 Примечание: ЖК – железо (III) хлорид 6-водный, АК – аминокапроновая кислота, НХ – натрия хлорид, ВО – вода очищенная, АПТВ – активированное парциальное тромбопластиновое временя, ПВ – протромбиновое время, МНО – международное нормализованное соотношение; достоверные различия (p<0.05) Таблица 8- Показатели коагулограмм при изучении кровоостанавливающей активности мягких лекарственных форм с наночастицами No образца 1 2 3 4 5 6 7 8 Вид и масса наночастиц в составе образца*, г Наночастицы Fe@C - 0,01 Наночастицы Fe@C - 0,10 Наночастицы Fe@C - 1,00 Наночастицы Fe3О4 - 0,01 Наночастицы Fe3О4 - 0,10 Наночастицы Fe3О4 - 1,00 ПЭГ-400-74,4; ПЭГ-1000-18,6 Контроль Референтное значение Показатель коагулограммы АПТВ МНО 22±2 0,95±0,3 35±1 1,05±0,6 39±1 1,10±0,6 20±2 0,98±0,3 26±1 1,09±0,6 31±1 1,12±0,6 34±3 1,18±0,6 35±4 1,14±0,4 25,4-38,4 0,90-1,20 ПВ 8,4±0,2 9,1±0,6 10,1±0,4 8,3±0,3 11,5±0,4 10,6±0,5 10,9±0,4 10,8±0,2 9,0-11,0 Примечание: состав мазей представлен - аминокапроновая кислота – 5,0 г, железо (III) хлорид 6- водный – 2.0 г, ПЭГ-400 – 74, 4 г, ПЭГ-1000 – 18,6 г. АПТВ – активированное парциальное тромбопластиновое время, ПВ – протромбиновое время, МНО – международное нормализованное соотношение (p<0,05) ВЫВОДЫ 1. Изучен отечественный ассортимент фармацевтического рынка гемостатических средств, представленный группой «B02 Гемостатические препараты». Показано, что он состоит из двух подгрупп: «B02A - Ингибиторы фибринолиза» и «B02B - Витамин К и другие гемостатики». Наибольшую долю составляют отечественные фирмы-производители (69,1%), доля импортных – 30,9%. Среди форм выпуска лидирует лиофилизат для приготовления раствора для внутривенного введения (24,29%). По результатам проведенных экспериментальных исследований выявлено, что гемостатические препараты в виде мазей для наружного применения, содержащих в своем составе наночастицы, отсутствуют на рынке. 2. На основании технологических данных, данных о стабильности, физико-химических свойствах субстанций, подобран и обоснован оптимальный состав новых лекарственных форм для остановки кровотечений, а именно, раствора для наружного применения (аминокапроновая кислота, железа (III) хлорид 6-водный, натрия хлорид) и мягкой лекарственной формы с нанокомпонентами (аминокапроновая кислота, железа (III) хлорид 6- водный, ПЭГ-400, ПЭГ-1000 и наночастиц железа двух видов Fe3О4 или Fe@C). Для подбора состава раствора изучено 243 модельных образца, после чего была построена фазовая диаграмма состояния. По результатам проведения исследования выявлено, что наиболее стабильными при хранении показали себя системы с пропорциональными концентрациями аминокапроновой кислоты (0,1 – 0,3 гмл), железа (III) хлорида 6-водного (0,3 гмл) и натрия хлорида (0,2 - 0,4 гмл). С химической точки зрения это обусловлено образованием комплексной соли железа (III) и аминокапроновой кислоты. Для подбора состава в мягкой лекарственной форме было изучено 7 модельных образцов. Наиболее оптимальный состав у образца следующего состава: аминокапроновая кислота (5,0 г), железа (III) хлорид 6-водный (2,0 г), ПЭГ-400 и ПЭГ-1000 (соотношение 4:1) и наночастиц Fe@C или Fe3О4 (0,01 г). Данный образец характеризуется наибольшим значением функции желательности Харрингтона (D), равным 0,9. 3. Для предложенных составов разработана технология получения (Пат. RU 2711616 C1), спроектированы технологические схемы, опытно-промышленные регламенты на производство (ОПР на производство гемостатического раствора для наружного применения, ОПР на производство гемостатической мягкой ЛФ, включающей нанокомпонент). Особенностью разработанной технологии является наличие стадии синтеза наночастиц железа двух видов Fe3О4 и Fe@C левитационно-струйным методом. Также разработана упаковка для мягкой ЛФ (Пат. RU 2715386 C1). 4. Проведен фармацевтический анализ разработанных гемостатических лекарственных форм. Рассмотрены такие критерии как описание, растворимость, pH-среды, подлинность, определение структурно-механических свойств (коэффициенты динамического разжижения Кд1, Кд2, Кд3 составили 27,4 %; 21,54% и 11,7%). Апробирована методика количественного определения аминокапроновой кислоты в гемостатическом растворе (0,0422±0,0007 г) и в мягкой лекарственной форме (с Fe@C 0,0534±0,0012 г; с Fe3О4 0,0512±0,0015 г), основанная на образовании комплекса при взаимодействии с нингидрином. Для определения железа (III) хлорида 6-водного в гемостатическом растворе (0,0297±0,0004 г) и в мягкой лекарственной форме (Fe@C 0,0212±0,0009; Fe3О4 0,0242±0,00124 г) выбран метод фотометрии с сульфосалициловой кислотой. Данные методики валидированы по показателям: специфичность, аналитическая область, линейность, правильность и промежуточная (внутрилабораторная) прецизионность. Для наночастиц железа, включенных в состав мягких форм, применен метод Фарадея и построены кривые намагничивания образцов. Исследованы физико-химические, реологические свойства, динамика высвобождения действующих лекарственных веществ, определены сроки годности и условия хранения. По результатам разработанных методик по стандартизации предложена спецификация на лекарственные формы. 5. В ходе фармакологических исследований установлено, что разработанные лекарственные формы достоверно обеспечивают сокращение времени свертывания крови (в сравнении с контролем при Р=0,95). Наиболее выраженный гемостатический эффект среди растворов проявил образец с наименьшим мольным соотношением компонентов (3,0 г железа (III) хлорида 6-водного; 4,0 г аминокапроновой кислоты и 0,1 г натрия хлорида). Среди мазей лучшими характеристиками обладали образцы с минимальной концентрацией нанокомпонента (0,01%), причем вид нанокомпонента на данный эффект не оказывает статистически значимого вклада. На основании экспериментальных данных по изучению показателя «Микробиологическая чистота», можно сделать вывод об отсутствии в разработанных лекарственных формах штаммов Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus в течение всего срока годности.