Система глутатиона в костной ткани при действии элементов медно-цинковой колчеданной руды
Оглавление
Введение
Глава 1 Обзор литературы
1.1 Влияние тяжелых металлов на метаболизм костной ткани
1.2 Обмен глутатиона
1.3 Биологические функции глутатиона
Глава 2 Материалы и методы исследования
2.1 Объекты и дизайн исследования
2.2 Методыисследования……………………………………………………………………………..37
2.2.1 Изучение обмена костной ткани
2.2.2 Изучение содержания продуктов перекисного окисления липидов
2.2.3 Исследование системы глутатиона, других показателей ферментативного и неферментного звеньев антиоксидантной защиты
2.2.4 Гистологические методы исследования
2.3 Статистическая обработка результатов
Глава 3 Результаты собственных исследований
3.1 Влияние элементов медно-цинковой колчеданной руды на некоторые показатели обмена костной ткани в плазме крови экспериментальных животных…50
3.2 Интенсивность перекисного окисления липидов в костной ткани при действии элементов, содержащихся в медно-цинковой колчеданной руде
3.3 Система глутатиона и другие компоненты антиоксидантной защиты в костной ткани экспериментальных животных при действии элементов медно- цинковой колчеданной руды
3.4 Глутатионовая система печени при интоксикации элементами медно- цинковой колчеданной руды
3
3.5 Влияние элементов медно-цинковой колчеданной руды на гистологическую структуру костной ткани крыс
3.6 Эффективность действия антиоксидантного препарата на систему глутатиона в костной ткани и печени при длительной интоксикации элементами медно-цинковой колчеданной руды
Глава 4 Обсуждение результатов исследования
Выводы
Список сокращений и условных обозначений
Список литературы
Материалы и методы исследования
Исследования проведены на 240 белых беспородных крысах-самцах массой 180 – 240 г.
При проведении экспериментов были соблюдены этические нормы и рекомендации по
гуманному отношению к лабораторным животным.
Эксперименты проведены в два этапа (таблица 1). Интоксикацию животных
элементами, содержащимися в руде, осуществляли по ранее апробированной на кафедрах
биологической химии и патологической физиологии БГМУ модели дозированного введения
измельченного порошка медно-цинковой колчеданной руды в растворе крахмала (Нургалеев
Н.В. и др., 2013; Фаршатова Е.Р. и др., 2015). Суспензия порошка руды, добываемойна
Учалинском месторождении ОАО “УГОК”, вводилась в обоих этапах исследований ежедневно
внутрижелудочно с помощью специального зонда в 2% растворе крахмала из расчета 60
мг/100 г массы. Животные контрольной группы получали внутрижелудочно ежедневно 2%
раствор крахмала в адекватном объеме. Пересчёт дозы руды корректировали после очередного
взвешивания животных (через каждые 20-22 суток). Вводимую дозу рассчитывали по
минимально предельно допустимой концентрации (ПДК) меди и кадмия (Афанасьева Е.Ю. и
др., 2008; Сульдина Т.И., 2016).
Таблица 1 – Дизайн исследования
Этапы исследованияГруппа животныхИзучаемые показатели
I.Действие1.Контрольная1. В плазме крови: ГВ, ССГ, свободный
элементов,2.Введениесуспензииоксипролин, Ca, P, Mg, активность костной
содержащихсяв порошка руды в течениещелочной фосфатазы (КЩФ), С-концевые
медно-цинковой3-х месяцевтелопептиды коллагена типа 1 (СТх).
колчеданной руде на2. В эпифизах бедренных костей: ТБК –
оксидантный статус иактивные продукты, кетодиены (КД),
систему глутатиона вдиеновые конъюгаты и сопряжённые
костной ткани.триены (ДК и СТ), ГВ, ССГ, α- токоферол,
аскорбиновая кислота, активность ГПО,
ГТ, ГР, ГГТ, Г-6-фДГ, СОД, каталазы и
ОАА.
3. В печени: ГВ, ССГ, α-токоферол,
аскорбиновая кислота, активность ГПО,
ГТ, ГР, ГГТ, Г-6-фДГ, ОАА, СОД и
каталазы.
4.Гистологическаяиэлектронно-
микроскопическаяструктура,
морфометрические показатели бедренной
кости.
II.Эффективность1. Контрольная1. В плазме крови: свободный оксипролин,
влияния2. Введение суспензии Ca, P, Mg, β-Cross Laps, активность КЩФ.
антиоксидантногопорошка руды2. В эпифизах бедренных костей: ТБК-
витаминного3. Введение комплекса активные продукты, ДК, КД и СТ, ГВ,
препарата на системувитаминов сССГ, α-токоферол, аскорбат, активность
глутатиона в костноймикроэлементом на фоне ГПО, ГТ, ГР, ГГТ, Г-6-фДГ, СОД и
тканиприинтоксикациикаталазы.
интоксикацииэлементами медно-3. В печени: ССГ, α-токоферол, аскорбат,
компонентами медно-цинковой колчеданнойактивность ГПО, ГТ, ГР, ГГТ, Г-6-фДГ,
цинковойрудыСОД, каталазы и ОАА.
колчеданной руды.
На втором этапе исследовании крысам основной группы в течение третьего месяца
эксперимента на фоне интоксикации элементами руды ежедневно внутрижелудочно вводили
витаминный препарат (комплекс витаминов с микроэлементом), в виде суспензии в 2%
растворе крахмала в дозе 50мг/кг массы. Одна капсула витаминного препарата содержит 40 мг
α-токоферола, 100 мг аскорбиновой кислоты, 10 мг β-каротина и 50мкг селена в комплексе с
порошкообразнымисухимидрожжами.Суточнуюдозукомплексавитаминовс
микроэлементом рассчитывали для крыс с учётом массы и площади поверхности тела с
использованием коэффициента пересчета доз согласно «Руководства по проведению
доклинических исследований лекарственных средств» (2012).
Животных под легким эфирным наркозом выводили из эксперимента на первом этапе
через 1, 2 и 3 месяца, на втором – через 3 месяца от начала затравки суспензией порошка руды.
Содержание в плазме крови животных общего Ca, P, Mg изучали с использованием
коммерческих наборов реагентов (ЗАО «Вектор-Бест»), С-концевые телопептиды коллагена
типа I (набор реагентов «Serum Cross LapsTM ELISA» фирмы «БиоХимМак») и активность
КЩФ (набор реагентов «Metra BAF EIA» фирмы «Quidel Corporation”) определяли методом
иммуноферментногоанализа,согласноприложенныминструкциямпроизводителяс
использованием комплекса приборов для определения показателей: термостатируемого
шейкера«BiosanPLT-417»,промывателяпланшетов«Аквамарин»ипланшетного
спектрофотометра «Униплан». Концентрацию свободного оксипролина (СОП) оценивали по
(Шараев П.Н. и др., 1990), диеновых конъюгатов, кетодиенов и сопряженных триенов в гептан-
изопропаноловых экстрактах по (Волчегорский И.А. и др., 2000). Экспериментальное
моделирование и лабораторная оценка адаптивных реакции организма. ТБК-активные
продукты с использованием наборов реагентов «ТБК- Агат» (ООО «Агат- МЕД»).
Содержание ГВ определяли по методике, описанной А.Н. Гавриловой в модификации с
использованием 5,5᾿-дитио-бис (-2-нитробензойной) кислоты (ДТНБ) (Карпищенко, А.И. и др.,
1997), ССГ – по G. Bellomo et al., (1990), α-токоферола – по I. Dessai (1984), аскорбиновой
кислоты – по S. Omaye et al., (1979). Активность ГПО изучали с помощью набора реагентов
«Glutatione Peroxidase» (Randox Laboratories Ltd.), ГТ – по W. Habig et al., (1973), ГР – по E.
Beutler (Арутюнян А.В. и др., 2000), ГГТ – по M. Orlowski, A. Meister (1965), Г-6-фДГ – по G.
Glok, D. Leon в модификации (Асатиани В.С., 1969), СОД – с использованием набора реагентов
“RANSOD” (Randox Laboratories Ltd.), каталазы – по Королюк М.А. и соавт. (1988), ОАА – по
Клебанову Г.И. и соавт. (1988), содержание белка в пробах по Лоури (Peterson G.L., 1997).
При гистологическом исследовании кусочки бедреннойкости диафиза и эпифиза
фиксировали в 10% растворе забуференного формалина, декальцинировали в 10% растворе
муравьинойкислоты,осуществлялистандартнуюпроводкуизаливкувпарафин.
Гистологические срезы готовили на микротоме LEICA 4 RM 2145, окрашивали гематоксилином
и эозином, пикрофуксином по Ван-Гизону. Для электронно-микроскопического исследования
кусочки декальцинированной кости фиксировали в 2% растворе глутарового альдегида и в 1%
растворе четырехокиси осмия, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и проводили
заливку в эпон-812 по общепринятой методике (Уикли Б., 1975). Срезы получали на
ультрамикротоме LKB-III, контрастировали раствором цитрата свинца по E. Reynolds (1963),
фотографировали в электронном микроскопе Jet-100В при увеличении 2500-10000.
Результаты исследования обработаны с использованием пакета программ Statistica 6,0
for Windows, представлены в виде выборочного среднего (x̅) и стандартной ошибки средней
(sx), а при ассиметричном распределении признака – медианы (Ме) и межквартильного размаха
[Q1-Q3]. Статистические различия между группами оценивали по t-критерию Стьюдента при
нормальномраспределениииU-критериюМанна-Уитнидлянезависимыхвыборок.
Коэффициенты корреляции вычисляли ранговым методом по Спирмену. Различия считали
статистически значимыми при p≤0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Интоксикация элементами, содержащимися в медно-цинковой колчеданной руде, уже
через месяц после начала введения суспензии и порошка руды повышает содержание в плазме
крови маркеров резорбции костной ткани и костеобразования (таблица 2).
Таблица 2 – Содержание в плазме крови экспериментальных животных маркёров резорбции и
образования костной ткани при действии элементов, содержащихся в медно-цинковой
колчеданной руды, Ме [Q1-Q3]
Опытная группа
Контрольная
ПоказателиЧерез 1 месяц,Через 2 месяца,Через 3 месяца,
группа, n=10
n=10n=10n=10
Свободный
13,216,8*16,7*17,4*
оксипролин,
[12,4-15,1][14,5-17,8][14,5-17,9][15,6-18,2]
мкмоль/л
0,6670,934*1,189*1,244*
CTx, нг/л
[0,498-0,705][0,722-1,213][1,026-1,317][1,034-1,407]
5,816,96*5,955,52
КЩФ, Ед/л
[3,81-6,93][4,91-7,58][4,15-6,93][4,33-6,87]
Примечание: *р<0,05
Однако, если в последующие сроки наблюдения уровень маркёров остеорезорбции –
СОП и СТх повышаются, то содержание показателя костеобразования – КЩФ снижается,
характеризуя развитие дисбаланса ремоделирования – КЩФ снижается, характеризуя развитие
дисбаланса ремоделирования костной ткани с превалированием резорбции.
Характер изменений минерального обмена также указывали на нарушения метаболизма
костной ткани. У крыс опытной группы выявлялось снижение содержания в плазме крови Ca и
P, повышение – Mg, что приводило к уменьшению соотношения Ca/Mg с 2,96±0,144 до
2,06±0,128 (р<0,05), в течение 3-х месяцев введения руды.
В костной ткани животных при введении суспензии порошка руды наблюдается
активация процессов свободно-радикального окисления (таблица 3).
Таблица 3 – Содержание продуктов перекисного окисления липидов в эпифизах бедренных
костей крыс при действии компонентов медно-цинковой колчеданной руды, Ме [Q1-Q3]
Опытная группа
Контрольная
ПоказателиЧерез 1 месяц,Через 2 месяца,Через 3 месяца,
группа, n=10
n=10n=10n=10
0,760,98*1,09*1,13**
ДК гепт.фазы, у.е.
[0,7-0,84][0,88-1,07][0,91-1,16][1,03-1,25]
КД и СТ гепт.фазы,0,620,72*0,80*0,96**
у.е.[0,55-0,67][0,64-0,30][0,72-0,87][0,77-1,03]
0,961,52*1,56*1,61**
ДК изопр.фазы, у.е.
[0,92-0,99][1,38-1,59][1,33-1,62][1,48-1,73]
КД и СТ изопр.фазы,0,710,76*0,88*1,27**
у.е.[0,63-0,77][0,72-0,83][0,79-0,97][1,09-1,56]
1,722,42*2,44*3,93***
ТБК-АП, нмоль/г
[1,38-1,86][2,32-2,66][2,31-2,97][3,74-4,22]
Примечание: *р<0,05; **р<0,01; ***р<0,001
Уровень первичных (ДК) и вторичных (КД и СТ) продуктов перекисного окисления
липидов (ПОЛ) в гептановой и изопропаноловой фазах липидного экстракта эпифизов
бедренных костей статистически значимо повышался на 2-е и 3-е месяцы интоксикации
элементами руды цветных металлов. Концентрация ТБК-АП увеличивалась при этом более
двух раз.
Активация ПОЛ в костной ткани наблюдалась на фоне выраженных изменений
состояниясистемыглутатионаидругихвзаимосвязанныхснейкомпонентов
антиокислительной защиты костной ткани (таблица 4).
Содержание восстановленного глутатиона уже через месяц от начала интоксикации
элементами руды цветных металлов снизилось до 69,1% от уровня контроля, а к завершению
эксперимента – до 59,9%. Содержание ССГ белков уменьшалось более постепенно и менее
выражено (до 76,7% к концу третьего месяца затравки). При этом наблюдалось ингибирование
активности глутатионзависимых ферментов – ГПО, ГТ, ГГТ, а также снижение активности ГР и
ключевого фермента гексозомонофосфатного окисления глюкозы, генерирующего в цитоплазме
уровень восстановленного НАДФН, Г-6-фДГ.
Таблица 4 – Действие компонентов медно-цинковой колчеданной руды на систему глутатиона и
другие компоненты антиоксидантной системы в костной ткани крыс, Ме [Q1-Q3]
Опытная группа
Контрольная
ПоказателиЧерез 1Через 2Через 3
группа, n=10
месяц, n=10месяца, n=10месяца, n=10
2,621,81*2,02*1,57**
ГВ, мкмоль/мг белка
[1,99-3,24][1,51-2,20][1,59-2,10][1,30-1,82]
8,07,77,056,09*
ССГ, мкмоль/мг белка
[6,85-10,2][6,72-9,8][5,08-9,41][5,2-9,62]
2,521,44*1,75*1,57*
ГПО, нмоль/мин×мг белка
[1,89-3,16][1,16-1,58][1,52-2,02][1,32-1,77]
16,216,114,7*13,2*
ГТ, нмоль/мин×мг белка
[15,1-20,3][13,2-21,2][13,9-17,8][11,6-17,0]
4,183,563,693,43*
ГР, нмоль/мин×мг белка
[3,78-4,48][2,36-3,82][3,51-4,09][2,75-4,03]
Г-6-фДГ,нмоль3,63,2*3,0*3,1*
НАДФН/мин× мг белка[2,1-4,2][2,3-4,1][2,6-4,2][2,4-4,1]
13,610,3*10,1*8,8*
ГГТ, нмоль/мин×мг белка
[11,3-14,6][8,6-12,7][8,7-11,5][7,4-10,6]
Аскорбиновая кислота,2,152,212,041,58
мкг/мг белка[1,81-2,58][1,96-2,45][1,82-2,06][1,36-1,89]
12,411,611,510,2*
α- токоферол, нг/мг белка
[10,8-13,8][10,2-11,8][10,6-12,3][9,9-10,8]
11,511,39,1*8,3**
СОД, Ед/мг белка
[9,1-12,4][9,2-12,6][7,4-10,6][7,2-9,0]
Каталаза, мкмоль/мин×мг11,27,9*6,6**8,8*
белка[9,3-12,9][6,5-9,2][4,0-8,4][6,6-11,2]
21,420,418,915,3**
ОАА, % ингибирования
[17,5-24,1][18,3-25,8][17,2-20,8][12,9-17,7]
Примечание: *р<0,05; **р<0,01
Система глутатиона тесно связана с другими компонентами антиоксидантной защиты. В
клетках костной ткани, по всей вероятности, при действии тяжелых металлов и других
токсичных элементов имеется нарушение цепи глутатион – аскорбиновая кислота – α-
токоферол, которая транспортирует электроны в составе атомов водорода от восстановленных
пиридиновых нуклеотидов (НАДН, НАДФН) к свободным радикалам. Наблюдается снижение
активности СОД и каталазы, являющимися наряду с ГПО и ГТ основными антиоксидантными
ферментами. Металлы переменной валентности Fe, Cu, Mn, Cr, Ni, Cd, Pb, Hg инициируют СРО,
стимулируя образование активных форм кислорода. Снижение активностиосновных
антиоксидантных ферментов может быть связано не только их действием на тиоловые и другие
функциональные группы, но и за счёт оксидативного повреждения с истощением
физиологических резервов.
Печень является основным органом, поддерживающим уровень циркулирующего в
плазме крови глутатиона, и, таким образом, обеспечивающим остальные ткани трипептидом.
Определение содержания ГВ и ССГ в плазме крови животных при интоксикации элементами
медно-цинковой колчеданной руды обнаружило их постепенное снижение до 77,5% и 85,4%
соответственно к концу третьего месяца эксперимента. У опытной группы животных
наблюдалось статистически значимое падение ГВ и нарушение компонентов системы
глутатиона в печени (таблица 5).
Таблица 5 – Влияние элементов, содержащихся в медно-цинковой колчеданной руде на
показатели метаболизма глутатиона в печени, Me [Q1-Q3]
Группа животных
ПоказателиКонтрольная, Через 1 месяц, Через 2 месяца,Через 3 месяца,
n=12n=10n=10n=8
10,759,257,80*7,3 *
ГВ, мкмоль/мг белка
[7,79 – 12,18] [8,10 – 13,15][6,05 – 11,16][5,71 – 9,14]
16,515,614,111,8 *
ССГ, мкмоль/мг белка
[13,4 – 19,3][12,8 – 17,6][12,6 – 15,3][10,9 – 14,6]
ГПО, нмоль/мин×мг7,926,85 *5,55 *5,35 *
белка[6,64 – 9,74][6,15 – 8,40][4,41 – 5,93][4,33 – 5,75]
ГТ, мкмоль/мин×мг146,0136,5130,1109,3 *
белка[136,2 – 153,4] [126,4 – 147,2] [119,3 – 147,0][104,6 – 121,1]
ГР, нмоль/мин×мг110,594,890,3 *82,4 *
белка[92,6 – 121,3] [81,6 – 98,2][75,4 – 101,4][76,3 – 91,8]
Г-6-ф ДГ, мкмоль0,790,66 *0,54 *0,42 *
НАДФН/мин×мг белка [0,66 – 0,88][0,60 – 0,82][0,45 – 0,59][0,38 – 0,51]
3,663,11 *2,86*2,48 **
ГГТ, мкмоль/мг белка
[3,01 – 4,82][2,76 – 3,58][2,41 – 3,11][2,11 – 3,56]
Примечание: *р<0,05; **р<0,01
Изменения в системе глутатиона в костной ткани и печени крыс при действии
компонентов медно-цинковой колчеданной руды носят однонаправленный характер, имеют
общие закономерности. Нарушения синтеза и восстановления глутатиона в печени отражается
на уровне ГВ в плазме крови и его поступлении в костную и другие ткани.
Нарушения обмена глутатиона со снижением антиоксидантной защиты, усилением СРО
и дисбалансом ремоделирования костной ткани с превалированием катаболизма и резорбции
при длительной интоксикации элементами, содержащимися в медно-цинковой колчеданной
руде, приводит к постепенному нарастанию деструктивных процессов, дезорганизации
микроархитектоникииультраструктурыткани,наблюдаемыепригистологическом и
электронно-микроскопическом исследованиях (рисунок 1). На гистологических препаратах
бедренной кости наблюдались истончение ткани в области диафиза с образованием глубоких
узуров, прорастание рыхлой соединительной ткани в кость со стороны надкостницы. В костных
клетках при электронно-микроскопическом исследовании обнаруживались выраженные
признаки деструкции внутриклеточных органелл. Заметные изменения при этом наблюдались в
остеоцитах. Во многих лакунах выявлялись только фрагменты разрушенных остеоцитов.
Интенсивная резорбция костных балок обнаруживалось в губчатой кости эпифизов бедренных
костей. В узурах и резорбционных полостях хорошо просматривались многоядерные активные
остеокласты. Вместе с тем на некоторых участках кости крыс опытной группы определялись
зоны костеобразования с активными остеобластами.
А. Контрольная группа. К - костная ткань;Д. Контрольная группа: К – костная
КМ – костный мозг; Ж – жироваяткань; Я – ядро остеоцита; каналы
ткань; СТ – соединительная ткань; М-гранулярногоэндоплазматического
мышечная ткань; Гаверсовы каналы сретикулума (↑). Увел.*6000.
сосудами (1). Увел.*100.
Б.Опытная через1месяц:К- Е. Опытная группа через 1 месяц. К –
костная ткань; КМ – костный мозг; костная ткань; Я – ядро остеоцита; М –
резорбционные узуры (↑);отслоившиеся митохондрии; отросток остеоцита в
коллагеновые волокна (↑↑). Увел. *100.канальце (↑). Увел. *8000.
В. Опытная группа через 2 месяца. К – Ж. Опытная группа через 2 месяца. К –
костная ткань; КМ – костный мозг; костная ткань; Я – ядро сморщенного
резорбционные узуры (↑). Увел.*100.остеоцита; пустые канальцы и пустота в
лакуне (↑). Увел.*8000.
Г. Опытная группа через 3 месяца. К – З. Опытная группа через 3 месяца. К –
костная ткань; КМ – костный мозг; костная ткань; фрагменты разрушенного
резорбционные узуры (↑).Увелич.*100.остеоцита в лакуне (↑). Увелич. * 8000.
Рисунок 1 - Гистологическая и ультраструктура диафиза бедренной кости крыс
контрольной и опытной групп при интоксикации компонентами медно-цинковой колчеданной
руды. Окраска по Ван-Гизону (а), гематоксилином и эозином (б, в, г), электронные
микрофотографии (д, е, ж, з)
Патогенетическая роль изменений системы глутатиона в нарушениях метаболизма
костной ткани, приводящих к снижению костной прочности и развитию остеопенического
синдрома при длительном поступлении в организм элементов, содержащихся в медно-цинковой
колчеданной руде схематически представлена на рисунке 2.
В действии тяжелых металлов и токсичных элементов руды на костную ткань на фоне
связывании сульфгидрильных групп биомолекул, приводящих к нарушениям конформации и
функционирования белковых структур, и изменений минеральной фазы костной ткани важную
патогенетическую роль играют активация свободно-радикальных процессов и развивающийся
дефицит антиоксидантной защиты.
В этой связи представлял интерес изучения влияния на метаболизм костной ткани при
действии компонентов руды антиоксидантного препарата. Для этих целей был использован
антиоксидантный витаминный препарат с микроэлементом.
Рисунок 2 – Нарушения системы глутатиона в костной ткани в патогенетических механизмах
развития остеопении и остеопороза при действии элементов, содержащихся в медно-цинковой
колчеданной руде. АФК – активные формы кислороды, GSH – восстановленный глутатион, GS-SG
– окисленный глутатион, СРО – свободно-радикальное окисление, СОД – супероксиддисмутаза, ГПО
– глутатионпероксидаза
Проведённые исследования показали, что ежедневное введение комплекса витаминов с
микроэлементом из расчёта 50мг/кг массы крысы в течение третьего месяца интоксикации
суспензией порошка полиметаллической руды вызывает улучшение глутатионовой системы в
костной ткани, статистически значимо по сравнению с животными, не лечеными витаминным
препаратам, повышает уровень GSH, свободных сульфгидрильных групп белков, активность
глутатионпероксидазы и γ-глутамилтранспептидазы, а активность глутатионтрансферазы,
глутатионредуктазы и глюкозо-6-фосфатдегидро-геназы восстанавливает до уровня животных
контрольной группы (таблица 6).
Одновременное использование витаминного антиоксидантного препарата на фоне
воздействия элементов медно-цинковой колчеданной руды способствовало увеличению в
костнойтканисодержанияаскорбиновойкислоты,α-токоферола,активности
супероксиддисмутазы и каталазы, достигающие уровня контрольных значений (таблица 7). В
костной тканиу животных основной группы,получавших комплекс витаминов с
микроэлементом снижалось также содержание первичных и вторичных продуктов ПОЛ,
отражая ингибирование интенсивности свободнорадикальных процессов.
Таблица 6 – Показатели системы глутатиона в костной ткани крыс при интоксикации
компонентами медно-цинковой колчеданной руды и введении антиоксидантного витаминного
препарата, Me [Q1-Q3]
Группы животных
ПоказателиКонтрольная,Сравнения,Основная,
n=12n=10n=12
Глутатион2,10 [1,98-3,15]1,51 [1,19-2,03]1,90 [1,77-2,31]в
восстановленный
мкмоль/мг белка
Свободные SH- группы7,8 [6,2-10,5]6,08 [5,25-7,96]а7,24 [6,17-8,03]в
белков, мкмоль/мг белка
ГПО, нмоль/мин×мг2,10 [1,54-2,56]1,49 [1,84-1,70]а1,80 [1,44-2,22]а,в
белка
ГТ, нмоль/мин×мг белка15,8 [12,9-19,0]13,5 [9,8-18,4]а14,9 [14,4-17,8]
ГР, нмоль/мин×мг белка4,52 [3,69-4,68]3,75 [2,82-4,03]а3,89 [3,09-4,81]а
Г-6-фДГ, нмоль3,7 [3,6-3,9]3,03 [2,9-3,62]а3,16 [2,9-2,68]а
НАДФН/мин×мг белка
ГГТ, нмоль/мин×мг белка13,4 [11,9-14,2]8,8 [8,0-9,6]а11,9 [10,3-14,0]а,в
Примечание: а – различия с группой контроля, в – различия между основной группой и группой
сравнения.
Таблица 7 – Эффективность применения витаминного препарата на уровень антиоксидантных
витаминов и активность супероксиддисмутазы и каталазы в костной ткани при интоксикации
компонентами медно-цинковой колчеданной руды, Ме [Q1-Q3]
Группы животных
ПоказателиКонтрольная,Сравнения,Основная,PUPU1PU2
n=12n=10n=12
Аскорбат, мкг/мг2,381,732,0
0,265 0,825 0,328
белка[1,63-2,96][1,46-2,09][1,88-2,18]
α-токоферол, мкг/мг11,319,210,32
0,046 0,284 0,019
белка[9,95-12,3][8,11-10,72][9,44-11,1]
12,18,510,6
СОД, Ед/мг белка0,012 0,054 0,036
[9,2-13,0][7,2-9,2][8,9-12,6]
Каталаза,11,58,210,3
0,038 0,244 0,047
мкмоль/мин×мг белка[9,5-13,6][6,6-11,3][8,1-12,9]
Примечание: PU - различия с контрольной группой группы сравнения, PU1 - различия между
контрольной и основной группами, PU2 - различия между группой сравнения и основной
группой
Важно, что на фоне изменений состояния оксидантно-антиоксидантной системы в
костной ткани при введении витаминного препарата наблюдались улучшения метаболизма со
снижением процессов катаболизма коллагена и выравниванием дисбаланса ремоделирования со
снижением интенсивности процессов резорбции. Эти метаболические сдвиги проявлялись
снижением содержания в плазме крови свободного оксипролина, С-концевых телопептидов
коллагена типа I и улучшением показателей минерального обмена (таблица 8).
Таблица 8 – Маркеры ремоделирования костной ткани в плазме крови при введении
антиоксидантного витаминного препарата на фоне интоксикации элементами руды цветных
металлов, Ме [Q1-Q3]
Группы животных
ПоказателиКонтрольная,Сравнения,Основная,PUPU1PU2
n=10n=10n=10
Свободный
14,219,616,3
оксипролин, мк0,007 0,042 0,031
[13,0-15,9][17,4-21,0][14,8-17,6]
моль/л
6,176,236,41
КЩФ, Ед/л0,722 0,904 0,678
[4,33-6,97][4,92-6,78][4,27-6,88]
0,6181,3170,868
СТх, нг/л0,018 0,045 0,034
[0,528-0,664][1,208-1,512][0,685-0,936]
Положительный эффект при введении витаминного препарата был установлен и при
определении компонентов системы глутатиона в печени экспериментальных животных. У крыс,
получавших комплекс витаминов с микроэлементом на фоне интоксикации суспензией
порошка руды, повышались уровень GSH, свободных сульфгидрильных групп белков,
активность ферментов глутатионового цикла. Содержание в печени этой группы крыс α-
токоферола, аскорбиновой кислоты, активность СОД и каталазы, общая антиокислительная
активность существенно не отличались от показателей контрольной группы. Эти данные со
всей очевидностью позволяют предполагать об улучшении метаболических процессов в печени
с повышением интенсивности глутамилового цикла, синтезом глутатиона и поступлением его в
периферические ткани.
ВЫВОДЫ
1.Комплекс элементов медно-цинковой колчеданной руды при длительном
поступлении в организм приводит к нарушению в костной ткани системы глутатиона:
снижению уровня и регенерации восстановленного глутатиона, падению содержания
свободных сульфгидрильных групп белков, ингибированию активности глутатионзависимых
ферментов - глутатионпероксидазы, глутатионтрансферазы, γ-глутамилтранспептидазы.
2.Нарушения системы глутатиона в костной ткани при интоксикации элементами
рудыцветныхметалловнегативноотражаетсянауровнедругихкомпонентов
неферментативного(α-токоферол,аскорбиноваякислота)иферментативногозвеньев
(активность супероксиддисмутазы и каталазы) антиоксидантной защиты.
3.Хроническое действие природного комплекса тяжёлых металлов и других
токсичных элементов медно-цинковой колчеданной руды приводит к повышению тканевого
распада коллагена, нарушению координированного течения процессов ремоделирования
костной ткани с превалированием остеорезорбции, активации в костной ткани перекисного
окислениялипидов,сувеличениемуровняпервичныхивторичныхпродуктов
липопероксидации.
4.Компоненты полиметаллической руды при длительном поступлении даже в
низких дозах приводят к выраженным нарушениям функционирования системы глутатиона
(снижение содержания восстановленного глутатиона, свободных сульфгидрильных групп
белков,активностиглутатионпероксидазы,глутатионтрансферазы,глутатионредуктазы,
глюкозо-6-фосфатдегидро-геназы, γ-глутамилтранспептидазы), уровня других компонентов
антиокислительной защиты (аскорбиновая кислота, α-токоферол, супероксиддисмутаза,
каталаза) в печени, что сопровождается снижением содержания восстановленного глутатиона в
плазме крови.
5.Хроническая интоксикация комплексом элементов медно-цинковой колчеданной
руды вызывает нарушения ультраструктуры и микроархитектоники костной ткани, снижается
суммарная площадь и поперечный размер костных балок эпифизов, количество остеонов
диафизовтрубчатыхкостей.Приэлектронномикроскопическомигистологическом
исследовании обнаруживается деструкция внутриклеточных органелл остеоцитов и их
разрушение, рассасывание и истончение костных пластинок, усиление резорбции с
образованием многочисленных узуров, снижение костеобразования.
6.Применение антиоксидантного витаминного препарата на фоне хронической
интоксикации элементами, содержащимися в медно-цинковой колчеданной руде оказывает
выраженный профилактический эффект. При этом наблюдаются снижение содержания С-
концевых телопептидов коллагена типа I и свободного оксипролина в плазме крови на фоне
физиологической активности костной щелочной фосфатазы, характеризуя корреляцию
процессов резорбции и остеогенеза, ингибирование перекисного окисления липидов костной
ткани, улучшение показателей системы глутатиона и антиокислительной защиты в костной
ткани и печени.
7.Снижениеуровнявосстановленногоглутатионасдискоординацией
функционирования системы глутатиона и усиление свободнорадикального окисления в костной
ткани, играют ведущую роль в механизмах остеотоксического действия комплекса элементов,
содержащихся в медно-цинковой колчеданной руде.
Актуальность темы исследования
Воздействие тяжелых металлов на организм человека продолжает оставать- ся одной из актуальных направлений научных исследований [98]. Особую опас- ность представляют соли свинца, ртути, кадмия, меди, кобальта, железа. Потен- циальным источником загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами и другими токсичными элементами являются месторождения и добыча руд цветных металлов. На территории Республики Башкортостан расположено пять активно разрабатываемых месторождений медно-цинковых колчеданных руд, содержащих в своем составе более 80 минералов, включая пирит, халькопирит, серицит, сфа- релит и хлорит и другие, включающих медь, цинк, серу, хром, марганец, кадмий, свинец, серебро, мышьяк, железо, ртуть, никель, теллур, сурьму, таллий и другие элементы. Работники предприятий горнорудной промышленности, занятые добы- чей и обогащением цветных металлов, подвергаются воздействию высокодис- персной рудничной пыли, выделение которой сопровождает основные технологи- ческие процессы. Тяжелые металлы и их соединения проникают в организм через воздух, воду, пищу, оседают на коже, ногтях и волосах, накапливаются и оказы- вают токсическое воздействие на органы и ткани [10, 59, 81, 175]. В ротовой жидкости, твёрдых зубных отложениях, крови и волосах у работников горно- обогатительных производств по добыче и переработке медно-цинковых руд уста- новлено значительное превышение содержания Cu, Zn, Fe, Cr, Mn, Cd, Pb, Ag, As и других элементов, содержащихся в руде [36, 59, 75]. Анализ общей и профес- сиональной заболеваемости на горно-обогатительных комбинатах показывает, что болезни костно-мышечной системы и соединительной ткани среди причин с вре- менной утратой трудоспособности занимают высокое ранговое место [36, 59, 79]. Изучение патогенеза металлиндуцированных остеопений и поиск возможных пу- тей их коррекции остается актуальной задачей для медицинской науки. Действие тяжелых металлов и других токсичных элементов при их накоп- лении в тканях обусловлено нарушением металлолигандного гомеостаза, образо- ванием комплексов с функциональными группами биомолекул, изменяя их кон- формацию и биологическую активность. Особое место в этих механизмах занима- ет их взаимодействие с соединениями, имеющими тио-, алкилтио-, тиоэфирные и дисульфидные группы. Избыточное поступление, накопление или внутриклеточ- ное высвобождение металлов с переменной валентностью, особенно тяжёлых, провоцирует в тканях усиление генерации активных форм кислорода и активацию процессов свободнорадикального окисления с развитием окислительного стресса [9, 71, 154, 155, 175, 196].
Ведущую роль в процессах детоксикации металлов, ксенобиотиков и эндо- генных токсичных продуктов, в поддержании окислительно-восстановительного пула, являясь ключевым компонентом, играет система глутатиона [11, 66, 92, 121, 144, 147].
Восстановленный глутатион и ферменты глутатионовой системы выполня- ют важнейшие функции в интегративной защитной системе организма, способ- ствуя клеточной адаптации к стрессирующим воздействиям, оказывают влияние на течение клеточного цикла, процессы пролиферации и дифференцировки, апоптоза и ферроптоза клеток [28, 35, 87, 91, 105, 113, 115, 175].
Степень разработанности темы
Данная работа является продолжением изучения патогенетических меха- низмов повреждающего действия на костную ткань комплекса элементов, содер- жащихся в медно-цинковой колчеданной руде. Ранее проведенные исследования показали, что у горняков, добывающих медно-цинковую колчеданную руду под- земным способом, остеопенический синдром выявляется в 2-4 раза чаще, чем у рабочих наземных служб того же предприятия и жителей близлежащих террито- рий, а формирование остеопороза у горняков наблюдается в молодом возрасте и коррелирует со стажем работы [22, 36, 50, 76]. Моделирование хронического по- ступления элементов руды в организм экспериментальных животных показал, что большая группа элементов (Zn, Cu, Fe, Sr, Mn, Cr, Cd, Hg, Pb) накапливается в ко- стях, оказывая негативное влияние на их метаболизм [20, 22, 49, 50, 76]. Согласно результатам этих исследований остеотоксическое действие элементов руды цвет- ных металлов характеризуется нарушениями координации остеокласто- и остеоб- ластогенеза, изменением выработки системных и локальных регуляторных факто- ров метаболизма костной ткани, усилением интенсивности свободно- радикального окисления. Особое значение в механизмах токсического действия тяжёлых металлов при длительном поступлении в организм даже в низких кон- центрациях придаётся нарушениям антиоксидантной защиты [5, 9].
Изучение роли системы глутатиона в костной ткани в патохимических ме- ханизмах развития остеопении и остеопороза при действии элементов полиметал- лических руд и возможности коррекции изменений введением антиоксидантов представляет интерес не только в связи с ролью глутатиона, как кофактора в де- токсифицирующих реакциях, катализируемых глутатионзависимыми фермента- ми. Интересно также значение этой системы в регуляции окислительно- восстановительного потенциала клеток, активности тиолзависимых ферментов, рецепторов и транскрипционных факторов, её влияния на процессы ремоделиро- вания костной ткани.
Цель исследования. Выявление патогенетической значимости нарушений системы глутатиона в костной ткани в механизмах развития остеопении при воз- действии комплекса элементов, содержащихся в медно-цинковой колчеданной руде, и оценка эффективности действия антиоксидантного витаминного препара- та.
Задачи исследования
1. Изучить интенсивность процессов ремоделирования и перекисного окис- ления липидов в костной ткани, показатели катаболизма коллагена и минерально- го обмена при хронической интоксикации элементами, содержащимися в медно- цинковой колчеданной руде. 2. Охарактеризовать влияние комплекса элементов медно-цинковой колче- данной руды на систему глутатиона и функционально связанных с ней компонен- тов антиоксидантной защиты в костной ткани.
3. Исследовать действие компонентов руды на систему глутатиона в печени экспериментальных животных.
4. Изучить изменения микроархитектоники и ультраструктуры ткани труб- чатой кости при длительном поступлении в организм экспериментальных живот- ных элементов полиметаллической руды.
5. Оценить эффективность применения антиоксидантного препарата на си- стему глутатиона костной ткани и печени крыс при хронической интоксикации элементами, содержащимися в медно-цинковой колчеданной руде.
Методология и методы исследования
Работа является экспериментальным исследованием, выполненным с ис- пользованием научной методологии, с применением формально-логических, об- щенаучных и специфических методов. Она проведена по принципу случай- контроль с участием подопытных животных (белые беспородные половозрелые крысы-самцы, содержащиеся в идентичных условиях вивария) путем моделиро- вания ситуации с хроническим поступлением в организм элементов медно- цинковой колчеданной руды в низких концентрациях. Для достижения цели и ре- шения задач исследования использовались преимущественно биохимические ме- тоды: спектрофотометрия, иммуноферментный анализ, колорометрия; как вспо- могательные методы применялись гистохимические и электронно- микроскопические; результаты исследования подвергнуты адекватными методами статистического анализа. Все эксперименты проведены с учетом требований международных и российских законодательных актов о юридических и этических принципах исследований с использованием подопытных животных, одобрены этическим комитетом ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России (от 22.12.2016 г.). Научная новизна
В экспериментах с моделированием хронического поступления элементов медно-цинковой колчеданной руды подтверждено, что негативное действие руды на метаболизм костной ткани проявляется повышением катаболизма коллагена, дискоординацией ремоделирования с превалированием процессов резорбции, нарушением минерального обмена, интенсификацией перекисного окисления ли- пидов.
Впервые изучена патогенетическая роль системы глутатиона в развитии ме- таллиндуцированной остеопении при хронической интоксикации низкими дозами медно-цинковой колчеданной руды. Выявлено значительное падение уровня вос- становленного глутатиона и свободных сульфгидрильных групп белков, ингиби- рование активности глутатионзависимых ферментов – глутатионпероксидазы, глутатионтрансферазы и γ-глутамилтранспептидазы, основных ферментов систе- мы его регенерации – глутатионредуктазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. Установлено снижение в костной ткани функционально связанных с системой глутатиона содержания α-токоферола и аскорбиновой кислоты, активности супе- роксиддисмутазы и каталазы. Показано, что изменения метаболизма глутатиона в костной ткани при хроническом действии природного комплекса солей тяжёлых металлов медно-цинковой руды протекают на фоне нарушений системы глутати- она в печени.
Получены новые данные об изменении ультраструктуры эпифиза и диафиза трубчатых костей экспериментальных животных при интоксикации комплексом элементов руды цветных металлов. Показано что, наблюдается деструкция всех клеточных элементов остеоцитов и их исчезновение в лакунах кости, дезоргани- зация и деструкция микроархитектоники с рассасыванием и истончением костных пластинок, усиление резорбции и снижение костеобразования, уменьшение сум- марной площади костных трабекул, их поперечного разреза, а также количества остеонов и толщины суставного хряща эпифизов.
Выявлен положительной эффект применения антиоксидантного витаминно- го препарата (комплекса витаминов с микроэлементом) на фоне интоксикации экспериментальных животных элементами, содержащимися в медно-цинковой руды. Показано, что введение витаминного препарата, содержащего α–токоферол, β-каротин, аскорбат и селен, улучшает состояние системы глутатиона в костной ткани и печени, повышая уровни восстановленного глутатиона, активируя фер- менты глутатионового цикла и антиоксидантной защиты, подавляет в костной ткани интенсификацию резорбционных процессов.
Теоретическая и практическая значимость работы
Уточнены патофизиологические механизмы токсического действия на кост- ную ткань комплекса элементов, содержащихся в медно-цинковых колчеданных рудах. Выявлена роль нарушений системы глутатиона в патохимических измене- ниях метаболизма костной ткани в развитии остеопенического синдрома при дей- ствии компонентов руды цветных металлов. Экспериментально установлена эф- фективность использования антиоксидантного препарата (комплекса витаминов с микроэлементом) для профилактики развития остеопенического состояния. Пока- зано корригирующее влияние препарата на систему глутатиона, играющую веду- щую роль в процессах детоксикации токсичных элементов и антиоксидантной защиты в условиях длительного действия малых доз компонентов, содержащихся в медно-цинковой колчеданной руде, что может быть использовано при разработ- ке профилактических и лечебных мероприятий у рабочих горнодобывающих предприятий, работающих в условиях контакта с аэрозолями руд цветных метал- лов.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Длительное поступление комплекса элементов руды цветных метал- лов нарушает систему глутатиона в костной ткани и печени, ингибирует актив- ность основных антиоксидантных ферментов и снижает содержание α-токоферола и аскорбиновой кислоты, вызывая активацию перекисного окисления липидов. 2. Изменения метаболизма глутатиона в костной ткани при хронической интоксикации медно-цинковой рудой протекают на фоне нарушений системы глутатиона в печени.
3. Применение антиоксидантного препарата (комплекса витаминов с микроэлементом) на фоне хронического поступления в организм малых доз эле- ментов медно-цинковой колчеданной руды оказывает корригирующее действие на систему глутатиона и метаболизм костной ткани.
Степень достоверности, апробация результатов исследования, личное участие автора
Степень достоверности полученных результатов и обоснованность выводов базируется на адекватности экспериментальной модели, достаточном объёме ис- следований, использовании сертифицированного оборудования и реактивов, со- временных методов исследования; актами внедрения результатов работы и про- верке первичной документации; адекватной статистической обработке результа- тов.
Содержащиеся в работе результаты получены лично автором или при его непосредственном участии на всех этапах выполняемой работы. Определение те- мы диссертационной работы, цели и задач исследовании проводились автором совместно с научными руководителями д.м.н., доцентом Фаршатовой Е.Р. и д.м.н., профессором Камиловым Ф.Х. Автором самостоятельно проведены изуче- ние отечественной и зарубежной литературы, постановка экспериментальных ис- следований, методов, статистическая обработка, оценка и анализ полученных ре- зультатов, написание статей, оформление диссертационной работы.
Основные результаты диссертации изложены и обсуждены на 82-й и 83-й Всероссийских итоговых молодежных научных конференциях с международным участием «Вопросы теоретической и практической медицины» (Уфа, 2017, 2018); на международном научном конгрессе, посвященном 100-летию Пермского госу- дарственного медицинского университета им. академика Е.А. Вагнера «Актуаль- ные вопросы медицины 21 века» (Пермь, 2016); VIII и XI Российских научно- практических конференциях «Здоровье человека в XXI веке» (Казань, 2016, 2019); Российском конгрессе по остеопорозу, остеоартрозу и другим метаболическим заболеваниям скелета (Казань, 2016); Всероссийской образовательно-научно- практической конференции студентов и молодых специалистов с международным участием «Биохимические научные чтения памяти академика РАН Е.А. Строева» (Рязань, 2017); межрегиональной научно-практической конференции с междуна- родным участием «Актуальные вопросы медицинской биохимии и лабораторной диагностики» (Ижевск, 2017); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Медицинская биохимия – от фундаментальных ис- следований к клинической практике. Традиции и перспективы», посвященной 90- летию профессоров А.Ш. Бышевского и Р.И. Лифшица (Тюмень, 2019); совмест- ном заседании проблемной комиссии «Морфология и общая патология», кафедры биологической химии и кафедры патологической физиологии ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, 29 июня 2020 г.
Внедрение результатов исследования в практику
Основные результаты диссертационного исследования используются в учебном процессе на кафедрах биологической химии (акт от 15.06.2020г.), пато- логической физиологии (акт от 15.04.2021г.), гигиены с курсом медико- профилактического дела ИДПО (акт от 15.04.2021г.) ФГБОУ ВО БГМУ Минздра- ва России, на кафедрах биологической химии (акт от 02.06.2021г.), патологиче- ской физиологии (акт от 02.06.2021г.) ФГБОУ ВО ИГМА Минздрава России, на кафедре патологической физиологии ФГБОУ ВО УрГМУ Минздрава России.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 16 работ, в том числе 6 – в изда- ниях, включенных в «Перечень рецензируемых научных изданий или входящих в международные реферативные базы данных и системы цитирования, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соис- кание учёных степеней доктора и кандидата наук», из них 1 статья в журнале, входящем в международные базы данных Scopus и Web of Science. 7 работ опуб- ликованы в материалах конференции, имеется 3 публикации в электронных науч- ных изданиях.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста, и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, главы собствен- ных исследований, обсуждения результатов, выводов.
Библиографический указатель включает 204 источника, в т.ч. 81 на русском языке, 123 – на иностранном. Работа содержит 19 таблиц и 37 рисунков.
Читать «Система глутатиона в костной ткани при действии элементов медно-цинковой колчеданной руды»
Публикации автора в научных журналах
Помогаем с подготовкой сопроводительных документов
Хочешь уникальную работу?
Больше 3 000 экспертов уже готовы начать работу над твоим проектом!
4.8 (30 отзывов)
0 (13 отзывов)
4.9 (826 отзывов)
4.6 (92 отзыва)
4.8 (1033 отзыва)
4.7 (46 отзывов)
5 (8 отзывов)
4.8 (373 отзыва)
5 (49 отзывов)
