Структурно-функциональные нарушения митохондрий в патогенезе неалкогольной жировой болезни печени при ожирении и сахарном диабете 2 типа

В настоящем исследовании были использованы результаты комплексного
клинико-лабораторного обследования 305 человек, из которых 263 пациента имели алиментарно-конституциональный тип ожирения. Тип локализации ожирения был абдоминальный и гипертрофический по морфологии. Распределение пациентов по группам представлено в таблице 1. Согласно таблице 1, пациенты с НАЖБП без СД 2 типа с ИМТ<40 кг/м2 составили группу 2 (44 человека), пациенты с НАЖБП без СД 2 типа с ИМТ>40 кг/м2 – группу 3 (88 человек). Группы 4 и 5 составили больные НАЖБП с ожирением и СД 2 типа: 42 пациента с ИМТ<40 кг/м2 и 89 пациентов с ИМТ>40 кг/м2 соответственно (Таблица 1). В группу сравнения (группа 1, далее – группа контроля) были включены 42 условно здоровых донора, с нормальными антропометрическими и биохимическими показателями. Все исследуемые группы были сопоставимы по возрастным и гендерным характеристикам (Таблица 1).
Таблица 1 – Основные клинические показатели исследуемых групп Показатели исследуемых групп

Контроль- ная группа (Группа 1; n=42)
Пациенты с НАЖБП без СД 2 типа, ИМТ <40 кг/м2 (Группа 2; n=44) Пациенты с НАЖБП без СД 2 типа, ИМТ >40 кг/м2 (Группа 3; n=88)
Пациенты с НАЖБП с СД 2 типа, ИМТ< 40 кг/м2 (Группа 4; n=42) Пациенты с НАЖБП с СД 2 типа, ИМТ >40 кг/м2 (Группа 5; n=89)
Показатели
Мужчины/ женщины Возраст, лет
ИМТ, кг/м2
Примечание: * – при р<0,05 по отношению к показателей контрольной группы Mean - среднее значение; SD - стандартное отклонение 17/25 35,82±8,26 11/33 41,59±8,72 18/70 44,19±9,11 18/24 45,1±9,13 36,1±2,73 21/68 48,47±8,17 49,53±7,59 22,55±3,49 35,69±2,62 48,38±7,31 В настоящем исследовании были использованы следующие критерии включения: возраст от 18 до 65 лет; поставленный в условиях стационара диагноз - ожирение без нарушений углеводного обмена; поставленный в условиях стационара диагноз – ожирение, ассоциированное с верифицированным диагнозом - СД 2 типа; поставленный в условиях стационара диагноз НАЖБП; диагноз ожирение - не более 10 лет; наличие подписанного информированного согласия на участие в исследовании и использование биологического материала в целях исследования. К критериям исключения относились следующие пункты: возраст до 18 лет и после 66 лет; нарушение мозгового кровообращения, острый инфаркт миокарда, заболевания щитовидной железы, аутоиммунные и инфекционные заболевания, воспалительные очаги любой локализации, онкологические и наследственные заболевания, психические заболевания, длительный прием гиполипидемических препаратов, алкогольная и наркотическая зависимости; больные, которые отказывались от врачебного и лабораторного контроля в ходе исследования. В анамнезе лиц группы контроля отсутствовали аллергические заболевания, обострения хронических воспалительных процессов, инфекционных заболеваний, наследственные и психические болезни, а также злоупотребление курением, алкоголем, наркотическая зависимость. От момента последнего эпизода ОРВИ прошло более двух месяцев. Все обследованные лица этой группы не имели кардиоваскулярной патологии, нарушений углеводного, белкового и липидного обменов. Материалом исследования являлась венозная кровь (отобранная натощак в вакуумные пробирки с фиолетовой и красной маркировкой Vacuette) и биоптаты печени. Взятие биологического материала (ткань печени) у больных НАЖБП и ожирением, вне зависимости от состояния углеводного обмена, проводили при проведении бариатрических операций (гастрошунтирование или продольная резекция). Биоптаты печени у контрольной группы были взяты при проведении рутинных лапароскопических операций: паховая грыжа справа или слева, бедренная, диафрагмальная и вентральная грыжи, нефроптоз; образцы крови у контрольной группы были получены натощак перед проведением оперативных вмешательств. Перед проведением операции за 36 часов пациенты с ожирением прекращали прием лекарственных препаратов, влияющих на углеводный и липидный обмены. Измерение биохимических показателей: АЛТ, АСТ, щелочная фосфатаза, Гамма-ГТ, общий белок, глюкоза, триглицериды, холестерин, ЛПВП, ЛПНП, общий и прямой билирубин, С-реактивный белок, гликированный гемоглобин в крови было проведено фотометрическим методом на автоматическом биохимическом анализаторе Furuno СА-180 («Furuno Electric Company», Япония) с использованием коммерческих тест-систем DiaSys («DiaSys Diagnostic Systems», Германия). Ткань печени, полученную интраоперационно при инцизионной биопсии из левой доли печени, фиксировали в нейтральном забуференном формалине и далее передавали на гистологическое исследование (создание парафиновых срезов, окрашивание образцов) д.м.н., заведующей лаборатории иммуногистохимии БФУ им. И. Канта, профессору Волковой Л.В. Парафиновые срезы толщиной 4-5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином и анализировали их с помощью микроскопа Leica DM3000 со встроенным программным обеспечением Pannoramic 250 FLASH. Далее, с помощью программного обеспечения Image–J Software, оценивали количественные показатели: площадь липидных капель, количество лимфоцитов в препаратах ткани печени. Количественное определение цитокинов (sLIGHT/TNFSF14, IL-10, IL-6, gp130/sIL-6Rb, sIL-6Ra) в крови оценивали методом проточной флуориметрии на двухлучевом лазерном на двухлучевом лазерном автоматическом анализаторе (Bio- Plex® 200 Systems, «Bio-Rad», США), используя коммерческие тест-системы (Bio- Plex Pro Human Inflammation Cytokine 37-plex Assay, «Bio-Rad», США). По стандартной кривой (динамический диапазон составлял 2-32 000 пг/мл) определяли концентрацию исследуемых молекул. Результаты выражали в пг/мл. Выделение тотальной РНК из образцов ткани печени, а также постановку реакции обратной транскрипции проводили с использованием наборов реагентов ExtractRNA и MMLV RT kit, соответственно («Евроген», Россия). Для определения уровней относительной экспрессии генов проводили количественную ПЦР в режиме реального времени с флуоресцентными зондами. Матрицей для определения уровня экспрессии генов TFAM, MFN2, BAX, DMN1L, SOD1, NF-κβ и MT-ND4 служила тотальная РНК. Ген RPLPO был использован в качестве референсного гена [Vandesompele J., et al., 2002], а ген β2-microglobulin - в качестве нормировочного. Нуклеотидные последовательности и первичные транскрипты (Таблица 2) изучаемых генов были конструированы с помощью программ «Primer.3», «Oligo Analyzer», «Primer-BLAST» и базы данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). ПЦР проводилась на амплификаторе CFX96 («BioRad», США) в объеме 25 мкл. Протокол амплификации (шаг нагревания 5oС, 39 циклов): 3 минуты при 96o С; 10 секунд при 96oС; 30 секунд при 60-62 oС; 15 секунд при 72oС; 5минут 72 oС. Расчеты уровня относительной экспрессии исследуемых генов по результатам ПЦР в реальном времени производили с помощью модифицированной формулы Пфаффла для разных эффективностей амплификации (https://toptipbio.com/pfaffl- method-qpcr/). Таблица 2 - Последовательность олигонуклеотидных праймеров, используемых в эксперименте Ген Нуклеотидная последовательность праймеров RPLPO Размер продукта, п.н. 20 R: 20 25 SOD1 F: 5’-CGTGGCTGTGGTGGCTTC-3’ 18 R: 5’-CGTGGTGCTTGCTGTGGT-3’ 18 FAM-5’-CCTCCCCGACCTGCCCTACGACTA-3’ 24 18 R: 20 22 MT-ND4 F: 5’- 21 R: 5’- 19 25 BAX F: 5’–AGTAACATGGAGCTGCAGAGGA–3’ 22 R: 5’– CCAGTTGAAGTTGCCGTCAGAA –3’ 22 FAM-5’-TGATTGCCGCCGTGGACACAGACT–3’-BHQ-1 24 DMN1L F: 5’-TCTGGAGGTGGTGGGGTTG-3’ 19 26 F: 5’-GGCGACCTGGAAGTCCAACT-3’ 5’-CCATCAGCACCACAGCCTTC-3’ Bgl635-5’-ATCTGCTGCATCTGCTTGGAGCCCA-3’-BHQ-2 -BHQ-1 MFN2 F: 5’-CCAGCGTCCCATCCCTCT-3’ 5’-TCCACACCACTCCTCCAACA-3’ FAM-5’-ACAGGGCTCGCTCACCCAGGAG-3’-BHQ-1 GCTCCATCTGCCTACGACAAA -3’ TGCGACTGTGAGTGCGTTC -3’ FAM-5’- TAACAGCCATTCTCATCCAAACCCC -3’-BHQ-1 R: 5’- TGGGTTTTGATTTTTCTTCTGCTAAT -3’ FAM-5’-ACCAACCACAGGCAACTGGAGAGGA-3’-BHQ-1 25 NF-κβ1 F: 5’-CAGGAAGATGTGGTGGAGGA-3’ 20 R: 5’- TGGGGTGGTCAAGAAGTAGTG-3’ 22 FAM-5’-CCTTCTGGACCGCTTGGGTAACTCTGT-3’-BHQ-1 27 TFAM F: 5’-CGCTCCCCCTTCAGTTTTGT-3’ 20 R: 5’-TACCTGCCACTCCGCCCTAT-3’ 20 FAM-5’-CGAGGTGGTTTTCATCTGTCTTGGCA-3’-BHQ-1 26 Для постановки цифровой капельной ПЦР выделяли ДНК из ткани печени с использованием коммерческих наборов «QIAamp DNA Mini Kit» согласно протоколу производителя («QIAGEN»). Концентрацию ДНК в образцах измерили с помощью спектрофотометра Implen NanoPhotometer на длине волны 260 нм. Качество экстрагированной ДНК определяли по соотношению поглощений на длинах волн 260 и 280 нм (A260/280>1,8). Подсчет количества копий мтДНК в расчете на 1 клетку определяли методом мультиплексной цифровой капельной ПЦР (цкПЦР) с использованием системы QX200 Droplet Digital PCR System, BioRad. Реакционную смесь из коммерческого ddPCR MasterMix (Bio-Rad, Pleasanton, CШA), праймеров, зондов и самой ДНК загружали в автоматический генератор капель (Bio-Rad, Pleasanton, CA) для эмульсифицирования примерно по 15–20 тысяч капель на один
9

нанолитр. Эмульсифицированная кцПЦР смесь переносилась в стандартные 96- луночные планшеты и амплифицировалась в термоциклире (Bio-Rad T100 thermal cycler) по следующему температурному протоколу: 95 oC 10 минут, 40 циклов 94 oC 30 секунд и 53 oC 60 секунд и заключительный цикл 98 oC 10 минут. После реакции амплификации проводилась регистрация флуоресцентных сигналов по конечной точке с использованием модуля (QX200 Droplet Reader, Bio-Rad, Pleasanton, CШA). Применение новейшего метода обусловлено подсчетом абсолютной количественной оценки таргентных молекул мтДНК, что необходимо для выявлений закономерностей изменения числа копий мтДНК.
Полученные данные кцПЦР с модуля X200TM Droplet DigitalTM PCR System анализировались в программе QuantaSoft (версия 1.7.4.0917). Абсолютное количество копий мтДНК в расчете на клетку вычисляли по формуле:
Выделение суммарного белка из гомогенизированной ткани печени проводилось с помощью лизирующего буфера RIPA (Thermo Scientific, USA). Для проведения электрофореза использовали коммерческие полиакриламидные гели (mini-PROTEAN TGX Stein-Free Gels, Bio-Rad, USA). Перед загрузкой в гели образцы прогревали при 95°С в течение 5 минут с добавлением буфера для загрузки проб Tris- Glycine SDS 2x (novex, USA) и DDT (Thermo Fisher Scientific, USA). Электрофорез проводили в течение часа при 200V. Далее «сэндвич», состоящий из губок, PVDF- мембраны и геля помещали в электрофорезную камеру для полусухого переноса Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad, USA) на режим Turbo (2,5 A, 25V). После проведения инкубации с первичными специфическими антителами против исследуемых белков (TFAM, MFN2, BAX, DRP1, SOD1, NF-κβ/p65 и GAPDH) и со вторичными, меченные пероксидазой хрена, антителами проводили инкубацию PVDF-мембраны в растворе ECL (Thermo Scientific, USA) и детектировали бэнды белков с помощью Chemi Doc (Bio-Rad, USA) в режиме Optimal Auto-exposure. Полученные данные анализировали с помощью программы ImageLab (Bio-Rad, USA). Продукцию белков оценивали при соотношении значений денситометрии исследуемого белка и референсного – GAPDH.
Анализ всех полученных данных эксперимента был проведен в программе Graph Pad Prism 7. Первоначально, все изученные параметры были проверены на нормальность распределения с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Далее в исследуемых выборках проводили проверку гипотезы о равенстве средних независимых выборочных величин с помощью t-критерия Стьюдента (в случае нормального распределения) и критерия Манна-Уитни (в случае ненормального распределения). Достоверными различия являлись при уровне значимости р<0,05. Корреляционный анализ для подтверждения взаимосвязи между исследуемыми показателями проводили путем вычисления коэффициента ранговой корреляции Спирмена (r). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ НАЖБП одно из распространенных заболеваний в гепатологии [Parthasarathy G. et al., 2020; Pafili K., Roden M., 2021]. Инсулинорезистентность (ИР) и окислительный стресс играют ключевую роль в патогенезе НАЖБП [Parthasarathy G. et al., 2020]. Несмотря на понимание того, как липиды накапливаются в печени, механизмы развития стеатогепатита и фиброза до сих пор мало изучены. Согласно современной теории «множественных параллельных ударов» [Buzzetti E. et al., 2016], ИР, окислительный стресс и активация провоспалительных и фиброгенных путей (включая активацию клеток Купфера и звездчатых клеток печени) происходят параллельно, приводя, в итоге, к неалкогольному стеатогепатиту и фиброзу [Byrne C. D. et al., 2015]. Известно, что при НАЖБП в крови увеличивается содержание печеночных показателей: АЛТ, АСТ, ЩФ, ГГТ, общего белка, всех фракций билирубина [Pafili K., Roden M., 2021]. В данном исследовании вышеперечисленные показатели не выходили за рамки референсных значений, однако достоверно увеличивались у всех больных НАЖБП с ожирением по сравнению с контролем (Таблица 3). У всех больных НАЖБП (кроме группы без СД 2 типа с ИМТ>40 кг/м2), значения суммарной площади жировых включений в гепатоцитах были выше, чем в контроле (Рисунок 1А). У всех пациентов с НАЖБП были обнаружены лимфоциты в ткани печени (Рисунок 1Б). У больных НАЖБП с ИМТ>40 кг/м2 с СД 2 типа число лимфоцитов в печени превышало аналогичные показатели в группе пациентов без СД 2 типа с ИМТ>40 кг/м2 (Рисунок 1, Б). В группе больных НАЖБП с ИМТ>40 кг/м2 без СД 2 типа число лимфоцитов в печени оказалось ниже, чем у лиц с ИМТ<40 кг/м2 (Рисунок 1Б). Таким образом, у больных НАЖБП с морбидным ожирением на фоне СД 2 типа регистрируются более выраженные признаки воспаления в ткани печени. Таблица 3 - Биохимические показатели и содержание инсулина в крови в исследуемых группах Исследуемые группы Показатели АЛТ (до 31,0 е/л) АСТ (до 31,0 е/л) ЩФ (до 258,0 е/л) Контрольная группа (Группа 1; n=42) 15,15 (12,25-19,80) 18,05 (15,95-22,28) 149,50 (121,80-179,30) Пациенты с ожирением без СД 2 типа, ИМТ <40 кг/м2 (Группа 2; n=28) 23,60 (16,40-27,23) p1<0,001* 21,05 (17,65-25,53) 170,00 (141,30-206,50) p1=0,049* Пациенты с ожирением без СД 2 типа, ИМТ >40 кг/м2 (Группа 3; n=51)
22,00 (15,70-37,60) p1<0,001* 23,50 (16,00-37,50) p1=0,043* 180,00 (155,00- 206,00) p1<0,001* Пациенты с ожирением с СД 2 типа, ИМТ< 40 кг/м2 (Группа 4; n=35) 35,10 (18,10-51,00) p1<0,001* p2=0,002* p3=0,014* 22,50 (17,00-37,00) p1=0,008* 167,00 (133,00-194,00) Пациенты с ожирением с СД 2 типа, ИМТ >40 кг/м2 (Группа 5; n=69)
24,20 (14,90-40,85) p1<0,001* p4=0,028* 22,60 (16,65-29,95) p1=0,007* 192,00 (157,30-232,80) p1<0,001* p2=0,045* p4=0,002* 11 ГГТ (до 32,0 е/л) Общий белок (66,0-88,0 г/л) 15,50 (13,13-19,45) 79,00 (74,95-80,00) 21,25 28,50 40,50 (17,50-29,38) (20,00-50,20) (22,00-61,20) p1<0,001* p1<0,001* p1<0,001* 39,50 (28,10-56,35) p1<0,001* p2<0,001* p3=0,006* 69,80 (65,10-74,20) p1<0,001* p2=0,005* p3<0,001* 7,30 (5,98-9,83) p1<0,001* p2<0,001* p3<0,001* 262,20 (134,00-530,70) р1<0,001* р2=0,030* р3=0,020* 73,85 (70,02-77,85) p1=0,004* 73,90 (71,10-77,40) p1<0,001* p2<0,001* 72,50 (66,60-75,70) p1<0,001* Глюкоза (3,9-6,4 (4,91-5,35) (4,87-6,48) (4,67-6,01) (5,59-8,12) ммоль/л) Инсулин, пг/мл 45,93 (39,26-61,25) 93,42 (44,41-170,50) 134,30 (67,79- 237,10) p1=0,003* p1<0,001* p2=0,004* p3<0,001* 502,20 (255,70- 1248,00) р1<0,001* р2=0,010* р3=0,004* 5,14 5,66 p1=0,009* 5,12 6,64 Примечание: * - значимость «px» определена при использовании параметрического критерия Стьюдента для двух несвязанных выборок, (Mean±SD); ** - значимость «px» определена при использовании непараметрического критерия Манна-Уитни для двух несвязанных выборок, где x-группа сравнения, (Mе, Q1–Q3) Рисунок 1 - Изменение показателей гистологического исследования ткани печени: А – площади липидных капель в печени; Б – количества лимфоцитов в паренхиме печени. 1-контрольная группа; 2-больные ожирением без СД 2 типа с ИМТ<40 кг/м2; 3-с ИМТ>40 кг/м2; 4-больные ожирением с СД 2 типа с ИМТ<40 кг/м2; 5-с ИМТ>40 кг/м2. «*» – статистически значимые различия, p<0,05. Апоптоз гепатоцитов является механизмом прогрессирования НАЖБП [Akazawa Y., Nakao K. J., 2018], способствуя повреждению печени и формированию фиброза [Alkhouri N. et al., 2011; Akazawa Y., Nakao K. J., 2018]. Процесс апоптоза запускается и регулируется несколькими механизмами. Проапоптотический белок BAX относится к митохондриальному пути апоптоза. В здоровых клетках BAX локализуется в основном в цитозоле; во время апоптоза перемещается к митохондриям и встраивается во внешнюю митохондриальную мембрану, переходя в активированную форму [Westphal D. et al., 2011]. Нами было выявлено более высокое содержание белка BAX в ткани печени у больных НАЖБП с ожирением и СД 2 типа, чем в контроле (Рисунок 2Б), что может вносить вклад в воспалительный процесс органа при развитии ИР. Однако, экспрессия гена BAX была ниже у больных НАЖБП с ИМТ>40 кг/м2, независимо от состояния углеводного обмена (Рисунок 2А). При НАЖБП сигналы апоптоза не всегда приводят к гибели клеток. Происходит «сублетальная» передача сигналов, при которой процесс запрограммированной смерти инициируется, но не завершается [Akazawa Y., Nakao K. J., 2018]. Эти неполные апоптотические сигналы инициируются в гепатоцитах, поражая звездчатые клетки и макрофаги, что может привести к воспалению и фиброзу [Hirsova P. et al., 2016a; Hirsova P. et al., 2016b]. У больных НАЖБП с ИМТ<40 кг/м2 без СД 2 типа экспрессия гена BAX положительно коррелировала с наличием стеатоза (r=0,81, p<0,05). Таким образом, незавершенный апоптотический ответ может вносить вклад в формирование стеатоза печени при ожирении у этой категории пациентов. Важным регулятором иммунных и воспалительных реакций является фактор транскрипции NF-κβ, который усиливает выработку провоспалительных цитокинов, в частности - TNFa и IL-1 [Giridharan S. et al., 2018; Morgan M. J. et al., 2011]. Существует два пути активации сигналинга NF-κβ: канонический и неканонический [Chen Q. et al., 2021]. Канонический путь хорошо изучен и зависит от деградации Iκβα [Sun S.-C., 2017]. Активация неканонического сигнального пути NF-κβ зависит от процессинга p100 [Sun S.-C., 2011; Tilborghs S. et al., 2017]. Киназа, индуцирующая NF-κβ (NIK), является центральным и специфическим сигнальным компонентом в неканоническом сигнальном пути NF-κβ [Tilborghs S. et al., 2017]. Нами было выявлено, что экспрессия гена NF-κβ1 (компонент канонического сигнального пути) в клетках печени была снижена у больных НАЖБП без СД 2 типа с ИМТ>40 кг/м2 относительно контроля и пациентов с НАЖБП с СД 2 типа с ИМТ>40 кг/м2 (Рисунок 2В). При этом содержание белка NF-κβ/p65 в печени у больных НАЖБП без СД 2 типа было выше в сравнении с контролем (Рисунок 2Г). В подтверждение потенциальных протекторных функций неканонического пути NF-κβ, нами была выявлена отрицательная корреляция между площадью липидных капель в гепатоцитах и содержанием белка NF-κβ/p65 у больных НАЖБП с ИМТ>40 кг/м2 (r=- 0,76, p<0,05). Мы предполагаем, что приНАЖБП происходит переключение активации NF-κβ с канонического пути на неканонический, который может нивелировать проявления стеатоза и воспаления при НАЖБП (Рисунок 6). Помимо повышенного накопления внутриклеточных липидов и апоптоза гепатоцитов, НАЖБП характеризуется высоким уровнем АФК в гепатоцитах и адипоцитах [Li R. et al., 2020]. При НАЖБП повышенная продукция АФК митохондриями и снижение активности механизмов поглощения АФК (например, GSH, SOD2 и каталазы), могут усиливать эффекты окислительного стресса за счет окисления полиненасыщенных жирных кислот, что приводит к образованию побочных продуктов альдегида, таких как 4-гидрокси-2-ноненаля и малонового диальдегида [Li R. et al., 2020]. SOD1 является известным внутриклеточным антиоксидантным ферментом. Значения экспрессии гена SOD1 в печени у больных НАЖБП с ИМТ>40 кг/м2 с СД 2 типа/без него были значимо ниже, чем в контроле (Рисунок 2Д), что свидетельствует о снижении содержания компонента антиоксидантной защиты в зависимости от массы ЖТ (r=-0,78, p<0,05). У больных НАЖБП без СД 2 типа с ИМТ<40 кг/м2 и с СД 2 типа с ИМТ>40 кг/м2 была обнаружена отрицательная корреляция между содержанием белка SOD1 (Рисунок 2 Е) и площадью жировых включений в печени (r=-0,89 и r=-0,79, p<0,05, соответственно). Также у больных НАЖБП с ИМТ>40 кг/м2 с СД 2 типа / без него снижение уровня экспрессии гена SOD1 в биоптатах печени было взаимосвязано с низкой экспрессией гена BAX (r=0,62 и r=0,64, p<0,05, соответственно) и NF-κβ1 (r=0,63 и r=0,65, р<0,05, соответственно). Таким образом, выявленное нами снижение экспрессии генов компонентов антиоксидантной защиты и апоптоза у всех больных НАЖБП с морбидным ожирением, может свидетельствовать об истощении компенсаторных протекторных механизмов в печени (Рисунки 6, 7). Рисунок 2 – Изменение уровня экспрессии генов BAX (А), NF-κβ1 (В), SOD1 (Г) в клетках печени в исследуемых группах. Примечание: здесь и в рисунках 3,4,5 - 1-контрольная группа; 2-больные ожирением без СД 2 типа с ИМТ<40 кг/м2; 3-с ИМТ>40 кг/м2; 4-больные ожирением с СД 2 типа с ИМТ<40 кг/м2; 5-с ИМТ>40 кг/м2) и содержания соответствующих белков (Б,Г,Е): здесь и в рисунках 3,4 – 1- контрольная группа; 2-больные ожирением; 3-больные ожирением и СД 2 типа). «*» – статистически значимые различия, p<0,05. (Рисунок 3А). Комплекс I является одним из нескольких ферментных комплексов, необх Измененный липидный обмен и окислительный стресс при ожирении вовлечены в дисфункцию митохондрий клеток печени [Lee J. et al., 2019]. Индуцированный ИР приток ЖК приводит к стеатозу печени и адаптивному увеличению их окисления в митохондриях печени [Wang J. et al., 2020]. Однако метаболическая гибкость митохондрий клеток печени со временем теряется. В образцах печени, полученных у больных НАЖБП с ожирением и СД 2 типа и без него, нами обнаружен более высокий (относительно контроля) уровень экспрессии гена MT-ND4, кодирующего субъединицу Комплекса I дыхательной цепи одимых для окислительного фосфорилирования [García-Ruiz I. et al., 2010]. Вероятно, увеличение уровня первого компонента дыхательной цепи митохондрий в клетках печени является компенсаторным механизмом в ответ на избыточное поступление СЖК в гепатоциты (Рисунки 6, 7). Окислительный стресс в клетках, который возникает вследствие ожирения, может вызывать изменение количества мтДНК и возникновение их мутаций [Lee J. et al., 2019]. МтДНК чувствительна к окислительному повреждению, так как непосредственно примыкает к месту продукции АФК и систем репарации ДНК [Lee J. et al., 2019]. НАЖБП характеризуется истощением мтДНК и повышенным уровнем 8-гидрокси-2'- дезоксигуанозина (8-OHdG/окисленная форма дезоксигуанозина) [Lee J. et al., 2019; Wang J. et al., 2020]. Нами было показано снижение (более чем в 2 раза) количества копий мтДНК в ткани печени у всех больных НАЖБП относительно контроля (Рисунок 3Б). Рисунок 3 - Изменение уровня экспрессии генов MT-ND4 (А),TFAM (В) и содержания белка TFAM (Г), а также числа копий мтДНК в клетках печени в исследуемых группах. «*» - статистически значимые различия, p<0,05. У всех больных НАЖБП с ожирением и СД 2 типа обнаружена взаимосвязь количества мтДНК в печени с уровнем инсулина в крови (r=-0,53, р<0,05) и HOMA-IR (r=-0,54, р<0,05), что может указывать на связь снижения копийности мтДНК в печени с развитием ИР. Также у всех больных НАЖБП с ожирением была найдена отрицательная взаимосвязь количества копий мтДНК с площадью стеатоза в гепатоцитах (r=-0,58, р<0,05). Кроме того, количество мтДНК отрицательно коррелировало с уровнем экспрессии мРНК гена MT-ND4 в печени (r=-0,51, р<0,05) у больных НАЖБП без СД 2 типа. Так, с увеличением площади стеатоза, возрастает элемент митохондриального дыхания (Комплекс I), что приводит к снижению копийности мтДНК в печени у пациентов с НАЖБП. В дополнение, у всех больных НАЖБП без СД 2 типа были найдены положительные корреляции между количеством копий мтДНК и содержанием белка SOD1 (r=0,63, р<0,05), отрицательные: между копийностью мтДНК и площадью стеатоза в гепатоцитах (r=- 0,46, р<0,05), что может свидетельствовать о зависимости мтДНК от активности антиоксидантной системы (Рисунки 6, 7). У всех больных НАЖБП с ожирением уровень экспрессии гена TFAM в печени значимо не изменялся, однако наблюдалась тенденция к его снижению (Рисунок 3В). Напротив, содержание белка TFAM в печени, имело тенденцию к увеличению у больных НАЖБП с СД 2 типа (Рисунок 3Г). Наряду с биогенезом митохондрий, при ожирении наблюдается нарушение процессов деления и слияния митохондрий. Динамические изменения морфологии митохондрий необходимы для нормального функционирования клетки в изменчивых условиях [Ren L. et al., 2020]. Деление митохондрий опосредуется привлечением DRP1 на внешнюю митохондриальную мембрану из цитоплазмы клетки. Нарушение регуляции белков, участвующих в делении митохондрий существенно изменяет морфологию митохондрий и нарушает их функции [Horbay R. et al., 2016]. У больных НАЖБП с СД 2 типа (ИМТ>40 кг/м2) уровень экспрессии гена DMN1L в клетках печени был ниже контроля, что было сопоставимо с содержанием белка DRP1 в ткани печени (Рисунок 4А,Б). Были выявлены отрицательные корреляции между содержанием белка DRP1 и площадью стеатоза в гепатоцитах у больных НАЖБП с СД 2 типа и без него (ИМТ>40 кг/м2) (r=-0,88 и r=-0,76, p<0,05, соответственно). Также у всех больных НАЖБП были обнаружены отрицательные взаимосвязи экспрессии гена DMN1L и продукции белка DRP1 в печени с плазменным уровнем инсулина (r=-0,57 и r=-0,54, p<0,05, соответственно) и индексом HOMA-IR (r=-0,83 и r=-0,76, p<0,05, соответственно). Это демонстрирует, что прогрессия стеатоза, а также развитие ИР приводят к уменьшению деления митохондрий, а значит, происходит нарушение баланса динамики митохондрий при НАЖБП. У больных НАЖБП с СД 2 типа (ИМТ>40 кг/м2) были найдены взаимосвязи между содержанием белков DRP1 и SOD1 в клетках печени (r=0,88, p<0,05). У больных НАЖБП без СД 2 типа с ИМТ>40 кг/м2 также наблюдалась тенденция к снижению деления митохондрий, ассоциированная со снижением компонента антиоксидантной системы (корреляция экспрессии гена DMN1L и уровня экспрессии гена SOD1 r=0,67, p<0,05). Таким образом, снижение эффективности антиоксидантной защиты, наряду с ИР при ожирении (ИМТ>40 кг/м2), приводит к снижению митохондриального деления в клетках печени (Рисунок 7). Слияние митохондрий в клетках млекопитающих опосредуется белками MFN1 и MFN2 [Ding M. et al., 2020]. Слияние позволяет поврежденным митохондриям с окисленными липидами, белками и мутантной митохондриальной ДНК смешиваться со здоровыми, что помогает восстановить функции митохондрий и поддерживать клеточный гомеостаз [Li R. et al., 2020]. Согласно полученным нами данным, у больных НАЖБП уровень экспрессии гена MFN2 в печени не изменялся (Рисунок 4В,Г). Таким образом, митохондриям клеток печени отводится основная роль в утилизации и клиренсе избыточных липидов. При ожирении возникает ситуация, когда в гепатоцитах истощаются ресурсы для переработки высокого уровня СЖК. В первую очередь, компенсаторно увеличивается дыхание митохондрий, за счет увеличения
экспрессии генов дыхательного комплекса, в частности, комплекса 1 (ген MT-ND4), что опосредует высокий уровень АФК, за счет утечки электронов. Одной из мишеней свободных радикалов является мтДНК, что ведет к уменьшению ее копийности. Нами было выявлено, что при увеличении ИМТ>40 кг/м2, снижается активность компонента антиоксидантной системы, способствуя уменьшению мтДНК в клетках печени. Все вышеперечисленные процессы ведут к увеличению образования липидных капель и инфильтрации ткани печени лимфоцитами. В итоге, динамика митохондрий при ожирении претерпевает изменения, а именно, с ростом ИМТ и развитием ИР деление митохондрий значительно уменьшается (Рисунки 6, 7).
Как уже упоминалось ранее, в патогенез ожирения и ИР вовлечен ряд секретируемых факторов [Braunersreuther V. et al., 2012; Niederreiter L. et al., 2018], одним из которых является TNFSF14/LIGHT [Otterdal K. et al., 2015].
Было показано,
что TNFSF14/
LIGHT
может изменять гомеостаз и функцию печени за счет
уменьшения накопления воспалительных клеток и стимуляции секреции
воспалительных цитокинов
[Herrero-Cervera A. et al., 2019].
Рисунок 4 – Изменение экспрессии генов DNM1L (А) и MFN2 (В) в клетках печени в исследуемых группах и содержания соответствующих белков (Б,Г). «*» – статистически значимые различия, p<0,05. Исследования J. Bassols et al. (2010) продемонстрировали более высокий уровень TNFSF14/LIGHT в плазме крови у пациентов с ожирением, в сравнении с контролем [Bassols J. et al., 2010]. Вышесказанное коррелирует с нашими данными, где у больных НАЖБП с ожирением без СД 2 типа уровень sTNFSF14/LIGHT в крови повышался относительно контроля и больных НАЖБП с СД 2 типа (Рисунок 5А). У последних уровень sTNFSF14/LIGHT, напротив, был ниже, чем в контроле и у больных НАЖБП без СД 2 типа (Рисунок 5А). У всех пациентов с НАЖБП с ожирением уровень sTNFSF14/LIGHT в крови отрицательно коррелировал с концентрациями инсулина (r=0,41, p<0,05) и HOMA-IR (r=0,65, p<0,05), а также с содержанием глюкозы (r=-0,41, p<0,05). В исследовании Y. Kou и др. (2018) было показано, что TNFSF14/LIGHT связывается с рецептором LTβR на преадипоцитах, и, далее, может напрямую блокировать MAPK и активацию JNK [Kou Y. et al., 2019]. Таким образом, высокий уровень sTNFSF14/LIGHT в крови способен поддерживать взаимодействие инсулина со своим рецептором через блокирование JNK в печени у больных НАЖБП без СД 2 типа (Рисунок 6). У всех больных НАЖБП была выявлена взаимосвязь содержания sTNFSF14/LIGHT в крови с уровнем экспрессии гена MT- ND4 в печени (r=0,28, p<0,05). Мы предполагаем, что содержание sTNFSF14/LIGHT в крови может оказывать влияние на биогенез митохондрий в клетках печени, через воздействие на уровень экспрессии гена MT-ND4. Выявлена отрицательная взаимосвязь между концентрацией sTNFSF14/LIGHT в крови и уровнем экспрессии 17 гена DMN1L (r=-0,35, p<0,05) в печени у всех пациентов с НАЖБП без СД 2 типа. Так, у больных НАЖБП без СД 2 типа sTNFSF14/LIGHT может вносить вклад в процессы деления митохондрий печени, через поддержание фосфорилирования DRP1 (Рисунок 6). Эффекты sTNFSF14/LIGHT могут быть опосредованы его взаимодействием с другими цитокинами, в частности, IL-6 и IL-10, играющими важную роль патогенезе хронических заболеваний печени. Нами была обнаружена корреляция содержания sTNFSF14/LIGHT с IL-10 в крови у всех больных НАЖБП с ИМТ>40 кг/м2 (r=0,53 и r=0,41, p<0,05, соответственно). Следует отметить, что концентрацияIL-10 в плазме крови у больных НАЖБП без СД 2 типа была значительно выше контроля и значений больных СД 2 типа (Рисунок 5Г). Выявлено, что IL-10 способствует подавлению воспаления, ингибируя синтез и действие провоспалительных цитокинов, в том числе TNF-α, IL-1β и IL-6, а также снижая активацию макрофагов [Zahran W. E. et al., 2013]. У пациентов с НАЖБП без СД 2 типа (ИМТ>40 кг/м2) и больных СД 2 типа (ИМТ<40 кг/м2) была выявлена взаимосвязь между плазменным уровнем IL-10 и уровнем экспрессии гена MT-ND4 в печени (r=-0,51 и r=-0,73, p<0,05, соответственно). Обобщая вышесказанное, снижение содержания sTNFSF14/LIGHT и IL-10 в крови у больных НАЖБП и СД 2 типа может играть критическую роль в прогрессировании осложнений при ожирении (Рисунок 7). Также, в нашемисследовании были выявлены взаимосвязи между концентрацией sTNFSF14/LIGHT в крови и двумя растворимыми рецепторами к IL-6: IL-6Rа и гликопротеином 130 (gp130/sIL6-Rb) в крови у больных НАЖБП с ИМТ>40 кг/м2 (r=0,58 и r=0,57, p<0,05, соответственно) и у больных НАЖБП с СД 2 типа ИМТ<40 кг/м2 (r=0,38 и r=0,40, p<0,05, соответственно; sTNFSF14/LIGHT и IL-6, r=0,42, p<0,05). IL-6 является одним из основных цитокинов хронического субклинического воспаления и является молекулой с разнонаправленным действием. IL-6 способствует развитию ИР и нарушает гомеостаз глюкозы [Bastard J. P. et al., 2000; Sarbijani H. M. et al., 2016]. В проведенном исследовании, у всех больных НАЖБП уровень IL-6 в крови был выше в сравнении с контролем (Рисунок 5Б). Самые низкие значения IL-6 регистрировались у больных НАЖБП с СД 2 типа сИМТ<40 кг/м2. В нашем исследовании была выявлена отрицательная корреляция между уровнем IL-6 и содержанием белка BAX (у всех больных ожирением, r=-0,34) и с уровнем экспрессии гена SOD1 в ткани печени (у больных ожирением с СД 2 типа с ИМТ<40 кг/м2, r=- 0,80). Следовательно, на фоне повышения плазменного уровня IL-6, BAX- опосредованная клеточная гибель гепатоцитов снижается, однако супероксиддисмутаза не подавляет развитие стеатогепатита у пациентов с СД 2 типа. В нашей работе у больных НАЖБП с СД 2 типа с ИМТ>40 кг/м2 было выявлено снижение экспрессии гена DMN1L и содержания белка DRP-1 в печени, а также IL-6, sIL-6Ra и gp130/sIL-6Rb в крови. Вышесказанное может свидетельствовать о влиянии низких концентраций IL-6 и его растворимых рецепторов на развитие дисфункции митохондрий печени у больных НАЖБП с СД 2 типа (Рисунок 7). Все цитокины семейства IL-6 (кроме IL-31) используют мембранный гликопротеин gp130 в качестве рецептора и последующего сигналинга [Scheller J. et al., 2011]. Существует два пути активации сигналов от IL-6: классический и транс-сигналинг [Rose-John S. et al., 2018]. Противовоспалительные и регенеративные свойства IL-6 опосредуются классическим сигнальным путем, в то время как провоспалительные реакции во многих патологических состояниях включают транс-сигнализацию [Scheller J. et al., 2011]. Плазменный уровень sIL-6Rα повышался у больных НАЖБП без СД 2 типа
относительно контроля и больных с СД 2 типа (Рисунок 5В). Тогда как у больных НАЖБП с СД 2 типа концентрация sIL-6Rα была ниже, чем в контроле (Рисунок 5В).
Рисунок 5 – Изменение содержания цитокинов sLIGHT/TNFSF14 (A), IL-6 (Б), sIL-6Ra (В), IL-10 (Г) и gp130/sIL-6Rb (Д) в крови у исследуемых групп. «*» – статистически значимые различия, p<0,05. Нами установлено, что плазменный уровень gp130/sIL6-Rb был выше (относительно контроля) у больных НАЖБП без СД 2 типа и, напротив, ниже у больных НАЖБП с СД 2 типа (Рисунок 5Д). Учитывая, что у больных НАЖБП без СД 2 типа уровень gp130/sIL6-Rb в плазме крови повышен относительно других групп (Рисунок 5Д), мы предполагаем, что происходит ингибирование транс- сигналинга и активация классической передачи сигналов IL-6, что оказывает протекторный эффект на гепатоциты (Рисунок 6). У больных НАЖБП с СД 2 типа уровень плазменного gp130/sIL-6Rb был ниже по сравнению с больными НАЖБП без СД 2 типа и группой контроля, что свидетельствует о преобладании транс-сигналинга. В подтверждение, у больных НАЖБП с СД 2 типа была найдена взаимосвязь между увеличением количества лимфоцитов в печени и уменьшением плазменных уровней gp130/sIL-6Rb и sIL-6Ra (r=-0,33 и r=-0,29, p<0,05, соответственно). У больных НАЖБП с СД 2 типа с ИМТ>40 кг/м2 площадь жировых включений была взаимосвязана с содержанием IL-6 (r=0,38, p<0,05), gp130/sIL-6Rb (r=0,55, p<0,05) и sIL-6Ra (r=0,63, p<0,05) в крови. Также у больных НАЖБП с СД 2 типа / без него с ИМТ<40 кг/м2 были выявлены взаимосвязи между плазменными цитокинами gp130/sIL-6Rb и IL-10 (r=0,79 и r=0,62, p<0,05, соответственно) (Рисунок 7). 19 ЗАКЛЮЧЕНИЕ В данной работе изучены общие закономерности и особенности структурно- функциональных нарушений митохондрий в патогенезе НАЖБП, ассоциированной с ожирением и сахарным диабетом 2 типа и без него (Рисунки 6, 7). Выявлено, что у больных НАЖБП без СД 2 типа с ИМТ>40 кг/м2, низкая лимфоцитарная инфильтрация в печени ассоциирована с ростом содержания белка NF-κβ/p65, на фоне низкого уровня экспрессии гена NF-κβ1, что может свидетельствовать о возможных протекторных функциях неканонического пути NF-κβ (Рисунок 6). У всех больных НАЖБП при увеличении ИМТ>40 кг/м2 регистрируется снижение уровня экспрессии генов SOD1 и BAX в гепатоцитах (Рисунок 6, 7). При ожирении у всех больных НАЖБП в клетках печени увеличивается экспрессия гена MT-ND4, что связано с избыточным поступлением СЖК в гепатоциты, на фоне низких значений числа копий мтДНК (относительно контроля). У больных НАЖБП с СД 2 типа с ИМТ<40 кг/м2 выявлено снижение экспрессии гена DMN1L и белка DRP1 (Рисунок 7), ответственных за деление митохондрий. Все вышеперечисленные факторы позволяют говорить о критическом разобщении биогенеза и динамики митохондрий при НАЖБП. Выявлено, что у больных ожирением без СД 2 типа IL-6 оказывает протекторное действие посредством классического сигнального пути, за счет образования комплексов gp130/IL-6Ra/IL-6 (Рисунок 6). Активация путей передачи сигналов JAK/STAT, ERK и PI3K посредством sIL-6 может приводить к фосфорилированию белка DRP1, поддерживая, тем самым, компенсаторное деление митохондрий в условиях избыточного поступления СЖК. Вклад в поддержание митохондриального гомеостаза у больных НАЖБП с ожирением без СД 2 типа вносит также высокий уровень IL-10, который запускает p38MAPK, опосредуя фосфорилирование DRP1. Кроме того, выявленный у данной категории пациентов высокий уровень sTNFSF14/LIGHT в крови влияет на функции митохондрий через экспрессию MT-ND4 и DNM1L. В целом, факторы: высокое содержание IL-10 и sTNFSF14/LIGHT в крови, а также активация классического пути передачи сигналов IL-6, поддерживают биогенез митохондрий.При развитии СД 2 типау больных НАЖБП низкие уровни исследуемых цитокинов в крови: sTNFSF14/LIGHT, IL-10, IL- 6, gp130/sIL-6Rb, sIL-6Ra ассоциированы с прогрессированием стеатоза и стеатогепатита в печени (Рисунок 7). Снижение концентрации IL-6 и его растворимых рецепторов (gp130/sIL-6Rb и sIL-6Ra), в свою очередь, приводит к активации транс- сигналинга, опосредующего активацию провоспалительных реакций, усугубляющих течение стеатоза и воспаление печени (Рисунок 7). Таким образом, для больных НАЖБП без СД 2 типа характерна активация протекторных механизмов, таких как: переключение на неканонический путь NF-κβ, активация классического сигналинга IL-6, высокая продукция IL-10 и sTNFSF14/LIGHT (Рисунок 6). При развитии СД 2 типа перечисленные выше защитные механизмы снижены/угнетены, что связано c изменением динамики митохондрий в сторону снижения деления. Так, высокие значения площади стеатоза и инфильтрация лимфоцитами в печени связаны с развитием толерантности к глюкозе (Рисунок 7). В связи с тем, что митохондриальные процессы зависят от плазменных факторов, регуляция их содержания может быть способом предотвращения развития патологических реакций при ожирении. Рисунок 6 - Схема, отражающая роль структурно-функциональных нарушений митохондрий клеток печени в механизмах формирования неалкогольной жировой болезни печени у больных ожирением без сахарного диабета 2 типа. Черным обозначены стрелки, отражающие результаты работы, синим контуром - данные литературы. Рисунок 7 - Схема, отражающая роль структурно-функциональных нарушений митохондрий клеток печени в механизмах формирования неалкогольной жировой болезни печени у больных ожирением с сахарным диабетом 2 типа. Черным обозначены стрелки, отражающие результаты работы, синим контуром - данные литературы. ВЫВОДЫ 1. У больных неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП) с ожирением и сахарным диабетом (СД) 2 типа высокая экспрессия гена MT-ND4 (кодирует комплекс I дыхательной цепи), низкая экспрессия гена DNM1L (кодирует деление митохондрий) и гипопродукция белка DRP1, наряду с уменьшением числа копий мтДНК в ткани печени, сочетаются с увеличением площади стеатоза в гепатоцитах. 2. У больных НАЖБП с индексом массы тела (ИМТ) более 40 кг/м2 независимо от наличия СД 2 типа увеличение площади стеатоза в гепатоцитах коррелирует с низким уровнем экспрессии генов SOD1 и BAX в ткани печени. 3. У больных НАЖБП с ожирением без СД 2 типа показатели площади стеатоза и лимфоцитарной инфильтрации коррелируют с высоким содержанием белка NF- κβ/p65 и низкой экспрессией генов NF-κβ1 и BAX в печени и менее выражены, чем у больных СД 2 типа. 4. Высокое содержание плазменных факторов gp130/sIL-6Rb, IL-6, IL-6RA, sTNFSF14/LIGHT и IL-10 в крови у больных НАЖБП без СД 2 типа ассоциировано с экспрессией гена DNM1L и содержанием белка DRP1, обеспечивающими процесс деления митохондрий. 5. У больных НАЖБП с ожирением и СД 2 типа низкая концентрация sTNFSF14/LIGHT в крови (по сравнению с таковой у группы контроля и больных НАЖБП без СД 2 типа) сочетается со снижением экспрессии гена DMN1L (кодирует деление митохондрий) и увеличением экспрессии гена MT-ND4 (кодирует комплекс I дыхательной цепи митохондрий) в ткани печени. 6. У больных ожирением нарушения структурно-функционального состояния митохондрий в клетках печени, проявляющиеся снижением экспрессии гена антиоксидантной защиты (SOD1), гена деления митохондрий (DMN1L) и копийности мтДНК в печени, увеличением экспрессии гена комплекса I дыхательной цепи (MT- ND4), а также низкое содержание плазменных факторов gp130/sIL-6Rb, IL-6, IL-6RA, sTNFSF14/LIGHT и IL-10 играют негативную роль в патогенезе НАЖБП, ассоциированной с СД 2 типа.