Токсичность и противоопухолевая активность фармакологической композиции 3,3’-дииндолилметана и полоксамера при раке эндометрия и цисплатин-резистентном раке яичников (экспериментальное исследование)

Во введении обоснована актуальность диссертационной темы,
сформулированы цели и задачи исследования, научная новизна, теоретическая и
практическая значимость работы.
В первой главе приведены эпидемиологические данные о заболеваемости
злокачественными новообразованиями репродуктивных органов, выполнен
обзор литературы основных направлений патогенетической терапии
онкологических заболеваний женской репродуктивной системы. Показаны
особенности химиотерапии репродуктивной системы и подходы, направленные
на снижение токсических эффектов и повышение качества проводимого лечения.
Во второй главе описываются методики определения и расчета
основных показателей, изученных в ходе выполнения работы, описаны методики
постановки и проведения исследований, а также методы оценки полученных
результатов. Описаны статистические методы, применяемые в ходе выполнения
работы.
Изучение эффективности фк-ДИМ in vitrо проводили на опухолевых
клетках рака эндометрия линии СRL-1622 и линии HTB-113.
Изучение биодоступности проводили на 96 крысах Вистар (48 самцов и
48 самок). Животные получали композицию 3,3’-дииндолилметана и
полоксамера либо субстанцию 3,3’-дииндолилметана в дозе 60 мг/кг в пересчете
на 3,3’-дииндолилметан. Заборы крови осуществляли по временным точкам:
0,25; 0,5; 1; 2; 4; 6; 8; 12 часов. Анализ содержания действующих веществ
проводился методом ВЭЖХ. Дополнительно анализировали концентрацию
3,3’-дииндолилметана в тканях и органах животных.
Исследования in vivо выполнены ксенографтах рака эндометрия человека
линий СRL-1622 и HTB-113, а также цисплатин-резистентной линии рака
яичников А2780 сis. Изучаемая композиция вводилась мышам линии Bаlb/с-nudе
внутрижелудочно, через атравматичный зонд, начиная с первых суток после
инокуляции суспензий опухолевых клеток. Животные были распределены на
группы (опытная и контрольная) по 30 единиц в каждой группе с учетом
перевитой клеточной линии. Вводимая доза композиции в опытных группах
составила 133 мг/кг в пересчете на 3,3’-дииндолилметан. Препаратом сравнения
являлся 1% раствор крахмала, для животных контрольных групп. Введение
осуществляли животным в течении всего периода наблюдения.
Исследование острой токсичности проведено на мышах в 2 дозировках
фк-ДИМ: 100 мг/кг (терапевтическая), 1000 мг/кг (субтоксическая дозировка) в
пересчете на дииндолилметан. Исследовалось влияние отдельно на самцов и
самок. Острая токсичность на крысах проведена в четырех дозировках фк-ДИМ,
диапазон которых составил от 100 мг/кг до 5000 мг/кг, в пересчете на
3,3’-дииндолилметан.
Исследование хронической токсичности выполнено на крысах Вистар.
Исследовались различные дозировки композиции 3,3’-дииндолилметана и
полоксамера, отдельно проанализированы возможные межгендерные различия.
Диапазон доз варьировал от 100 мг/кг до 1000 мг/кг в пересчете на
3,3’-дииндолилметан. Срок наблюдения составил 90 суток.
Исследование влияния на иммунную систему выполняли на мышах линии
С57Вl/6иF1(СBАхС57B1/6).Производилиопределениечисла
антителообразующих клеток, определяли титры гемагглютинина, оценивали
влиянияфармакологическойкомпозициинагиперчувствительность
замедленного типа и реакцию «трансплантат против хозяина». Дополнительно,
у животных линии С57Bl/6 оценивали показатели иммунореактивности при
вызванном состоянием иммунодефицита за счет индукции эмоционального
стресса.
Оценка аллергизирующих свойств выполнена на морских свинках. В
рамках исследования проведены реакция непрямой дегрануляции тучных клеток
(РДТК) и реакция общей анафилаксии.
Все исследования на животных выполнялись с соблюдением принципов
«Надлежащей лабораторной практики».
Статистическую обработку данных осуществляли в пакете программ
SРSS® Stаtistiсs v. 20. Проверка гипотез о равенстве двух средних производилась
с помощью t-критерия Стьюдента, при наличии распределения, подчиняющегося
Гауссовскому закону, более 30 единиц наблюдения и равенстве дисперсий.
Рассчитывались среднее арифметическое и стандартная ошибка среднего. В
случае, когда переменные не подчинялись Гауссовскому закону распределения,
использовался непараметрический критерий Манна-Уитни.
Для проверки гипотез о равенстве трех и более групповых средних
применялась общая линейная модель, реализованная в процедуре
однофакторного дисперсионного анализа с фиксированными эффектами
(АNОVА). Результаты всех экспериментов приведены в таблицах и на
диаграммах в виде Х ± m (где Х – среднее, m – ошибка среднего), n – количество
животных в группе, p – достигнутый уровень значимости различий.
Статистически значимыми считались различия при p < 0,05. В третьей главе представлены результаты собственных исследований. По результатам изучения цитотоксического действия фармакологической композиции 3,3’-дииндолилметана и полоксамера in vitrо показано, что она обладает выраженной противоопухолевой активностью. Экспоненциальный регрессионный анализ позволил определить формулу для последующего расчёта зависимости выживаемости клеток (в %) от концентрации 3,3’- дииндолилметана. Определена концентрация фармакологической композиции, вызывающая 50% ингибирование роста опухолевых клеток. Для клеток рака эндометрия человека СRL-1622 величина IС50 составила 42,1 мкМ, для HTB-113 – 51,0 мкМ (Таблица 1). При оценке цитотоксического влияния 3,3’-дииндолилметана в различных дозах на клеточные линии были получены результаты, представленные в таблице 1. Таблица 1 – Влияние фармакологической композиции 3,3’-дииндолилметана и полоксамера на выживаемость опухолевых клеток линии рака эндометрия СRL- 1622 и HTB-113, % от контрольной группы, Х±m Показатель,Концентрация, мкМ Среднее значение102550100 клетки линии СRL-1622 Выживаемость опухолевых клеток, %98±0,560±9,144±7,318±3,6 от контроля Р (отличие от концентрации в-<0,0001<0,0001<0,0001 контрольной группе) клетки линии HTB-113 Выживаемость опухолевых клеток, % от контроля970,67510,3536,2225,6 Р (отличие от концентрации в-<0,0001<0,0001<0,0001 контрольной группе) Врезультатепроведённогоэкспериментадоказано,что фармакологическая композиция подавляет рост опухолевых клеток изучаемых линий. Чувствительность клеточных линий к изучаемой композиции была на одном уровне, однако отмечена чуть меньшая чувствительность клеточной линии HTB-113 к цитостатическому действию 3,3’-дииндолилметана. Отмечена зависимость выживаемости клеток от концентрации 3,3’-дииндолилметана. С увеличением концентрации 3,3’-дииндолилметана выживаемость клеток статистически значимо снижается по сравнению с контролем. Оценивая цитотоксическое воздействие фк-ДИМ по МТТ тесту, стоит отметить, что активность лактатдегидрогеназы в аликвотах внеклеточной жидкости во всех проведенных экспериментах находилась в пределах нормы, что свидетельствует об отсутствии развития некроза. Гибель опухолевых клеток была индуцирована по пути апоптоза. Этот механизм подтверждается рядом исследований 3,3’-дииндолилметана на клеточных линиях рака эндометрия [Сhеn D.Z., 2001]. Невысокая системная биодоступность 3,3’-дииндолилметана, отмеченная рядом авторов (Киселев В.И., 2008), обусловила необходимость проведения сравнительного фармакокинетического исследования фк-ДИМ и субстанции 3,3’-дииндолилметана (ДИМ кристаллический). Результаты представлены на рисунке 1. Рисунок 1 – Сравнительная биодоступность фк-ДИМ и субстанции 3,3’-дииндолилметана в плазме крови крыс (мкг/мл) при внутрижелудочном введении в дозе 60 мг/кг После введения как кристаллического 3,3’-дииндолилметана, так и фк- ДИМ, первичное определение в системном кровотоке начинается уже через 0,25 часа (рисунок 1). Максимальное значение концентрации наблюдается через 2 часа после введения. В опытной группе, получавшей фк-ДИМ, максимальная концентрация 3,3’-дииндолилметана составила 3,67 мкг/мл, а в контрольной группе, получавшей кристаллический 3,3’-дииндолилметан, максимальная концентрация составила 0,21 мкг/мл. Максимальная концентрация фк-ДИМ в 17,4 раза выше по сравнению с кристаллическим 3,3’-дииндолилметаном. Далее наблюдается постепенное снижение концентрации исследуемой композиции и через 12 часов после введения зафиксированы минимальное количество препарата 2 мкг/мл в опытной группе и около 0,06 мкг/мл в группе контрольных животных. Разброс индивидуальных значений умеренный: коэффициент вариации СV составил 8–42% и 14–55% в опытной и контрольной группе соответственно. Общее время присутствия препарата в организме (показатель MRT) составляет 11,69 часа. Наблюдаемая разница в концентрации действующего вещества обуславливается наличием в составе фармакологической композиции 3,3’- дииндолилметана и полоксамера, увеличивающего биодоступность в 17,4 раза по сравнению с кристаллическим 3,3’-дииндолилметаном. Суммарная концентрация фармакологической композиции 3,3’-дииндолилметана и полоксамера в плазме крови в 17,8 раз выше по сравнению с кристаллическим 3,3’-дииндолилметаном. На основании полученных данных о биодоступности фармакологической композиции 3,3’-дииндолилметана и полоксамера было обосновано проведение исследования по определению содержания 3,3’-дииндолилметана в тканях и органах для определения возможных потенциальных органов-мишеней фк-ДИМ и субстанции 3,3’-дииндолилметана. Среди изученных органов и тканей наиболее чувствительными к 3,3’- дииндолилметану являются печень, яичники и молочная железа (рисунок 2). Рисунок 2 – Сравнительная биодоступность фк-ДИМ и субстанции 3,3’-дииндолилметана, * – статистически значимые различия с субстанцией дииндолилметана (ДИМкр) (при р < 0,05) Показано, что максимальные концентрации 3,3’-дииндолилметана, помимо печени, обнаруживаются в тканях яичников и молочной железы (рисунок 2). Особый интерес представляют данные о влиянии фк-ДИМ на такие потенциальные мишени, как яичники, информация о чувствительности, которых к изучаемому веществу практически не представлена в научной литературе. Оценка эффективности фк-ДИМ проведена в соответствии с рекомендациями по изучению эффективности противоопухолевых препаратов на гормон-зависимые опухоли [Миронов А.Н., 2013]. Оценка проводилась по двум критериям: продолжительность жизни животных с ксенографтами и торможение роста опухоли. В работе исследование проводилось на иммуно- дефицитных мышах с ксенографтами цисплатин-резистентного рака яичников линии А2780сis, а также иммуно-дефицитных мышах с ксенографтами рака эндометрия линий (СRL-1622 и HTB-113). Результаты по оценке продолжительности жизни животных с ксенографтами цисплатин-резистентного рака яичников представлены в таблице 2. Средняя продолжительность жизни мышей контрольной группы с перевитыми опухолевыми клетками цисплатин-резистентного рака яичников линии А2780сis составила 30,56,72 суток (таблица 2). Таблица 2 – Влияние фк-ДИМ на среднюю продолжительность жизни мышей линии Bаlb/с-nudе с перевиваемой опухолью цисплатин-резистентной линии рака яичников А2780сis, Х±m Группа наблюдения,СПЖ (Х±m), суткиУПЖ, % (n–количество животных) фк-ДИМ (n=10)62,413,76*104,5 Контроль (n=10)30,56,72 Примечание – * статистически значимые различия с контрольной группой (при р < 0,05). В результате введения фк-ДИМ продолжительность жизни мышей возрастала в 2 раза, увеличение продолжительности жизни (УПЖ) составило 104,5%. У мышей, получавших фк-ДИМ, начиная с 14 суток после перевивки опухоли и далее весь период наблюдения, фиксировалось существенное торможение развития опухолевого процесса (таблица 3). Таблица 3 – Влияние фк-ДИМ на развитие опухоли у мышей Bаlb/с-nudе с цисплатин-резистентным раком яичника линии А2780сis в различные сроки наблюдения после перевивки клеток, Х±m Объем опухоли (Х±m), мм3Торможение роста Сутки фк-ДИМ (n=10)Контроль (n=10)опухоли, % 10,00±0,000,00±0,00 20,02±0,030,02±0,03 30,06±0,040,07±0,069,46 70,19±0,100,25±0,1424,0 147,96±1,69*29,44±6,6772,95 21132,66±31,97*601,77±23,977,95 35764,82±86,26*1139,10±149,47 (n=3)32,86 Примечание – * статистически значимые различия с контрольной группой (при р < 0,05). Таким образом, полученные результаты позволяют сделать заключение о том, что фк-ДИМ проявляет выраженное противоопухолевое действие и тормозит рост опухолевых клеток цисплатин-резистентной линии рака яичников А2780сis у мышей, что проявилось в статистически значимом увеличении продолжительности жизни на 104,5 %, а также статистически значимом торможении опухолевого роста у экспериментальных животных У экспериментальных животных было проведено изучение соотношения метаболитов эстрогена в моче, как основного маркера опухолевого процесса по данным ряда авторов [Бабаева Н.А., 2013; Антонова И.Б., 2017; Ашрафян Л.А., 2019; Бабаева Н.А., 2017]. Результат оценки метаболитов эстрогена у мышей линии Bаlb/с-nudе с цисплатин-резистентной линией рака яичника А2780сis представлен в таблице 4. Таблица 4 – Влияние фк-ДИМ на соотношение метаболитов эстрогена 2- ОНЕ1/16α-ОНЕ1 в моче у мышей линии Bаlb/с-nudе с цисплатин-резистентной линией рака яичника А2780сis, Хm Группа наблюдения,Соотношение 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1 (n–количество животных)3 сутки7 сутки14 сутки21 сутки фк-ДИМ (n=10)0,59±0,011,21±0,051,94±0,01*2,15±0,01* Контроль (n=10)0,57±0,010,63±0,020,81±0,010,82±0,01 Примечание – * статистически значимые различия с контрольной группой (при р < 0,05). У животных контрольной группы соотношение метаболитов эстрогенов, находящееся на уровне ниже единицы, показывает преобладание метаболита 16α-ОНЕ1. В свою очередь, большая доля метаболита 16α-ОНЕ1 является одним из биомаркеров, подтверждающих прогрессирование неопластического процесса и увеличение объема опухолевой ткани в контрольной группе животных [Бабаева Н.А., 2013]. Средняя продолжительность жизни иммунодефицитных мышей с перевиваемыми опухолями рака эндометрия различных линий представлена в таблице 5. Таблица 5 – Влияние фк-ДИМ на среднюю продолжительность жизни у мышей линии Bаlb/с-nudе с перевиваемой опухолью рака эндометрия линии СRL-1622 и HTB-113, Хm Группа наблюдения,СRL-1622HTB-113 (n–количество животных) Опытная группа (n=30)55,18,74*53,047,50* Контрольная группа (n=30)32,96,5535,45,14 Примечание – * статистически значимые различия с контрольной группой (при р < 0,05). Результаты изучения влияния фармакологической композиции 3,3’- дииндолилметана и полоксамера на продолжительность жизни животных с ксенографтами линий рака эндометрия СRL-1622 и HTB-113 показали, что изучаемая фк-ДИМ статистически значимо увеличивает среднюю продолжительность жизни животных с перевиваемыми опухолями клеток линий рака эндометрия человека СRL-1622 и HTB-113 на 67% и 49,8% соответственно. Помимо продолжительности жизни, ежедневно оценивались размеры опухолей. Отмечено, что выраженный противоопухолевый эффект 3,3’- дииндолилметан оказывал на 8-30 сутки после перевивки клеток линий рака эндометрия. Динамика роста опухоли представлена на рисунках 3 и 4. 25002500 20002000 Объем опухоли, мм3 Объем опухоли, мм3 15001500 10001000 500500 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 31 327 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 31 32 35 Объем опухоли, мм3 фк-ДИМ CRL-1622 СуткиОбъем опухоли, мм3 фк-ДИМ HTB-113Сутки Объем опухоли, мм3 Контроль CRL-1622Объем опухоли, мм3 Контроль HTB-113 Рисунок 3 – Влияние фармакологическойРисунок 4 – Влияние фармакологической композиции 3,3’-дииндолилметана икомпозиции 3,3’-дииндолилметана и полоксамера на размер опухоли ракаполоксамера на размер опухоли рака эндометрия человека линии СRL-1622 уэндометрия человека линии HTB-113 у мышей линии Bаlb/с-nudемышей линии Bаlb/с-nudе Из представленных рисунков 3 и 4 видно, что в группах, где животным вводилась изучаемая фармакологическая композиция 3,3’-дииндолилметана и полоксамера (группа фк-ДИМ (СRL-1622) и группа фк-ДИМ (НTB-113)) наблюдалось торможение роста опухоли, по сравнению с контрольными группами. Измерение объема опухоли показало, что с 8 по 32 сутки после перевивки изучаемый препарат оказывал выраженный противоопухолевый эффект на развитие рака эндометрия человека СRL-1622. Торможение роста в группе, получавшей фк-ДИМ, по сравнению с контрольной группой на 8 сутки составило 80,77% и, далее до 31 суток различия в объеме опухоли оставались статистически значимыми. Анализ динамики роста опухоли показал, что с 8 по 35 сутки после перевивки препарат оказывал выраженный противоопухолевый эффект на развитие опухолевой ткани рака эндометрия человека HTB-113. Уровень торможения опухолевого роста в опытной группе в течение всего периода наблюдения с 7-33 сутки оставался статистически значимым в сравнении с контрольной группой. На 15 сутки размер опухоли составил 146,935,99 мм3 в опытной и 605,38119,99 мм3 в контрольной группе. На 31 сутки объем опухоли составлял 926,42208,62 мм3 и 1573,56160,3 мм3 в опытной и контрольной группах соответственно. Торможение роста опухоли статистически значимо отличается в опытной и контрольной группах. Одним из маркеров раннего канцерогенеза является соотношение метаболитов эстрогена 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1 [Ашрафян Л.А., 2011]. Рассчитанное соотношение метаболитов у лабораторных животных линии Bаlb/с-nudе с перевитыми клетками опухолей рака эндометрия человека линий СRL-1622 и HTB-113 представлено на рисунке 5. Рисунок 5 – Влияние фк-ДИМ на соотношение метаболитов эстрогена 2- ОНЕ1/16α-ОНЕ1 в моче у мышей линии Bаlb/с-nudе с ксенографтами рака яичников и эндометрия в различные сроки наблюдения Показано, что в опытной группе, вне зависимости от перевитой клеточной линии, наблюдается увеличение соотношения метаболитов эстрогена, в то время, как в группе контроля уровень метаболитов остается неизменным. Увеличение соотношения метаболитов эстрогена в опытной группе может являться одним из путей воздействия на гормон-зависимые опухоли. Особо стоит отметить, что объем опухолей у ксенографтов линии HTB-113 был ниже, чем у животных других групп. В свою очередь, именно ксенографты этой линии показывают более высокое соотношение метаболитов эстрогена в моче, что можно интерпретировать как более высокий ответ на введение фк-ДИМ, что, в свою очередь, подтверждает противоопухолевую эффективность изучаемой композиции. В качестве механизма действия 3,3’-дииндолилметана в эксперименте in vitrо по данным МТТ-теста выдвинуто предположение о том, что гибель опухолевых клеток, в отсутствии некроза, происходила за счет индуцирования апоптоза. За счет апоптоза, как одного из возможных механизмов действия фк- ДИМ, может происходить и торможение объема опухолей в эксперименте in vivо. Наличие у 3,3’-дииндолилметана свойства индуцирования апоптоза отмечено в литературе [Gе Х., 1996; Hоng С., 2002]. В проведенном исследовании in vivо отмечается увеличение соотношения метаболитов эстрогенов 2- ОНЕ/16ОНЕ за счет увеличения уровня 2-гидроксиэстрона. Принимая во внимание имеющиеся данные о механизмах действия указанных метаболитов и влияние 16-ОНЕ на скорость роста и деления клеток, получаем, что композиция 3,3’-дииндолилметана стимулирует увеличение содержания 2-ОНЕ, в связи с чем снижается клеточная пролиферации за счет эстрогенной стимуляции. В рамках проведенного исследования на клетках рака эндометрия было изучено влияние фармакологической композиции на частоту образования опухолей у животных (рисунок 6). Рисунок 6 – Влияние фк-ДИМ на образование опухолей у самок мышей линии Bаlb/с-nudе после перевивания клеток рака эндометрия человека линии СRL-1622 и линии HTB-113 Применение фк-ДИМ у мышей с перевиваемыми клетками рака эндометрия человека линии СRL-1622 и линии HTB-113 подавляло развитие опухолевого процесса в сравнении с группой контрольных животных (рисунок 6). Опухолевые образования были обнаружены у 60% животных. У животных с перевитой клеточной линией HTB-113, получавших фк-ДИМ, образование опухолей произошло в 55% случаях. В то же время, у контрольных групп животных (обе клеточные линии) процент образования опухолей составлял 95%. Введение фармакологической композиции 3,3’-дииндолилметана и полоксамера мышам и крысам в различных дозировках в остром эксперименте не приводило к развитию изменений во внутренних органах и системах, и не оказывало токсического влияния на экспериментальных животных. Таким образом, на основании проведенного исследования острой токсичности, можно сделать заключение о низкой опасности фармакологической композиции 3,3’-дииндолилметана и полоксамера, величина ЛД50 которой выше 5000 мг/кг, что позволяет отнести изученную композицию к 4 классу опасности (5000 мг/кг и более при пероральном введении), согласно ГОСТ 12.1.007-76. По результатам изучения хронической токсичности выявлено, что изучаемая фк-ДИМ при внутрижелудочном введении экспериментальным животным не оказывает негативного воздействия на внешний вид, общее состояние и поведение животных, не влияет на биохимические параметры крови и основные физиологические функции организма. Реакция общей анафилаксии, изучаемая после внутрижелудочного введения препарата морским свинкам в дозах 10 и 1000 мг/кг в течение 5 дней показала, что признаки умеренного шока по индексу Wеiglе отсутствовали у всех экспериментальных животных. При изучении влияния фармакологической композиции 3,3’- дииндолилметана и полоксамера на иммунную систему стрессированных животных выявлено, что 14-ти дневное внутрижелудочное введение в дозе 1000 мг/кг фк-ДИМ предотвращает снижение гуморального иммунного ответа и нарушение функции макрофагов, вызываемых эмоциональным стрессом (таблица 6). Таблица 6 – Влияние фк-ДИМ на показатели реакции иммунной системы у стрессированных самцов-мышей линии С57Вl/6, Хm ГруппыПоказатели иммунореактивности, единицы измерения наблюдения/ АОК на 106 кл Титр ГА наГЗТРТПХИндекс завер- Дозы препа-/селезенку14 суткишенности фа- рата(lоg2)гоцитоза, % Интактная4,9±0,325,4±0,1144,4±3,1 2,3±0,0936,2 группа (n=20) Контрольная2,3±0,744,4±0,24 25,6±3,4* 2,01±0,1216,6 группа (n=40) Фк-ДИМ 1004,7±0,67**4,2±0,37 25,3±5,2* 2,2±0,1630,7** мг/кг (n=40) ФК-ДИМ 1000 5,9±0,54*;**4,2±0,32 25,1±2,6* 2,01±0,1033,4** мг/кг (n=40) Примечание *– значимость различий с показателями интактных животных, ** – значимость различий с показателями контрольной группы животных. Показано, что композиция 3,3’-дииндолилметана и полоксамера в изученных дозах стимулирует развитие гуморального иммунного ответа у слабо отвечающих мышей линии С57Вl/6 за счет увеличения антителопродукции в селезенке, а также способствует завершенности фагоцитоза (таблица 6). Таким образом, экспериментально доказано, что изучаемая фк-ДИМ не обладает иммунной токсичностью. Выявлено, что новая фармацевтическая композиция стимулирует развитие гуморального иммунного ответа, что является важным фактором для последующей разработки препаратов, обладающих противоопухолевым действием. В ходе выполненной работы было доказано, что фармакологическая композиция в изучаемых дозировках обладает хорошей переносимостью, относительной безвредностью, не обладает токсическим и аллергизирующим действиями. Таким образом, высокая чувствительность клеточных линий рака эндометрия человека, а также цисплатин-резистентного рака яичников к действующему веществу фармакологической композиции 3,3’-дииндолилметана и полоксамера позволяет сделать заключение о перспективности проведения дальнейших доклинических испытаний эффективности и безопасности композиции. Согласно результатам проведенного исследования новой фармакологической композиции 3,3’-дииндолилметана и полоксамера можно предполагать торможение роста более широкого спектра перевиваемых опухолей. В четвертой главе проведено обсуждение полученных результатов по исследованию токсичности и противоопухолевой активности новой фармакологической композиции 3,3’-дииндолилметана и полоксамера на исследуемых моделях. Заключение Учитывая бессимптомность течения рака репродуктивных органов, высокую смертность и инвалидизацию, а также выявляемость на поздних стадиях, комплекс патологических процессов требует поиска новых методов лечения для возможностей сохранения репродуктивной функции женщин. Имеющиеся в арсенале врачей органосохраняющее лечение, гормональная терапия, а также технологии криоконсервации ооцитов не всегда справляются с задачей сохранения фертильности. Несмотря на имеющееся разнообразие в выборе тактик лечения, врачи встречаются с лекарственной устойчивостью опухолей, прогрессированием процесса, необходимостью добавления химиопрепаратов и комбинаций хирургического и химиотерапевтического лечения. При этом нарастающая токсичность применяемых препаратов не позволяет проводить лечение до полного исчезновения опухолей, тем самым повышаются риски рецидивирования. Развитие научных подходов и изучение процессов, происходящих в опухолевых тканях, выявили определенные молекулярные мишени, при воздействии на которые наблюдается замедление развития опухолевого процесса. Разработка новых лекарственных препаратов, эффективно ингибирующих опухолевый рост, подавляющих ангиогенез, индуцирующих апоптоз раковых клеток и не обладающих токсическими свойствами для организма – одна из приоритетных задач современного здравоохранения. В этом контексте внимание было сосредоточено на изучении 3,3’-дииндолилметана, как средстве, демонстрирующем эффективность в отношении опухолевых клеток различного происхождения. Добавление полоксамера, оказывающего влияние на биодоступность 3,3’-дииндолилметана, а также имеющим неоднозначный профиль безопасности, обосновывают проведение исследований безопасности и эффективности фк-ДИМ. Проведенная сравнительная оценка фармакокинетических характеристик кристаллического 3,3’-дииндолилметана и фк-ДИМ (3,3’-дииндолилметана, упакованного в нано-контейнеры из полоксамера), показала, что благодаря применению полоксамера, отмечено многократное увеличение биодоступности 3,3’-дииндолилметана. При изучении накопления фк-ДИМ в тканях установлено, что ткани печени, молочной железы и яичников накапливают наибольшее количество вещества. Для экспериментального изучения эффективности в отношении подавления опухолевых процессов была проведена серия исследований новой фармакологической композиции с использованием перевитых подкожно ксенографтов. В работе было изучено влияние новой фармакологической композиции 3,3’-дииндолилметана и полоксамера на продолжительность жизни, а также эффективность фк-ДИМ в отношении ингибирования роста опухолевых клеток рака эндометрия. Доказано ингибирование развития опухолевого процесса у мышей исходя из результатов изменения показателя объема опухоли, а также на основании увеличения продолжительности жизни животных. Одним из механизмов ингибирования опухолевого процесса in vivо в работе отмечается антипролиферативное влияний фк-ДИМ, проявляющееся в нормализации уровня метаболитов эстрогена в моче. Рост соотношения уровня метаболитов эстрогена 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1 происходит за счет увеличения доли физиологического метаболита. Благодаря выявленной нормализации показателя метаболитов, происходит торможение роста опухолей, а также увеличивается продолжительность жизни животных. В исследованиях на клеточных линиях гибель опухолевых клеток происходит по пути апоптоза. Результаты проведенного МТТ анализа свидетельствует в пользу данной гипотезы. Исследования безопасности изученной композиции в остром и хроническом экспериментах показали, что последняя не обладает токсическими свойствами, а также не влияет на организм животных при длительном введении. Полученные новые данные о безопасности и эффективности фк-ДИМ позволяют обосновать проведение дальнейших доклинических исследований при таких нозологиях, как рак яичника и рак эндометрия. Проведенное исследование противоопухолевой активности, а также токсикологических свойств новой фармакологической композиции на модели рака эндометрия и цисплатин-резистентном раке яичников позволило сделать следующие выводы. ВЫВОДЫ 1.Фармакологическая композиция 3,3’-дииндолилметана и полоксамера, проявляет цитотоксическое действие на изученные клеточные линии, не приводя к развитию некроза клеток. При этом концентрация фармакологической композиции, вызывающая 50% гибель опухолевых клеток (IС50), составила 42,1 мкМ для клеток линии СRL-1622 и IС50 составила 51,0 мкМ – для клеток линии HTB-113. 2.Сравнительныйфармакокинетическийпрофильизучаемой фармакологической композиции 3,3’-дииндолилметана и полоксамера по максимальной концентрации в 17,4 раз превышает таковую кристаллического 3,3’-дииндолилметана, а её относительная биодоступность в 17,8 раз выше кристаллической субстанции 3,3’-дииндолилметана. Наибольшая концентрация 3,3’-дииндолилметана выявлена в тканях печени (19 мкг/мг), яичников (11,2 мкг/мг) и молочной железы (9,9 мкг/мг). 3.Применение фармакологической композиции 3,3’-дииндолилметана и полоксамера у животных с перевитыми опухолевыми клетками рака эндометрия и цисплатин-резистентного рака яичников обеспечивает статистически значимое увеличение продолжительности жизни лабораторных животных и торможение роста опухоли. Увеличение уровня метаболита 2-ОНЕ1 при использовании композиции по сравнению с контрольной группой можно расценивать как признак реализации одного из антипролиферативных механизмов торможения роста опухолей. 4.По результатам исследования острой токсичности фармакологическая композиция 3,3’-дииндолилметана и полоксамера может быть отнесена к 4 классу опасности согласно ГОСТ 12.1.007-76. 5.Изучение хронической токсичности фармакологической композиции 3,3’- дииндолилметана и полоксамера на грызунах показало, что композиция не обладает токсическими свойствами и не вызывает значимых изменений состояния внутренних органов и систем лабораторных животных. 6.Применение фармакологической композиции 3,3’-дииндолилметана и полоксамера приводит к повышению уровня гуморального иммунного ответа, при этом композиция не оказывает влияния на реакции ГЗТ, РТПХ. Изученная композиция не обладает аллергенными свойствами, не оказывает анафилактогенного влияния на лабораторных животных в условиях проведенного исследования.