Трансгенерационные изменения при радиочастотном облучении в ювенильный и пубертатный период (на примере беспозвоночного животного Daphnia magna)

Во введении обоснована актуальность темы диссертационной
работы, сформулирована цель и задачи, научная новизна и
практическая значимость исследования.
Глава 1. Обзор литературы. В главе проанализированы
биологическиеэффектынизкоинтенсивного радиочастотного
излучения на ракообразных D. magna и других представителей
беспозвоночных и позвоночных животных. Изучены последствия
облучения в разные периоды онтогенеза, а также биологические
эффекты, обнаруженные в условиях голодания животных.
Глава 2. Материалы и методы исследования. В работе
использована лабораторная установка электромагнитного излучения
(ЭМИ), в которой применен серийный маломощный генератор
высокочастотных сигнала Г4-76А. Создание необходимых уровней
плотности потока энергии (ППЭ) в зоне облучения образцов достигали
за счет использования пирамидальной рупорной антенны, имеющей
узкую диаграмму направленности.
Облучение в низкоинтенсивном радиочастотном (НИ РЧ) поле с
частотой 900 МГц и ППЭ 100 мкВт/см2 проводили с донной стороны
стеклянных стаканов. Время экспозиции составляло пять суток. Доза
облучения в каждый период была одинаковой и суммарно составляла
43,2 Дж/см2.
Параметры облучения в ЭМП и схема эксперимента.
Хроническое облучение родительских особей проводили в
ювенильный и пубертатный периоды онтогенеза, для чего в
соответствии с международными стандартами культивирования D.
magna (OECD, 2012) были подготовлены партеногенетические группы
(табл.1). Животных из последующих поколений не облучали.
Таблица 1. Схема эксперимента
Экспериментальные группыIIIIIIIVVVI
Параметры
Доза облучения, Дж/см2043,243,2043,243,2
Этап онтогенезаю*/ п*
Уровень пищи, %100100100505050
*ю – ювенильный период онтогенеза, п – пубертатный период онтогенеза
Рачков из первой – третьей групп ежедневно кормили суспензией
зеленой водоросли Chlorella vulgaris из расчета 2 мгС/л., рачков из
четвертой – шестой групп ежедневно кормили Ch. vulgaris из расчета 1
мгС/л.
Облучение проводили при температуре 20-21 ºС при естественной
освещенности. В периоды без облучения D. magna содержали в
условиях климатостата. D. magna из групп физиологического контроля
находились в тех же условиях, но без облучения. Пищевой режим в
экспериментальных группах на протяжении всего опыта не менялся.
Облучение D. magna в условиях голодания. Концентрацию корма
готовили согласно (OECD, 2012; Федоров, 1979; Мелехова и др., 2010)
из расчета 2 мгС/л («пища 100 %») и 1 мгС/л («пища 50 %») по формуле
Вс = 178,5 х D665, где Вс – биомасса фитопланктона, мгС/л; 178,5 –
пересчетный коэффициент; D665 – оптическая плотность суспензии Ch.
vulgaris соответствующая длине волны 665 нм, измеренной на
спектрофотометре КФК-3 (Россия) в кювете толщиной 1 см.
Анализ выживаемости и плодовитости проводили согласно
методическим рекомендациям по использованию ракообразных D.
magna в экотоксикологических экспериментах (OECD, 2012).
Наблюдение за выживаемостью и плодовитостью D. magna в
облученном поколении F0 и у необлученного потомства F1 – F3 велось
на ежедневной основе в течение 21 суток в каждом поколении. Для
каждой экспериментальной и контрольной групп в экспериментах
определяли количество животных, выживших к 21 сут, а также
количество новорожденных на самку, число пометов и новорожденных
на помет.
Морфометрические измерения проводили индивидуально у 5, 10-
и 21-суточных D. magna во всех анализируемых поколениях согласно
рекомендациям, приведенным в (Тирас, Сахарова, 1984; Ускалова и др.,
2013). Для фиксирования изображения использовали систему
видеонаблюдения, состоящую из цифровой камеры MYscope 300 M 3
Mpix, USB 2.0 (WEBBERS), вмонтированной в окуляр микроскопа
МБС-10 с выходом на монитор компьютера Pentium IV в программе
ScopePhoto. Обработку видеоизображения осуществляли с помощью
программного обеспечения «Морфометр «Image-Pro». На каждом
зафиксированном изображении измеряли длину тела животного и
хвостового шипа.
Метаболическую активность и соотношения живых и мертвых
клеток у облученных и необлученных D. magna определяли
колориметрическим МТТ-методом (Van Meerloo et al., 2011).
СтатистическийанализГомогенностьвнутри
экспериментальных и контрольных групп оценена с помощью теста
Крускалла-Уоллеса, значимость отличий от контроля количественных
признаков оценивали непараметрическим критерием Манна-Уитни,
качественных признаков – χ2-тестом (Hosmer et al., 2008; Жаворонков,
2011). Для уменьшения ложноположительных результатов проведена
поправка Бонферрони на множественное сравнение (Lehmann, Romano,
2005). Проверка значимости влияния облучения, уровня пищи и их
взаимодействия на изменение биологических показателей выполнена с
применением двухфакторного дисперсионного анализа.
Глава 3. Результаты и их обсуждение
Анализ выживаемости. Из рис. 1А видно, что на 9-е сутки
происходит первый спад выживаемости в выборке, облученной в
ювенильный период. Эти изменения приходятся на период созревания,
характерный для индивидуального развития животных, когда
происходит формирование и развитие эмбрионов (Ebert, 2005). К 15-
суточному возрасту выживаемость животных снижается до 86 % и
остается на этом уровне до 21-суточного возраста.

Рис. 1. Динамика выживаемости D. magna из поколения F0 (А) и F1 (Б)
после хронического радиочастотного облучения в ювенильный (1-5 сут) и
пубертатный (6-10 сут) период онтогенеза

Выживаемость в группе, облученной в период созревания (6 – 10
сут), начинает снижаться на 11 сут после воздействия и к 21-суточному
возрасту рачков составляет 85 %. При попарном сравнении с
применением критерия χ2 значимое снижение выживаемости не
обнаружено. Для пары сравнения «Контроль – «1-5 сут» χ2 = 1,32; P =
0,5; для пары «Контроль – «6-10 сут» χ2 = 0,01; P = 1. Статистический
анализ показал, что облучение родительского поколения в ювенильный
и пубертатный период не привело к изменению выживаемости
необлученного потомства. Анализ литературы показал, что нарушение
выживаемости D. magna не происходит при действии террагерцового
НИ ЭМИ (42,25 ГГц) (Гапочка и др., 2012; Газимагомедова и др., 2018)
и острого низкоинтенсивного лазерного и ультрафиолетового
излучения (Осипова и др., 2011), что согласуется с полученными нами
данными.
Анализ плодовитости. В эксперименте, направленном на анализ
трансгенерационныхрадиационно-индуцированныхэффектов
изменения плодовитости в облученном поколении F0 и в необлученных
поколениях F1, F2 и F3, D. magna начинали производить потомство в
среднем с 9-суточного возраста, что соответствует норме (Ebert, 2005).
Статистический анализ показал, что численность потомства значимо
меньше (р = 5,41 х 10-7) у особей, облучённых в ювенильный период из-
за уменьшения размера пометов (р = 0,0001). Облучение в пубертатный
период не влияет на плодовитость D. magna (р = 0,05). На рис. 2 видно,
что число пометов и новорожденных в помете снижается только при
облучении самок в ювенильный период.

АБ
Рис 2. Среднее количество пометов на самку D. magna (А) и
новорожденных на помет (Б) к 21-м суткам после НИ РЧ облучения с
частотой 900 МГц и ППЭ 100 мкВт/см2 в ювенильный (1-5 сут) или
пубертатный (6-10 сут) период онтогенеза в родительском поколении
(*p <0,05) В табл. 2 приведены результаты двухфакторного дисперсионного анализа, показывающего вклад радиационного фактора в изменение плодовитости в облученном и пострадиационных поколениях. Таблица 2. Двухфакторный дисперсионный анализ радиационно- индуцированного эффекта хронического радиочастотного облучения на изменение плодовитости ракообразных D. magna КоличествоКоличествКоличество Факторыноворожденных наоноворожденных на Daphniaпометовпомет FpFpFp Вся выборка Daphnia, N = 375 Выжившие к концу эксперимента Daphnia, N = 318 Облучение19,03 1,40 х 10-8 3,19 0,0411,09 2,12 х 10-5 Поколение4,540,0040,88 0,459,157,56 х 10-6 Взаимодействие 4,180,00041,07 0,382,270,04 R2 = 0.20R2 = 0.06R2 = 0.19 Известно, что плодовитость является более чувствительным критерием, чем выживаемость. В ювенильный период онтогенеза происходит закладка партеногенетических яиц и активный рост взрослых особей, клетки которых активно делятся. В ряде работ показано, что в этот период организм наиболее подвержен влиянию негативных факторов среды. Обнаружено, что радиочастотное излучение вызывает сильный митотоксический эффект (Песня и др., 2001), значимый в диапазоне 800–930 МГц (Лаврский и др., 2013). Видимо, в ювенильный период жизненного цикла в организме D. magna происходит перераспределение энергии для эффективных обменных процессов взрослого организма, приводящее к снижению уровня подачи энергии на воспроизводство. В более поздние этапы развития, каким является пубертатный период онтогенеза, митотическая активность клеток снижается, и эффекты НИ РЧ излучения уже не оказывают столь заметного влияния на репродуктивную функцию. Подтверждение вышесказанного являются эффекты, обнаруженные нами в пострадиационных поколениях, полученных от хронически облученных в радиочастотном поле родительских особей. В табл. 3 приведены количественные характеристики изменения основных компонентов плодовитости D. magna в необлученных поколениях F1….F3. Таблица 3. Радиационно-индуцированные изменения компонентов общей плодовитости у D. magna в необлученных поколениях F1 – F3 Период облучения ЮвенильныйПубертатный Поколение F1 Количество новорожденных на особь: Контроль 47,8 ± 1,4 M ± SE40,8 ± 2,138,6 ± 3,5 P*0,010,04 Prob†0,00010,0003 Количество пометов: Контроль 3,81 ± 0,07 M ± SE3,66 ± 1,163,35 ± 0,28 P*0,331 Prob†0,0020,04 Количество новорожденных на помет: Контроль 12,63 ± 0,38 M ± SE11,06 ± 0,4011,72 ± 0,90 P*0,00010,032 Prob†0,00010,03 Поколение F2 Количество новорожденных на особь: Контроль 51,6 ± 1,4 M ± SE43,88 ± 2,735,3 ± 1,6 P*0,0040,01 Prob†0,010,03 Количество пометов: Контроль 3,94 ± 0,07 M ± SE3,41 ± 0,193,25 ± 0,28 P*0,060,23 Prob†0,100,09 Количество новорожденных на помет: Контроль 13,05 ± 0,38 M ± SE12,96 ± 0,4511,88 ± 1,04 P*0,161 Prob†0,040,65 Поколение F3 Количество новорожденных на особь: Контроль 50,9 ± 1,4 M ± SE48,05 ± 1,7949,12 ± 3,0 P*0,661 Prob†10,88 Количество пометов: Контроль 3,52 ± 0,07 M ± SE3,8 ± 0,143,41 ± 0,21 P*0,371 Prob†10,97 Количество новорожденных на помет: Контроль 15,11 ± 0,38 M ± SE12,85 ± 0,5214,80 ± 0,74 P*0,160.63 Prob†10,59 * Вероятность теста Крускала-Уоллиса для сравнения с контрольной группой с поправкой Бонферрони. † Вероятность гомогенности всех групп по тесту Крускала-Уоллиса. Анализ морфометрических изменений. Согласно полученным данным, представленным на рис. 3, линейный размер особей D. magna к 10-суточному возрасту был значимо меньше, чем в контрольных группах как после хронического облучения в ювенильный период (p = 0,01), так и после облучения пубертатный период (p=0,03). Рис. 3. Изменение линейных размеров родительских особей D. magna в контрольной группе и после НИ РЧ воздействия с частотой 900 МГц и ППЭ 100 мкВт/см2 в ювенильный (1-5 сут) и пубертатный (6-10 сут) период онтогенеза (*p<0,05) К 21-суточному возрасту животные, облученные в исследуемые периоды онтогенеза, выравнивались по линейным размерам с особями из контрольных групп. Эта тенденция сохранялась в трех необлученных поколениях. Анализ метаболической активности и жизнеспособности клеток. Для анализа механизмов биологического действия хронического НИ РЧ излучения на D. magna была проведен биохимический анализ с помощью МТТ-теста на цитотоксичность (Van Meerloo et al., 2011). МТТ-тест позволяет интегрально оценить активностьсвободнорадикальныхреакций,инактивацию митохондриальных дегидрогеназ, соотношение живых и мертвых клеток и работу системы антиоксидантных ферментов. Проведенный анализ гомогенности измеряемых показателей МТТ- теста в каждой из контрольных групп D. magna родительского и каждого из трех поколений в разных повторах опытов показал отсутствие статистически значимой разницы по тесту Крускала- Уоллиса (0,09 < P < 0,99). Это позволило в дальнейшем использовать объединенныйконтроль.Согласнополученнымданным, представленным на рис. 4, хроническое облучение D. magna в РЧ ЭМП в дозе 43,2 Дж/см2 в ювенильный период приводило к цитотоксическому эффекту, который был обнаружен по снижению ОП в образцах облученных особей (р=1,19·10-14). Рис. 4. Средние показатели МТТ-теста, характеризующие изменение метаболической активности и жизнеспособности D. magna в контрольных и хронически облученных в ювенильный (1-5 сут) и пубертатный (6-10 сут) периоды онтогенеза Хроническое облучение в РЧ ЭМП в пубертатный период приводило к повышению ОП в образцах облученных D. magna (р=1,67·10-5). На графике представлены усредненные значения МТТ- теста, полученные в образцах животных из разных возрастных групп. При этом между эффектами в непосредственно облученном поколении и эффектами, полученными у потомства D. magna, также существуют значимые различия. Дисперсионный анализ позволил выявить высокий вклад облучения в наблюдаемый эффект (табл. 4). Известно, что ЭМП усиливает генерацию активных форм кислорода, которые инициируют процессы перекисного окисления липидов мембран и нарушают внутримембранные потоки энергии, связанные в митохондриях с синтезом АТФ (Гудков и др., 2014; Ragy, 2015; Manta at al., 2014). Окислительные процессы могут приводить к гибели клеток многоклеточного организма, нарушать развитие и рост эмбриона (Merhi, 2012). Видимо, часть клеток погибает, но на жизнеспособности особи это не отражается. Данное предположение основано на результатах нашего исследования. Таблица 4. Двухфакторный дисперсионный анализ вклада хронического радиочастотного облучения и возраста D. magna в изменение метаболической активности и жизнеспособности клеток в родительском и первом необлученном поколении ФакторСуммаdfСреднийFP квадратовквадрат Родительское поколение F0 Облучение0.3010.3015.980.0001 Возраст0.3120.188.270.0004 Взаимодействие0.1920.095.120.007 Первое поколение F1 Облучение0.0310.037.740.007 Возраст0.1520.0819.613.96х10-7 Взаимодействие0.00720.0030.920.40 Снижение выживаемости облученных в разные периоды онтогенеза животных не наблюдали, однако обнаружили, что хроническое облучение D. magna в РЧ ЭМП в ювенильный период приводило к снижению плодовитости. После облучения в мембранах митохондрий под действием супероксиданион радикалов могут развиваться деструктивные процессы, что по разным источником, приводило к снижению уровня ферментативной активности, нарушению морфологических процессов (Мелехова, 2010; Мелехова и др., 2012), а также к сокращению продолжительности жизни дрозофилы (Зайнуллин и др., 2001; Москалев, 2013) и, вероятно, являлось причиной замедления роста D. magna и снижения их плодовитости при хроническом РЧ облучении в ювенильный период онтогенеза. Таким образом, в проведенном исследовании обнаружено, что хроническое облучение в ЭМП с частотой 900 МГц, ППЭ 100 мкВт/см2 в дозе 43,2 Дж/см индуцирует нарушение метаболических процессов у облученных D. magna и у их потомства из поколения F1. Во втором поколении эффект нивелируется. Модификация эффекта облучения при голодании. Согласно полученным данным, облучение D. magna в ЭМП с частотой 900 МГц и ППЭ 100 мкВт/см2 в ювенильный (1-5 сут) и пубертатный (6-10 сут) период в условиях голодания не изменяло выживаемость, однако привело к снижению плодовитости при облучении в ювенильный период (рис. 5). Рис. 5. Плодовитость D. magna к 21-уточному возрасту после хронического НИ РЧ воздействия с частотой 900 МГц и ППЭ 100 мкВт/см2 в ювенильный период (*p <0,05) Дисперсионный анализ показал, что облучение и голодание значимо и независимо изменяют плодовитость D. magna за счет снижения числа новорожденных в пометах. Действие этих факторов при облучении в ювенильный период нарушило плодовитость необлученных поколений F1 и F2. Эффект нивелировался к поколению F3 (рис. 6). Рис. 6. Плодовитость D. magna к 21-суточному возрасту в облучённом поколении F0 и в необлучённом потомстве F1 – F3 при разном уровне пищи Проведенный нами корреляционный анализ позволил обнаружить нарушение корреляции между размером тела и длиной шипа при голодании животных. Различия в коэффициентах корреляции составили: χ2 = 39,88; df=1; P = 2,72х10-10. При голодании D. magna выявлено нарушение корреляции также между возрастом животных и длиной шипа (χ2 = 4,32; df=1; P = 0,04). Согласно полученным данным, различия в коэффициентах корреляции между линейным размером тела и возрастом D. magna в условиях голодания для всей исследуемой выборки составили χ2 = 1,48; df=2; P = 0,48, а между возрастом и длиной шипа – χ2 = 8,28; df=1; P = 0,14. Таким образом, облучение не оказывает достоверного влияния на возрастную динамику морфологических изменений у D. magna, а голодание приводит не только к замедлению роста в целом, но и нарушению роста хвостового выроста. Изменения зрительного анализатора, карапакса, выполняющего функцию опорного и защитного скелета, состояния антенн и другие тератогенные эффекты при исследуемых параметрах облучения не обнаружены. С использованиемДвухфакторнымдисперсионныманализом установлено, что хроническое облучение D. magna в ЭМП вызывает снижение МТТ-показателя, т.е. оказывает на клетки облученных животных цитотоксический эффект. Ограничение пищевых ресурсов снижает резистентность организма, поэтому метаболическая активность клеток не восстанавливается к 21 суткам как происходило при оптимальном пищевом режиме. В главе Заключение обобщены полученные в диссертационном исследовании закономерности формирования биологических эффектов при хроническом радиочастотном облучении в разные периоды онтогенеза. Показано, что облучение в ювенильный период приводит к снижению плодовитости в облученном поколении и сохраняется в первом поколении необлученного потомства. Уменьшение размеров шипа и временное измельчение популяции является показателем негативного влияния облучения на защитную стратегию популяции ракообразных. Тем самым показана биологическая значимость радиочастотного воздействия как фактора окружающей среды, требующего контроля в рамках экологического мониторинга. Репродуктивный процесс восстанавливается к поколению F2. Таким образом, из полученных результатов можно заключить, что при отсутствии повторного облучения в радиочастотном поле, произойдет восстановление жизнеспособности популяции D. magna во втором необлученном поколении. ВЫВОДЫ 1. Хроническое низкоинтенсивное радиочастотное облучение ракообразных D. magna в ювенильный период онтогенеза с частотой 900 МГц, ППЭ 100 мкВт/см2 в дозе 42,3 Дж/см2 не изменяло выживаемость облученного и трех последующих поколений, однако приводило к значимому снижению плодовитости за счет уменьшения размера пометов, т.е. облучению в большей степени подвергались половые клетки животных. 2. Обнаружен цитотоксический эффект хронического ЭМИ с исследуемыми параметрами. Выявлено, что одним из механизмов формирования биологических эффектов является изменение метаболической активности и жизнеспособности клеток в облученном поколении D. magna и у потомства в первом необлученном поколении. 3. Выявлено отставание в росте на ранних этапах жизненного цикла у облученных в разные периоды онтогенеза D. magna и их необлученного потомства. Облучение не влияло на возрастную динамику морфометрических изменений и к 21-суточному возрасту линейные размеры животных возвращались к физиологической норме. Тератогенное действие ЭМИ с исследуемыми параметрами не выявлено. 4. Факторы хронического радиочастотного облучения и недостатка пищи независимо и значимо влияли на снижение плодовитости и нарушение процесса роста в трех поколениях ракообразных D. magna. Выживаемость животных при хроническом радиочастотном облучении в условиях голодания не изменялась. Цитотоксический эффект являлся следствием только облучения. 5. Хроническое низкоинтенсивное радиочастотное облучение ракообразных D. magna в ювенильный период онтогенеза является значимым фактором окружающей среды, требующим контроля в рамках экологического мониторинга. При отсутствии повторного облучения в радиочастотном поле восстановление жизнеспособности популяции D. magna произойдет во втором поколении. Заключение Безопасностьразвитиямобильнойсвязиподразумевает необходимость создания единого подхода для реальной оценки последствий электромагнитного загрязнения для населения и природных сообществ. Обнаруженные в ходе диссертационной работы закономерности и механизмы формирования радиационных эффектов могут быть направлены на разработку технологии интегральной оценки экологической безопасности регионов и городов России. Полученные новые экспериментальные и теоретические данные внесут существенный вклад в решение этой проблемы.