Влияние 1,3-диэтилбензимидазолия трийодида на рост саркомы 45 в легких у крыс

Материал и методы исследования
Экспериментальные исследования проведены на 336 белых нелинейных
крысах, весом 180–220 г разводки вивария ФГБУ «НМИЦ онкологии»
Минздрава России. Работа с животными осуществлялась в соответствии с
правилами «Европейской конвенции о защите животных, используемых в
экспериментах» (Директива 86/609/ЕЕС) и приказом Минздрава России № 267
от 19.06.03 «Об утверждении правил лабораторной практики». Всех крыс
содержали в одинаковых условиях по 5 особей в стандартных пластиковых
клетках при естественном режиме освещения, температуре окружающего
воздуха 22–26°С и свободным доступом к воде и пище.
Моделировализлокачественныйпроцесс,используяперевиваемый
опухолевый штамм саркомы 45 (С45), приобретѐнный в РОНЦ им. Н.Н.
Блохина РАМН (Москва). Штамм опухоли, подвергнутый криоконсервации,
размораживали и поддерживали методом подкожных трансплантаций на белых
беспородных крысах. Материал для перевивки получали от крыс-доноров на
16–17 сутки развития опухолей.
Крыс контрольных и основных групп декапитировали в соответствии с
планом эксперимента. Дизайн исследования представлен на рисунке 1.
Рисунок 1. Дизайн исследования
В течение часа после внутривенной перевивки опухолей крысам основных
группначиналивнутрижелудочноевведение1,3-диэтилбензимидазолия
трийодида по прерывистой схеме: 5 дней – введение, 2 дня – перерыв, в разовой
дозе 0,4 мг/кг, один раз в день в течение 8 недель. Предварительно препарат
разводили в дистиллированной воде объемом 0,5 мл. Крысам контрольных
групп вместо исследуемого препарата вводили воду тем же способом, в том же
объѐме и по той же схеме, что и исследуемый препарат.
Морфологические методы исследования
Дляизученияморфологическихизменений,выделенныепосле
декапитации крыс лѐгкие фиксировали в 10% нейтральном формалине. После
парафиновой проводки блоки резали на микротоме толщиной 2–4 мкм,
окрашивали гематоксилин-эозином и смотрели в проходящем свете при
увеличении 100, 400 и 1000 (масляная иммерсия).
Биохимические методы исследования
Методом РИА определяли уровни ТТГ, свободные и общие формы
трийодтиронина (Т3св и Т3общ) и тироксина (Т4св и Т4общ), прогестерон, 17-
гидроксипрогестерон (17-ОНР), эстрадиол, общую форму тестостерона (Тобщ),
дегидроэпиандростерон сульфат (ДГЭА-S) (стандартные тест-наборы фирмы
Иммунотех, Чехия; анализатор «Ариан», Россия). Методом ИФА определяли
ТGFβ1, sТGFβR2, VEGFА, sVEGFR1, sVEGFR2, IGF1, IGF2, IGFBP1, IGFBP2 и
IGFBP3 (CUSABIO BIOTECH Co., Ltd., Китай).
Статистические методы исследования
Статистическую обработку полученных результатов проводили при
помощи параметрического критерия Стьюдента на персональном компьютере
посредством программы STATISTICA 10.0 и непараметрического критерия
Вилкоксона-Манна-Уитни. Все полученные результаты были проверены на
соответствие закону о нормальном распределении (критерий Шапиро-Уилка).
Результаты исследования
1,3-диэтилбензимидазолиятрийодидпредотвращалразвитие
злокачественного процесса С45 в лѐгком у всех самцов крыс, которые
продолжали жить и спустя 1,5 месяца после прекращения лечения. При
некропсии опухолевые узлы не визуализировались, лѐгкие были не изменены.
Тогда как крысы, не получавшие лечение, погибали в течение 5-6 недель от
выраженной дыхательной недостаточности и кахексии вследствие тотального
поражения лѐгких опухолевым процессом.
Была проанализирована половая специфика действия йодсодержащего
препарата. Обнаружено, что у самцов он предупреждал развитие опухолей в
лѐгких в 100% случаев, тогда как у самок только в 67%.
Одним из важных аспектов патогенеза эктопического роста С45 в легком
у крыс под влиянием 1,3-диэтилбензимидазолия трийодида являлась динамика
структурно-функционального состояния, которая на разных этапах раскрывала
взаимоотношения опухоли и органа-мишени. Казуистическим моментом на
начальном этапе экспериментальной терапии оказалось более раннее (на
неделю) и интенсивное заселение межальвеолярных перегородок опухолевыми
клетками, чем у животных без лечения. Также была установлена половая
спецификавлиянияэкспериментальнойпрофилактическойтерапиина
морфологическом уровне (Таблица 1).
Из таблицы 1 видно, что геморрагическое повреждение ткани легкого и
формирование крупных опухолевых полей было более выражено у самок, хотя
выход опухолевых клеток из кровеносного русла наступал практически
одновременно.
Таблица1–Морфологическиеособенностивлияния1,3-
диэтилбензимидазолия трийодида на эктопический рост С45 в легком у крыс
этапморфологическиеполовая специфика
терапииизменениясамцысамки
геморрагии в лѐгком на фоне
острой редукции кровотока иочаговыеобширные
полнокровия капилляров
массированноезаселение
опухолевымиклеткамичерез 2 неделичерез 1 неделю
межальвеолярных
перегородок
1-2
прорастание тяжей клеток
недели
С45,формированиечерез 2 неделичерез 1 неделю
опухолевыхузловв
паренхиме лѐгкого
деградация
нарушение целостности прорастание опухолей в
бронхоальвеолярных
стенок альвеол, угнетение просветдыхательных
структур,растяжение
сурфактантной системыпутей, дистелектазы
альвеол
генерализованнаяатака
умеренное увеличение,
иммунной системы на
увеличение численности и размещение лимфоцитов
опухолевую ткань,
активности клеточного звена на участках разобщения
активация
иммунной системыкрупныхопухолевых
макрофагально-
конгломераций
гистиоцитарного звена
выраженное разрежение
5разрозненныеочаги
опухолевойткани,
недельопухолевых клеток с
дистрофически
инволюция опухолейпризнакамиснижения
измененные
пролиферативной
непролиферирующие
активности
клетки С45
увеличениеразмеров
компенсациянарушенных гипертрофиястенок
альвеол и альвеолярных
функций в легкомальвеол
ходов
мелкиегруппыи
опухолевые клетки в лѐгком единичные клетки С45 в клетки С45 отсутствуют
виде «теней»
извилистые тяжи эпителия,
8лимфоцитарная
значительное укрепление
неделькомпенсаторные измененияинфильтрация
альвеолярныхстенок,
ткани лѐгкогомежальвеолярных
формированиеновых
перегородок,
капилляров
железистоподобные
структуры

Иными словами, механизмы тканевого гомеостаза на начальном этапе
злокачественного роста в лѐгких менее устойчивы у самок, чем у самцов,
несмотрянаодинаковыеусловиявведения1,3-диэтилбензимидазолия
трийодида. Вместе с тем, у самок наступает более быстрая перестройка
защитных клеточных систем легкого, которые уже через 5 недель оказывают
четкое противоопухолевое влияние, которое через 8 недель приводит к полной
деструкции опухоли. Микрокартина легкого у самцов не демонстрирует
высокой реактивности в отношении остаточных ослабленных опухолевых
клеток,однакопроцессыкомпенсаторноговосстановления
бронхоальвеолярныхструктур,наращиванияпотенциаласурфактантной
системы и дыхательных функций более выражены, чем у самок, где еще
сохраняются участки геморрагических повреждений.
Таким образом, морфологические эффекты противоопухолевого влияния
1,3-диэтилбензимидазолия трийодида свидетельствовали о более высокой
реактивности самок по сравнению с самцами как в отношении повреждающего
влияния опухоли на начальном этапе экспериментальной терапии, так и
скорости компенсации нарушенных легочных структур впоследствии.
Оценив особенности влияния 1,3-диэтилбензимидазолия трийодида на
морфологическом уровне, на следующем этапе мы оценили влияние препарата
на регуляторные системы организма и, прежде всего, гипоталамо-гипофизарно-
тиреоидную систему (рисунок 2).

Рисунок 2. Уровень свободных форм тиреоидных гормонов у крыс через 1 неделю после
внутривенной перевивки клеток саркомы 45 и применения 1,3-диэтилбензимидазолия
трийодида
Установлено, что уже через 1 неделю экспериментальной терапии
регистрировался больший, чем у контрольных крыс уровень тиреоидных
гормонов в организме. В частности, тормозилась редукция свободного
тироксина в щитовидной железе и крови, характерная для развития
злокачественного процесса в лѐгких у крыс без лечения. Причѐм, у самцов и
самок содержание свободного тироксина в щитовидной железе было примерно
одинаковым. Уровень свободного трийодтиронина у крыс основной группы
был выше, по сравнению с крысами без лечения, но либо в щитовидной железе
(у самцов), либо в крови (у самок). Так, у самцов через одну неделю двукратно
возрастала концентрация свободного трийодтиронина в щитовидной железе,
которая была семикратно снижена у крыс без лечения, тогда как в крови
сохранялся интактный уровень гормона. У самок, напротив, двукратно
увеличивалось сывороточное содержание свободного трийодтиронина, при
этом количество гормона в щитовидной железе соответствовало интактному
уровню. В результате, у самцов на фоне лечения количество свободных форм
тиреоидных гормонов в крови не изменялось (без лечения – снижалось), тогда
как у самок – в два раза снижался уровень свободного тироксина (без лечения –
десятикратное уменьшение), и «уравновешивался» в полтора раза бóльшим
уровнем свободного трийодтиронина (без лечения – не изменялся). Иными
словами, уже через неделю применения 1,3-диэтилбензимидазолия трийодида у
всех крыс «low T3/Т4» синдром, характерный для контрольной группы, либо
нивелировался (у самцов), либо трансформировался в менее выраженный «low
Т4» синдром (у самок), что свидетельствовало о восстановлении (у самцов) или
формировании тенденции к восстановлению (у самок) активности гипоталамо-
гипофизарно-тиреоидной оси.
Бóльшая активность тиреоидной системы у самок, по всей видимости,
была обусловлена большей их потребностью в пульмональном тироксине для
подавления злокачественного процесса в лѐгких за счѐт активации клеточного
звена иммунной системы органа.
К 8 неделе экспериментальной терапии активность тиреоидной системы,
увеличенная на фоне опухолевого роста, уменьшалась у всех крыс. Это
выражалось в нормализации весовых коэффициентов гипофиза и щитовидной
железы в сочетании с нормализацией уровней синтезируемых ими гормонов,
купировании «low T3/Т4» синдрома в крови и восстановлении эутиреоидного
фона в лѐгочной ткани. При этом у самцов происходило практически полное
восстановление нормальной работы системы, тогда как у самок система
восстанавливалась в неполной мере. Это касалось связующего звена – крови,
где регистрировался больший уровень транспортной формы тироксина, и
лѐгочной ткани, в которой формировались низкие, относительно интактных
значений самок, уровни всех тиреоидных гормонов. Впрочем, большая их часть
не отличалась от интактных показателей самцов, за исключением общего
трийодтиронина.
По всей видимости, разная специфика влияния 1,3-диэтилбензимидазолия
трийодида на динамику тиреоидных гормонов в тканях у самцов и самок на
фонеторможенияцентральнойстимуляциигипоталамо-гипофизарно-
тиреоидной оси была обусловлена действием женских половых гормонов,
которые, как известно, связаны с тиреоидным метаболизмом.
Определено, что влияние йодсодержащего препарата имело системный
характер не только в отношении тиреоидной оси регуляции, но и
надпочечниковой, а также гонадной (рисунок 3).

Рисунок 3. Действие 1,3-диэтилбензимидазолия трийодида на уровень стероидных гормонов
в тканях у крыс в процессе экспериментальной терапии

В ответ на лечение у самцов нарастала концентрация тестостерона в
семенниках и восстанавливались до нормальных значений уровни эстрадиола в
семенниках и ДГЭА-S в надпочечниках; у самок – на фоне редукции
тестостерона возрастала концентрация эстрадиола в яичниках, а также
увеличивалось содержание ДГЭА-S и 17-ОНР в надпочечниках.
Особенности метаболизма стероидов на системном уровне, вызванные
экспериментальнымлечением,сочеталисьслокальнымизменением
метаболизма стероидных гормонов в пульмональной ткани. Это выражалось: у
самцов в накоплении тестостерона и ДГЭА-S, у самок – в стабилизации
пульмональных уровней всех исследуемых стероидных гормонов, сниженных у
крыс без лечения, а также нормализации значений расчетных коэффициентов в
лѐгких у всех крыс. То есть, по всей видимости, тестостерон играл защитную
роль в лѐгких у самцов, эстрадиол – у самок, тогда как ДГЭА-S и прогестерон
участвовали в противоопухолевой защите у всех животных, вне зависимости от
их пола.
Анализ динамики ростовых факторов позволил сделать вывод, что и у
самцов, и у самок 1,3-диэтилбензимидазолия трийодид, начиная уже с 4 недели
терапии, подавлял ангиогенез в легком (рисунок 4).

Рисунок 4. Действие 1,3-диэтилбензиммидазолия трийодида на факторы роста и их
рецепторы в ткани легкого у крыс через 5 недель экспериментальной терапии

Об этом свидетельствовало не только снижение уровня сосудистого
эндотелиального фактора роста A (VEGF-A), но и накопление его растворимого
рецептора 1 (sVEGF-R1), который, действуя как приманка, уменьшал
содержание свободных форм эндотелиального фактора, которые могли бы
связаться с эффекторными рецепторами. Кроме того, экспериментальная
терапия у всех животных увеличивала уровень трансформирующего фактора
роста β (TGF-β) без роста его растворимого рецептора (sTGF-βRII), в
противоположность животным без лечения, у которых регистрировалась
редукция этого фактора, усугубляемая дополнительным ингибированием роста
его растворимого рецептора 2. Известно, что трансформирующий фактор роста
β подавляет опухолевый рост, в нашем случае – рост С45, расположенной в
лѐгком.
Также было выявлено, что применение 1,3-диэтилбензимидазолия
трийодида стабилизировало систему инсулиноподобных факторов роста (IGF),
нарушенную при развитии злокачественного процесса в лѐгких у крыс без
лечения (рисунок 5).

Рисунок 5. Содержание инсулиноподобных факторов и их белков-переносчиков в ткани
легкого крыс при профилактическом введении 1,3-диэтилбензимидазолия трийодида через 5
недель экспериментальной терапии

В частности, у всех крыс отмечен лишь незначительный прирост
пульмонального уровня первого фактора (IGF1) – меньший, чем в контроле,
при этом содержание второго фактора (IGF2) в процессе лечения у самок
несколько возрастало; у самцов – не изменялось. Кроме того, на фоне
экспериментальнойтерапииконцентрациявсехбелков-переносчиков
инсулиноподобных факторов роста (IGFBP) в ткани легкого была выше, чем
без лечения (рисунок 6). Причиной чему являлась не только их пульмональная
редукция, развившаяся у крыс без лечения, но и увеличение содержания
первого белка-переносчика (IGFBP1) у самцов и меньшая, чем в контроле,
степень редукции первого и второго белков-переносчиков (IGFBP1 и 2) у
самок. Исследования in vitro показали, что белки инсулиноподобных факторов
роста, наряду с самими ростовыми факторами, могут подавлять рост различных
типов опухолей рака легких.

Рисунок 6. Действие 1,3-диэтилбензимидазолия трийодида на регулярные оси организма и
факторы роста

Такимобразом,начальныйэтапэкспериментальнойтерапиис
использованием1,3-диэтилбензимидазолиятрийодидахарактеризовался
активациейопухолевогоростаклетокС45влѐгкомвследствие
прооксидантного действия йода. Однако основной эффект препарата был
обусловленегонакопительнымдействием,котороепроявлялосьв
восстановлении работы тиреоидной системы с уменьшением синтетической
активности щитовидной железы и поступлением тироксина в ткань лѐгкого, что
способствовало усилению противоопухолевой активности тканевой иммунной
системы.Нормализациягормональногосостоянияцентральногои
периферическогозвеньевгипоталамо-гипофизарно-тиреоиднойосии
изменение активности гонадной и надпочечниковой осей регуляции с
формированием бóльших, чем в контроле, уровней эстрогенов в лѐгких у самок
и тестостерона в лѐгких у самцов, сочетались с модификацией систем ростовых
факторов, приводящей к увеличению содержания компонентов системы,
обладающих ярко выраженным противоопухолевым действием, на фоне
стабилизациисистемсосудистогоэндотелиальногофактораростаи
инсулиноподобных факторов роста, грубо нарушенных при опухолевом
процессе.Выявленныеполовыеособенностидействия1,3-
диэтилбензимидазолия трийодида на тиреоидную систему крыс связаны с
бóльшим уровнем эстрогенов у самок. Выше озвученные факты подтверждают
противоопухолевоеибиоадаптивноевлияние1,3-диэтилбензимидазолия
трийодида,какфактора,повышающегонеспецифическуюи
противоопухолевую резистентность организма, и позволяют рекомендовать его
в качестве препарата, подавляющего развитие злокачественного процесса в
лѐгких.
ВЫВОДЫ
1. Разработан способ экспериментальной терапии, предупреждающей развитие
злокачественного роста С45 в лѐгком у крыс, путѐм внутрижелудочного
введения 1,3-диэтилбензимидазолия трийодида, в 85% случаев подавляющий
опухолевый рост: у самцов – в 100%, у самок – в 67%. По данным весовых
коэффициентоввнутреннихоргановосновнымиточкамиприложения
йодсодержащего препарата являются нейрогуморальные регуляторные оси
организма – гипоталамо-гипофизарно-тиреоидная и гипоталамо-гипофизарно-
надпочечниковая, участвующие в процессах адаптации.
2.Наэтапахэкспериментальнойтерапиисиспользованием1,3-
диэтилбензимидазолия трийодида ткань лѐгкого проходит несколько фаз
морфологическойперестройки:оструюфазудеструктивно-реактивного
измененияклеток,фазукомпенсаторнойпролиферативнойактивности
разнородных физиологических компонентов лѐгочных структур и фазу
адаптации клеток и органа в целом к новому функциональному режиму. На
начальном этапе экспериментальной терапии (1-2 недели) механизмы тканевого
гомеостаза не устойчивы, тогда как в последующем (5 неделя) наступает более
быстраяперестройказащитныхклеточныхсистемлѐгкихсчѐтким
противоопухолевым влиянием, которое через 8 недель приводит к полной
деструкции опухоли.
3.Использование1,3-диэтилбензимидазолиятрийодидастабилизирует
активностьгипоталамо-гипофизарно-тиреоиднойсистемыувсехкрыс.
Устраняет центральную гипофизарную стимуляцию щитовидной железы с
уменьшением выработки ТТГ гипофизом и предупреждает развитие lowТ3/Т4
синдрома, характерного для опухолевого процесса в лѐгком без лечения. На
фоне применения 1,3-диэтилбензимидазолия трийодида у самцов нормализуется
содержание всех форм тиреоидных гормонов в лѐгком, у самок уровень
гормонов в лѐгком снижается относительно значений интактных крыс:
свободных форм – в среднем в 1,6 раза (р<0,05), общих форм – в среднем в 5,0 раз; при этом у всех крыс, вне зависимости от их пола, формируется в три раза больший, чем в контроле, уровень общего тироксина в лѐгком. 4. Противоопухолевый эффект 1,3-диэтилбензимидазолия трийодида у самцов обусловлен увеличением концентраций тестостерона в 24,2 раза относительно контроля и в 7,8 раза относительно уровня интактных животных и ДГЭА-S в 2,9 раза относительно контроля и в 1,9 раза (р<0,05) относительно уровня интактных животных, а также нормализацией содержания прогестерона в лѐгком, у самок – нормализацией низких уровней эстрадиола, прогестерона, ДГЭА-S и 17-ОНР в лѐгком. 5.1,3-диэтибензимидазолиятрийодидсчетвѐртойнеделиприменения стабилизирует системы ростовых факторов VEGF и IGF в лѐгком, изменѐнные при опухолевом росте, и увеличивает пульмональную концентрацию активного TGFβ путѐм накопления TGFβ – рост более чем в 6,0 раз и нормализации высокойконцентрацииsTGFβR2,темсамым,способствуяугнетению ангиогенеза и подавлению пролиферации опухолевых клеток в легком у крыс. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ: 1. Разработанный способ воздействия на опухолевое поражение лѐгких с помощьюпрепарата,нормализующегофункционированиегипоталамо- гипофизарно-тиреоидной системы, может быть использован для дальнейшего изучения механизмов противоопухолевого действия 1,3-диэтилбензимидазолия трийодида и позволяет его рекомендовать для доклинических исследований с перспективой включения в схемы профилактического лечения злокачественных поражений лѐгких: первичных – люди, входящие в группы риска по раку лѐгкого (курильщики, профессиональные вредности) или вторичных – онкологические пациенты с риском метастатического поражения лѐгких. 2. Полученные результаты могут быть внедрены в обучающие курсы студентов лечебно-профилактического, педиатрического, медико-профилактического и фармацевтического факультетов в медицинских университетах на кафедрах патологической физиологии, онкологии, фармакологии, гигиены, а также при обучении в клинической ординатуре и на курсах повышения квалификации врачей онкологов и профпатологов.