Влияние этилметилгидроксипиридина сукцината на функционирование гликопротеина-Р в гематоэнцефалическом барьере в норме и при острой гипоксической гипобарической гипоксии

Культуры клеток. Исследования in vitro выполнены на линии клеток Caco-2 (ФГБУН НИЦ РАН, Санкт-Петербург) (Elsby R. et al. Xenobiotica, 2008, Т. 38, No7- 8, С. 1140-1164; In vitro metabolism and transporter-mediated drug-drug interaction studies. Guidance for Industry. 2017). Клетки культивировали в трансвелл-системе (Transwell) в Дульбекко модифицированной среде Игла (DMEM) с содержанием глюкозы 4500 мг/мл («ПанЭко», Россия), L-глутамина 4 мМ («Sigma-Aldrich», Германия), эмбриональной бычьей сыворотки 15% («Sigma-Aldrich», Германия), пенициллина 100 ЕД/мл и стрептомицина 100 мкг/мл («ПанЭко», Россия) при температуре 37°С и содержании СО2 5% (Фрешни Р.Я. М. : Лаборатория знаний, 2018, 791 с.; Riede J. et al. European Journal of Pharmaceutical Sciences, 2019, Т. 132,
С. 132-141). В работе использовали 24-луночный планшет с диаметром мембраны 0,33 см и размером пор 0,4 мкм (24 mm Transwell®-COL, Collagen-Coated 0,4μm Pore PTFE Membrane Insert, Sterile, «Corning», США). Клетки культивировали 21 день. Начиная с 22 дня на клетках выполняли транспортные эксперименты при достижении трансэпителиального сопротивления выше 500 мОм*см2 (Srinivasan B. et al. Journal of laboratory automation,2015, Т. 20, No2, С. 107-126).
Активность Pgp оценивали по транспорту фексофенадина («Sigma-Aldrich», Германия). Для этого питательную среду заменяли на транспортную — раствор Хэнкса («Sigma-Aldrich», Германия) с 25 мМ раствора Хепеса при рН=7,4 («Sigma- Aldrich», Германия) и 1% диметилсульфоксида («ПанЭко», Россия). В апикальную камеру добавляли фексофенадин до 150 мкМ (Petri N. et al. Pharmaceutical research, 2004, Т. 21, No8, С. 1398-1404), через 1, 2, 3 ч забирали по 50 мкл образцов из базолатеральной камеры с целью определения концентрации в них фексофенадина (a→b перенос). Затем тестировали транспорт фексофенадина из базолатеральной камеры в апикальную — b→a перенос. В данном случае субстрат добавляли в базолатеральную камеру с последующим забором образцов из апикальной камеры.
Транспорт фексофенадина между камерами a и b в обоих направлениях оценивали по формуле (Elsby R. et al. Xenobiotica, 2008, Т. 38, No7-8, С. 1140-1164):
= C∗V 1 , где Papp – коэффициент кажущейся проницаемости; dС/dt – ( ∗ 0)
изменение концентрации субстрата в камере-реципиенте за время инкубации; V – объём камеры реципиента; А — площадь полупроницаемой мембраны лунки в трансвелл-системе, на которой культивировались клетки; С0 — начальная концентрация субстрата в камере-доноре.
В дальнейшем проводился расчёт отношения коэффициентов кажущейся проницаемости по формуле: Отношение коэффициентов = → ; где Papp b→a
→
– коэффициент кажущейся проницаемости при b→a переносе; Papp a→b – коэффициент кажущейся проницаемости при a→b переносе.
Для оценки влияния ЭМГПС (ООО НПК «Фармасофт», Россия) на
активность Pgp in vitro его добавляли в обе камеры одновременно в концентрациях 10

1, 10, 50, 100, 200 мкмоль/л. Для сравнения использовался классический ингибитор Pgp, верапамил («Sigma-Aldrich», Германия), в аналогичных концентрациях. На каждый опыт было выполнено по 3 повторения (n=3). Оценивали Рарр b→a, Рарр a→b и отношение Рарр b→a /Рарр a→b для фексофенадина в присутствии тестируемых веществ.
Концентрацию фексофенадина определяли методом ВЭЖХ-УФ при длине волны 220 нм на хроматографической системе «Стайер» (Россия). При пробоподготовке 50 мкл транспортной среды разбавляли в 150 мкл подвижной фазы и 100 мкл полученного раствора анализировали. Условия хроматографирования: колонка Phenomenx Synergi 4u Polar-RP 80A (250×4,6мм) с зернением 4 мкм, температура разделения 35°С, скорость потока 1 мл/мин. Состав подвижной фазы: 128 мл ацетонитрила («ACROS ORGANICS», Бельгия, «Для ВЭЖХ»), 267,4 мл воды деионизированной, 6,33 мл кислоты уксусной ледяной («ХИММЕД», Россия), триэтиламина («ACROS ORGANICS», Бельгия, «Для ВЭЖХ») — до рН=6,7. Время удерживания фексофенадина: 12,8 мин. Количественное определение проводили методом абсолютной калибровки по площади пиков. Аналитический диапазон методики: 1,2 – 57,4 мкМ. Хроматографическая методика была валидирована (FDA Guidance for Industry (draft guidance), 2020; Guideline on bioanalytical method validation. EMA, 2021).
Исследования in vivo выполнены на крысах-самцах Wistar массой 200-250 г, полученных из питомника «ООО КролИнфо» (Московская область, Орехово- Зуевский район, деревня Новая). Все животные были разделены на следующие серии:
I. Первая серия – разработка методики оценки активности Pgp в ГЭБ: животным 1 группы 1-кратно в/в вводили фексофенадин в дозе 5 мг/кг (n=30, по 5 животных на каждую временную точку), 2 группы – 10 мг/кг (n=30) (Jaisue S. et al., Xenobiotica, 2010, T.40, No11, C. 743-750), 3 группы – 15 мг/кг (n=30). Через 5, 10, 15, 30, 45 и 60 мин после инъекции животных выводили из эксперимента.
II. Вторая серия – изучение влияния ЭМГПС на активность Pgp в ГЭБ:
животным 1 группы 1-кратно в/в вводили ЭМГПС в дозе 50 мг/кг (n=30)
(Перфилова В.Н. и др. Экспериментальная и клиническая фармакология. 2015, Т. 78, No9, С. 8-12), 2 группы – верапамил в дозе 1,65 мг/кг (n=30) (Перфилова В.Н. и др., 2015), 3 группы – в течение 14 дней 2 р/д per os рифампицин в дозе 20 мг/кг (n=30) (Rana S.V. et al., Molecular and cellular biochemistry. 2006, T. 289, No1, C. 39- 47). В последующем у животных оценивали функционирование Pgp в ГЭБ.
III. Третья серия – изучение влияния ЭМГПС на относительное количество Pgp в ГЭБ. Перед оценкой относительного количества Pgp в ГЭБ животным 1 группы (n=5) вводили per os 3 р/д в течение 14 дней воду для инъекций, 2 группы (n=5) – однократно в/в ЭМГПС в дозе 50 мг/кг, 3 группы (n=5) – per os ЭМГПС в дозе 100 мг/кг 3 р/д в течение 14 дней (Воронина Т.А. и др. Экспериментальная и клиническая фармакология. 2006, Т. 69, No4, С. 6-9), 4 группы (n=5) – per os рифампицин в дозе 20 мг/кг 2 р/д в течение 14 дней.
IV. Четвертая серия – изучение влияния ЭМГПС на активность Pgp в ГЭБ при гипоксии. За 30 мин перед моделированием гипоксии с последующей через 3 часа оценкой функционирования Pgp в ГЭБ животным 1 группы (n=30) вводили 1- кратно в/в воду для инъекций, а 2 группы (n=30) – 1-кратно в/в ЭМГПС в дозе 50 мг/кг.
V. Пятая серия – изучение влияния ЭМГПС на относительное количество Pgp в ГЭБ при гипоксии. За 30 мин перед моделированием гипоксии с последующей через 3 часа оценкой относительного количества Pgp в ГЭБ животным 1 группы (n=5) вводили 1-кратно в/в воду для инъекций, 2 группы (n=5) – 1-кратно в/в ЭМГПС в дозе 50 мг/кг.
VI. Шестая серия – изучение влияния ЭМГПС на относительное количество транскрипционных факторов HIF-1α и Nrf2 и выраженность окислительного стресса в коре головного мозга крыс. Перед оценкой данных показателей животным 1 группы перорально вводили воду для инъекций 3 р/д в течение 14 дней, 2 группы – перорально ЭМГПС в дозе 100 мг/кг 3 р/д в течение 14 дней, 3 группы – 1-кратно внутрибрюшинно ЭМГПС в дозе 120 мг/кг (Яснецов В.В. Воронина Т.А. Экспериментальная и клиническая фармакология. 2009. Т. 72,
No1, С. 68-70), 4 группы – перорально воду для инъекций 3 р/д в течение 14 дней с
последующим моделированием гипоксии, 5 группы – перорально ЭМГПС в дозе 100 мг/кг 3 р/д в течение 14 дней с последующим моделированием гипоксии.
Гипоксию моделировали подъемом животных в барокамере на высоту 8000 м сроком на 30 мин (Бобков Ю.Г., Иванова И.А. Пат. физиол. и эксперим. терапия, 1987, No6, С. 13-19). Через 3 ч после моделирования гипоксии животных выводили из эксперимента.
Оценку активности Pgp в ГЭБ выполняли по оригинальной разработанной методике, основанной на определении степени проникновения фексофенадина в ткань мозга после в/в введения. После введения фексофенадина в дозе 10 мг/кг через 5, 10, 15, 30, 45 и 60 мин у животных забирали 4 мл крови в гепаринизированные пробирки из брюшной аорты и кору больших полушарий головного мозга. Кровь центрифугировали при 1000 g 10 мин для получения плазмы. Образцы тканей и плазмы замораживали при -29°С до последующего анализа. Количество фексофенадина в образцах определяли методом ВЭЖХ-УФ при составе подвижной фазы: 128 мл ацетонитрила, 267,4 мл воды деионизированной, 7,0 мл триэтиламина, 4,66 мл кислоты уксусной ледяной, pH=6,0. Скорость потока: 1 мл/мин. Время удерживания фексофенадина: 14,91±0,25 мин. Коэффициенты экстракции фексофенадина: из плазмы крови – 83,57%, из гомогената коры головного мозга – 81,25%. Предел количественного определения и предел обнаружения фексофенадина в плазме крови равны соответственно 100 нг/мл и 11,68 нг/мл, а в гомогенате мозга — соответственно 50 нг/г и 35,27 нг/г. Суммарное количество фексофенадина, попавшего в системный кровоток и в кору больших полушарий, оценивали по показателям AUC0-t плазма и AUC0-t мозг (Каркищенко И.И. и др., Фармакокинетика. Ростов-на-Дону: Феникс, 2001, 284 с.). Для оценки проницаемости ГЭБ был рассчитан показатель AUC0-t-мозг / AUC0-t-плазма (Di L. et al. Expert opinion on drug discovery, 2008, Т.3, No6, С. 677-687).
Относительное количество Pgp в ГЭБ и транскрипционных факторов Nfr2 и HIF-1α в коре больших полушарий головного мозга оценивали иммуногистохимически. Животных выводили из эксперимента введением
летальной дозы (30 мг/кг) золетила («Золетил 100», «Virbac C.A.», Франция). После
стандартной обработки полученных срезов головного мозга их инкубировали с первичными антителами к Pgp («SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC», США) в разведении 1:50, или антителами к Nrf2 (Biorbyt orb11165) в разведении 1:50, или антителами к HIF-1α (HIF1A / HIF1 Alpha (aa432-528) (Unconjugated) (H1alpha67) (LifeSpan LS-B110)). Для выявления первичных антител использовали вторичные антитела, конъюгированные с полимером, сцепленным с пероксидазой. В качестве хромогена использовали 0,1% раствор 3,3-диаминобензидина тетрахлорида с добавлением 0,05% раствора пероксида водорода («Dako», Дания). Ядра клеток докрашивали гематоксилином (Kumar G.L., Rudbeck L. Immunohistochemical methods // Пер. с англ. под ред. Г.А. Франка и П.Г. Малькова, М.: 2011, 224 c.). Микропрепараты фотографировали цифровой камерой ЛОМО ТС-500 (Россия) при увеличении в 400 раз. С каждого микропрепарата фотографировали 10 участков. Анализ изображения осуществляли программой ImageJ (США). С помощью плагина Colour Deconvolution изображение разделяли на слой, окрашенный диаминобензидином, и слой, окрашенный гематоксилином (Fuhrich, D.G. et al. Anal. Quant. Cytopathol. Histpathol, 2013, T. 35, No4, С. 210–216). Относительное количество Pgp анализировали по площади иммунопозитивных мембран с помощью модуля Analyze Particles. Количество ядер и их площадь, окрашенных гематоксилином, а также имеющих положительную реакцию с антителами к Nrf2 и HIF-1α, оценивали с помощью модуля Analyze Particles. Затем рассчитывали относительное количество иммунопозитивных ядер в поле зрения по формуле:
отн = и+ ∗ 100%, где Qотн – относительное количество иммунопозитивных ядер, ог
Qи+ – количество иммуннопозитивных ядер, Qог – общее количество ядер, окрашенных гематоксилином. По аналогичной формуле рассчитывали относительную площадь иммунопозитивных ядер.
Для оценки выраженности окислительного стресса в коре головного мозга крыс, образец гомогенизировали при +2 0C в 0,05 M изотоническом фосфатном буфере с рН=7,4, с использованием гомогенизатора DIAX 900 (насадка 6G) при 24000 об/мин в течение 60 сек. Гомогенат центрифугировали при 3000 об/мин 10
минут (T = +20С). В полученном супернатанте определяли концентрацию малонового диальдегида по методу R. Hoss в модификации Н.Д. Стальной и Т.Г. Горишвили, небелковых тиоловых (SH) групп – по реакции восстановления дисульфид-5,5-дитиобис-2-нитробензоата (Ellman G.L. 1959), активность Se- зависимой глутатионпероксидазы (G-per) – по уменьшению концентрации НАДФ*Н2 в сопряжённой системе (Ланкин В.З., 1976), глутатион-S-трансферазы (G-tr) – по реакции конъюгации глутатиона с 1-хлор-2,4-динитрохлорбензолом (Keen J.H., 1976).
Полученные результаты обрабатывали в программах «StatSoft Statistica 13.0» и «Microsoft Office Excel» 2017. Распределение данных оценивали по критерию Шапиро-Уилка. В случае нормального распределения данных использовался дисперсионный анализ (ANOVA); попарные сравнения выполняли по критерию Ньюмана-Кейлса. При другом распределении данных использовался критерий Крускала-Уоллиса для несвязанных выборок. Попарные сравнения выполняли по критерию Манна-Уитни с поправкой Бонферрони. Статистически значимыми считали различия при р<0,05. Полученные результаты заносились в таблицы и графики в соответствующем распределению данных виде (С. Гланц. Медико- биологическая статистика. Пер. с англ., М., Практика, 1998, 459 с.). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Влияние ЭМГПС на активность Pgp in vitro. В интактных клетках Caco-2 значение коэффициента Рарр b→a составило 2,97*10-61,32*10-6 см/сек, Рарр a→b – 0,61*10-60,21*10-6 см/сек, а их отношение Рарр b→a /Рарр a→b — 4,731,04. Значение Рарр b→a /Рарр a→b, превышающее «2», свидетельствует об асимметрии транспорта фексофенадина через билипидную мембрану клеток линии Caco-2 и подтверждает адекватность используемой методики. В ходе исследования было показано, что классический ингибитор Pgp верапамил в концентрациях 100 и 200 мкмоль/л снижал показатель Рарр b→a /Рарр a→b по сравнению с показателями контроля (p=0,038 и p=0,017 соответственно), что свидетельствует об ингибировании активности белка-транспортера. Показатель Рарр b→a /Рарр a→b фексофенадина уменьшался при использовании ЭМГПС в концентрациях 100 (p=0,026) и 200 мкмоль/л (p=0,002) по сравнению с контролем, что свидетельствуют о снижении активности белка-транспортера Pgp данным препаратом. При расчете IC50 и оценке динамики изменения Рарр b→a /Рарр a→b фексофенадина было показано, что данные параметры достоверно не различались при применении ЭМГПС и верапамила (p>0,05) (рисунок 1).
Таким образом, в опытах in vitro на клетках линии Caco-2 показано, что ЭМГПС является прямым ингибитором Pgp и по своей активности сопоставим с классическим ингибитором белка-транспортера – верапамилом.
Методика оценки активности Pgp в ГЭБ. Для оценки активности Pgp в ГЭБ головного мозга крыс раствор фексофенадина вводили в хвостовую вену в дозах 5, 10 и 15 мг/кг массы тела и через 5, 10, 15, 30, 45 и 60 мин животных подвергали эвтаназии с последующим забором биоматериала.
Для экстракции фексофенадина из плазмы крови к 1,5 мл образца прибавляли 4 мл ацетонитрила («ACROS ORGANICS», Бельгия), встряхивали на приборе Shaker при 400 об/мин 15 мин и центрифугировали 15 мин при 1500 g. Затем упаривали надосадочную жидкость при 50°С на роторно-вакуумном испарителе. Сухой остаток растворяли в 300 мкл подвижной фазы с использованием встряхивателя Vortex («Heidolph», Германия). Подготовку образца коры головного мозга осуществляли следующим способом: к 500 мг образца добавляли 500 мкл воды деионизированной и гомогенизировали в течение 1 мин, после чего добавляли 4 мл ацетонитрила и встряхивали 15 мин; затем центрифугировали при 1750 g 15 мин, надосадок упаривали на роторно-вакуумном испарителе, затем растворяли в 300 мкл подвижной фазы с помощью вибромешалки и повторно
Рисунок 1. Изменение отношения коэффициентов кажущейся проницаемости Рарр b→a /Рарр a→b фексофенадина под действием верапамила и ЭМГПС.
центрифугировали при 1750 g 5 мин. Надосадочную жидкость анализировали. Концентрацию фексофенадина в пробах определяли методом ВЭЖХ-УФ. Методика была валидирована согласно современным рекомендациям.
Оптимальной была признана доза фексофенадина 10 мг/кг массы тела, поскольку при концентрации 5 мг/кг во многих временных точках концентрация в гомогенате коры головного мозга была ниже предела количественного определения, а при дозе 15 мг/кг концентрация в плазме крови в некоторых точках была слишком высокой и требовала разведения перед анализом (рисунок 2).
Для оценки функциональной активности Pgp в ГЭБ по полученным значениям концентраций строили фармакокинетические кривые, определяли значения AUC0-t(плазма) и AUC0-t(мозг), а затем рассчитывали показатель AUC0-t(мозг) / AUC0-t(плазма) , отражающий проницаемость ГЭБ для субстрата Pgp.
Влияние ЭМГПС на активность Pgp в ГЭБ. Перед определением активности Pgp в ГЭБ ЭМГПС вводили животным 1-кратно в/в в дозе 50 мг/кг. Для сравнения использовали классический индуктор Pgp, рифампицин, вводимый внутрижелудочно в дозе 20 мг/кг в течение 14 суток, и классический ингибитор Pgp, верапамил, который вводили 1-кратно в/в в дозе 1,65 мг/кг массы тела.
Введение ЭМГПС, рифампицина и верапамила существенно не влияло на концентрацию фексофенадина в плазме крови крыс и AUC0-t(плазма) после его внутривенного введения: данные показатели статистически значимо не отличались от значений контроля. Применение рифампицина в течение 14 суток приводило к
Рисунок 2. Динамика концентраций фексофенадина в плазме крови (слева) и гомогенате коры головного мозга (справа) после его внутривенного введения в дозах 5, 10 и 15 мг/кг (n=5 на каждую временную точку)
животных. рифампицина
AUC0-t(мозг) отношения AUC0-t(мозг) / AUC0-t(плазма) (p<0,05) (рисунок 3) по сравнению с контролем, что подтверждает адекватность используемой методики исследования. Введение верапамила не оказало существенного влияния на концентрацию фексофенадина в коре больших полушарий головного мозга. Предположительно это связано с гипоперфузией мозга из-за снижения систолического АД. 1-кратное в/в введение ЭМГПС вызывало повышение концентрации фексофенадина в коре больших полушарий, увеличивало AUC0-t(мозг) (p<0,05) и отношение AUC0-t(мозг) / AUC0-t(плазма) фексофенадина (p=0,06; рисунок 3) по сравнению с показателями контроля. Таким образом, 1-кратное в/в введение ЭМГПС в дозе 50 мг/кг массы снижает активность белка-транспортера Pgp в ГЭБ коры больших полушарий головного мозга крыс. Влияние ЭМГПС на относительное количество Pgp в ГЭБ. Относительное количество Pgp в ГЭБ коры головного мозга крыс определяли иммуногистохимически. Курсовое введение рифампицина в течение 14 суток приводило к повышению относительной площади Pgp позитивных мембран на 70,5% (p=0,008) по сравнению с показателями контрольных животных. При этом ни 1-кратное в/в введение в дозе 50 мг/кг массы тела, ни курсовое внутрижелудочное в течение 14 суток в дозе 100 мг/кг массы тела введение ЭМГПС не оказывали достоверного эффекта на относительное количество Pgp в ГЭБ коры лобной доли больших полушарий головного мозга крыс (рисунок 4). снижению концентрации фексофенадина в коре головного мозга крыс по сравнению с показателями контрольных введения происходило (p<0,05) После также Рисунок 3. Изменение AUC0-t(мозг) / AUC0-t(плазма) фексофенадина при использовании рифампицина, верапамила и ЭМГПС (медиана, верхний и нижний квартили). снижение и Таким образом, показано, что у интактных животных ЭМГПС не влияет на относительное количество Pgp в ГЭБ коры лобной доли больших полушарий головного мозга крыс. Влияние ЭМГПС на активность и относительное количество Pgp в ГЭБ при гипоксии. Моделирование гипоксии не приводило к достоверному изменению уровня фексофенадина в плазме крови относительно показателей контроля (p>0,05). В то же время концентрация в гомогенате коры мозга (p<0,05 через 5, 45 и 60 мин), AUC0-t(мозг) (р=0,003) и отношение AUC0-t(мозг) / AUC0-t(плазма) (р=0,027) фексофенадина после гипоксического воздействия превосходили показатели контрольных животных, что свидетельствует о повышении проникновения фексофенадина в кору головного мозга крыс после моделирования гипоксии. Превентивное однократное внутривенное введение ЭМГПС перед гипоксическим воздействием приводило к следующим изменениям: концентрация фексофенадина в плазме крови превосходила значение контроля только на 60 мин (р=0,018), при этом AUC0-t(плазма) фексофенадина превышала аналогичный показатель контроля (р=0,011). Концентрация в гомогенате коры мозгы (р<0,05), AUC0-t(мозг) (р=0,003), отношение AUC0-t(мозг) / AUC0-t(плазма) (р=0,032) фексофенадина превосходили показатели контроля и были сопоставимы с данными серии гипоксии. Полученные результаты свидетельствуют о том, что превентивное 1- кратное в/в введение ЭМГПС перед гипоксией не оказывает существенного влияния на проницаемость ГЭБ для фексофенадина. При изучении влияния гипоксии и превентивного однократного внутривенного введения ЭМГПС перед гипоксическим воздействием на относительное количество Pgp в ГЭБ выявлено, что моделирование гипоксии приводило к повышению относительной площади Pgp-позитивных мембран по Рисунок 4. Изменение относительного количества Pgp в ГЭБ при использовании рифампицина и ЭМГПС (медиана, верхний и нижний квартили) Примечание: К – контроль; Р – рифампицин в дозе 20 мг/кг, 1 р/д, 14 дней; Э1 – в/в введение ЭМГПС в дозе 50 мг/кг, 1-кратно; Э14 – внутрижелудочное введение ЭМГПС в дозе 100 мг/кг, 3 р/д, 14 суток сравнению с контролем, а введение ЭМГПС перед моделированием гипоксии нивелировало индуцирующее действие дефицита кислорода на уровень Pgp (рисунок 5). Таким образом, показано, что при гипоксии увеличивается относительное количество Pgp в ГЭБ коры больших полушарий головного мозга крыс, однако поступление фексофенадина в ткань мозга увеличивается, что скорее всего связано с повышением проницаемости ГЭБ. Однократное введение ЭМГПС перед гипоксическим воздействием препятствует повышению относительного количества Pgp в ГЭБ, но существенно не влияет на проницаемость субстрата белка-транспортера, которая остаётся значительно выше контроля. Влияние ЭМГПС на транскрипционные факторы HIF-1α и Nrf2 и оксидативный статус коры больших полушарий головного мозга крыс. Ни 1- кратное внутрибрюшинное введение, ни курсовое пероральное использование ЭМГПС в течение 14 дней не влияли на количество и относительную площадь HIF-1α-позитивных ядер (рисунок 6) и Nrf2-позитивных ядер (рисунок 7) в коре головного мозга, а также на свободнорадикальный статус ткани мозга (рисунок 8), что свидетельствуют об отсутствии воздействия ЭМГПС на данные показатели у интактных животных. Моделирование гипоксии приводило к увеличению относительной площади HIF-1α- (р=0,032) и Nrf2-позитивных ядер (р=0,056) клеток коры головного мозга крыс. Количество таких ядер статистически значимо от контроля не отличалось. Происходило повышение уровня ТБК-реактивных продуктов (р=0,052) и снижение активности G-per (р=0,004) в гомогенате мозга по сравнению Рисунок 5. Изменение относительной площади Pgp-позитивных мембран в ГЭБ головного мозга крыс (слева) и изменение AUC0-t(мозг) / AUC0-t(плазма) фексофенадина после его внутривенного введения в дозе 10 мг/кг (справа) Примечание: * − p<0,05 – статистически значимые различия с показателями животных группы контроля с показателями интактных животных. Данные изменения свидетельствуют о развитии оксидативного стресса, увеличении относительного количества транскрипционных факторов HIF-1α и Nrf2 в ткани коры головного мозга при гипоксии. Превентивное внутрижелудочное введение ЭМГПС в дозе 100 мг/мл 3 раза в день в течение 14 дней до гипоксического воздействия приводило к следующим результатам. Количество HIF-1–позитивных ядер в коре лобной доли головного мозга крыс, а также их относительная площадь статистически значимо не отличались от показателей интактных животных и группы гипоксии. В то же время количество Nrf2- позитивных ядер у крыс, которым осуществляли курсовое введение ЭМГПС, превышало показатели и группы контроля (р=0,032), и группы гипоксии (р=0,016). Относительная площадь Nrf2-позитивных ядер превышала только показатели интактных животных (р=0,008). Превентивное введение ЭМГПС перед моделированием гипоксии Рисунок 8. Параметры свободнорадикального статуса гомогената коры лобной доли больших полушарий головного мозга крыс. Примечание: * - достоверные различия с группой контроля (р < 0,05) Рисунок 6. HIF-1α-позитивные ядра клеток в коре лобной доли больших полушарий головного мозга крыс разных серий, увеличение х400. Примечание: негатив – окраска без первичных антител к HIF-1α Рисунок 7. Nrf2 – позитивные ядра клеток в коре лобной доли больших полушарий головного мозга крыс разных серий, увеличение х400. Примечание: негатив – окраска без первичных антител к Nrf2 21 препятствовало увеличению уровня ТБК-реактивных продуктов, снижению активности G-per и повышало концентрацию небелковых SH-групп (р=0,017) в гомогенате мозга. Полученные результаты свидетельствуют о том, что курсовой профилактический приём ЭМГПС улучшает оксидативный статус ткани коры головного мозга, препятствует повышению уровня HIF-1α и способствует увеличению относительного количества Nrf2 при острой гипоксической гипобарической гипоксии. ВЫВОДЫ. 1. ВопытахinvitroнаклеткахлинииCaco-2этилметилгидроксипиридина сукцинат в концентрациях 100 и 200 мкмоль/л ингибирует активность гликопротеина-Р. Препарат является прямым ингибитором белка-транспортёра и по своей активности сопоставим с верапамилом. 2. Разработан метод оценки активности гликопротеина-Р в гематоэнцефалическом барьере, заключающийся во внутривенном введении субстрата белка-транспортёра — фексофенадина — в дозе 10 мг/кг массы тела с последующей оценкой в динамике его содержания в ткани коры лобных долей больших полушарий головного мозга крыс Wistar и расчётом показателя AUC0-t(мозг) / AUC0-t(плазма) . 3. В опытах in vivo на интактных крысах Wistar установлено, что однократное внутривенное введение этилметилгидроксипиридина сукцината в дозе 50 мг/кг массы тела ингибирует активность гликопротеина-Р и не влияет на его относительное количество в гематоэнцефалическом барьере коры лобных долей больших полушарий головного мозга. 4. У крыс Wistar моделирование острой гипоксической гипобарической гипоксии, соответствующей нахождению на высоте 8000 м, приводит к повышению относительного количества гликопротеина-Р и проницаемости гематоэнцефалического барьера для фексофенадина. Однократное внутривенное введение этилметилгидроксипиридина сукцината в дозе 50 мг/кг перед моделированием гипоксии препятствует повышению относительного количества гликопротеина-Р в гематоэнцефалическом барьере коры больших полушарий головного мозга крыс и не увеличивает проницаемость гематоэнцефалического барьера для фексофенадина дополнительно к воздействию гипоксии. 5. Однократное внутрибрюшинное (в дозе 120 мг/кг) и курсовое внутрижелудочное введение (в дозе 100 мг/кг 3 раза в день в течение 14 дней) этилметилгидроксипиридина сукцината интактным крысам не влияет на относительное количество транскрипционных факторов HIF-1α и Nrf2 в коре головного мозга крыс. Курсовое внутрижелудочное введение этилметилгидроксипиридина сукцината в дозе 100 мг/кг 3 раза в день в течение 14 дней перед моделированием острой гипоксической гипобарической гипоксии препятствует повышению образования HIF-1α и увеличивает относительное количество транскрипционного фактора Nrf2 в коре головного мозга крыс. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Разработанный метод оценки активности гликопротеина-Р в гематоэнцефалическом барьере рекомендуется использовать для анализа локального влияния лекарственных веществ на данный белок-транспортёр. Полученные сведения об ингибирующем влиянии этилметилгидроксипиридина сукцината на активность гликопротеина-Р в гематоэнцефалическом барьере рекомендуется использовать с целью прогнозирования нежелательных межлекарственных взаимодействий в клинической практике. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ AUC0-t(мозг) - площадь под кривой «концентрация в мозге-время» AUC0-t(плазма) - площадь под кривой «концентрация в плазме крови-время» G-per – глутатионпероксидаза GSH – глутатион G-tr – глутатион-S-трансфераза HIF-1 – фактор 1, индуцируемый гипоксией IC50 – концентрация, ингибирующая активность Pgp на 50% Nrf2 – редокс-чувствительный транскрипционный фактор Pgp – гликопротеин-Р VEGF – сосудистый эндотелиальный фактор роста T1/2 – период полувыведения АТФ – аденозинтрифосфат ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография ГЭБ – гематоэнцефалический барьер НАДФ*Н2 – восстановленный никотинамидадениндинуклеотидфосфат УФ-детектирование – ультрафиолетовое детектирование ЦНС – центральная нервная система ЭМГПС – 2-этил-6-метил-3- гидроксипиридина сукцинат