Влияние комбинации рекомбинантных ангиогенных факторов и нейрональной молекулы адгезии на патофизиологические аспекты морфо-функциональных изменений в спинном мозге крысы после моделирования контузионной травмы

Материалы и метолы
Моделирование контузионной травмы спинного мозга. Оперативные
вмешательства на крысах линии Wistar (n = 34, вес 250‒300 г) выполнены в
операционной,соответствующейнадлежащимсанитарнымнормамис
разрешения локального этического комитета Казанского государственного
медицинского университета. Крыс наркотизировали внутрибрюшинно раствором
Золетила 100 (3мг/кг) и Ксилы (4,8 мг/кг). Контузионную травму спинного мозга
(КТСМ) моделировали после ламинэктомии с помощью импактора на уровне
Тh8-Тh9.
Поведенческиетестыиспользовалидляоценкивосстановления
двигательной активности у животных в послеоперационный период. Тест ВВВ
проводили через день, начиная с 7-х и до 30-х суток после моделирования КТСМ.
Тест Ротарод начинали на 20-е сутки и проводили через день до 30-х суток
эксперимента. Кинематику суставов оценивали при ходьбе на Тредмиле. На 30-е
сутки после операции у животного в проекциях гребня подвздошной кости,
большого вертела бедренной кости, коленного, голеностопного суставов и
пальцев левой задней конечности наносили цветные метки. Затем крысу
помещали на беговую дорожку (скорость 10 см/сек), а грудь и передние
конечности фиксировали манжетой. Видеофиксацию цветных меток во время
ходьбы подопытного животного осуществляли с помощью фотоаппарата Canon
PowerShot S5 IS (Япония). Полученные видеоматериалы использовали для
анализа объема движений в тазобедренном, коленном и голеностопном суставах.
Видеоанализ кинематики суставов проводили с помощью программного
обеспечения Kinovea 0.8.23.
Электрофизиологические исследования выполнены на 30-е сутки после
моделированияКТСМ.Крыснаркотизировалирастворомхлоралгидрата
(80 мг/мл, 0,4 мл внутрибрюшинно) и с помощью игольчатой миографии
регистрировали вызванные моторные потенциалы симметричных икроножных
мышц правой и левой конечностей в ответ на электрическую стимуляцию
седалищного нерва или магнитную стимуляцию шейно-грудного отдела спинного
мозга.
Гистологические методы исследования спинного мозга. На 30-е сутки
послеоперацииподопытныхживотныхнаркотизировалиспомощью
хлоралгидрата(80 мг/мл,0,4млвнутрибрюшинно),транскардиально
перфузировали 4% забуференным раствором параформальдегида (4 С°, рН = 7,4)
и забирали грудопоясничный участок позвоночного столба, который далее
постфиксировали в 4% параформальдегиде. Через сутки спинной мозг выделяли
из позвоночного столба и делили на три фрагмента: ростральный (10 мм),
эпицентр травмы (10 мм), каудальный (10 мм).
Сохранность серого вещества исследовали на поперечных срезах спинного
мозга из рострального и каудального фрагментов, окрашенных гематоксилином и
эозином. На оцифрованных микропрепаратах при 10-кратном увеличении
микроскопа в программе ImageJ (NIH) [Madabhushi A., Lee G., 2016] оценивали
площадь патологических полостей и сохранность серого вещества относительно
всей площади серого вещества спинного мозга.
Относительную площадь миелина в эпицентре травмы изучали на
полутонких поперечных срезах спинного мозга, окрашенных метиленовым синим.
Напоперечныхсрезахоцифрованныхмикропрепаратовпри20-кратном
увеличении микроскопа в программе AxioVision Rel. 4.8 подсчитывали
относительную площадь миелиновых оболочек нервных волокон в квадрате
площадью 0,08 мм2 в передних, боковых и задних канатиках белого вещества на
обеих сторонах спинного мозга.
Иммунофлуоресцентное окрашивание проводили на поперечных свободно
плавающихсрезахкаудальногофрагментаспинногомозга.Астроциты
окрашивали при помощи антител против глиального фибриллярного кислого
белка (GFAP) (Santa Cruz, 1 : 200), клетки олигодендроглии ‒ антителами к NG2
(Santa Cruz, 1 : 100), клетки микроглии ‒ при помощи антител к Iba1 (Abcam,
1 : 200). Для анализа экспрессии молекул клеточного стресса использовали
антитела против белка теплового шока с молекулярной массой 27 кДа (Hsp27)
(Abcam,1 : 200). Экспрессию синаптических белков оценивали с помощью
антител против синаптофизина (Abcam,1 : 100) и белка постсинаптической
плотности с молекулярной массой 95 кДа (PSD95) (Abcam,1 : 200). Для
визуализации ядер клеток срезы дополнительно окрашивали в течение 10 минут
при комнатной температуре раствором DAPI (4’,6-диамидино-2-фенилиндол,
Abcam,1 : 5000).Анализокрашенныхсрезовпроводилиспомощью
конфокального сканирующего микроскопа LSM 510 META (Carl Zeiss, Германия).
Для оценки экспрессии белков-мишеней в спинном мозге были выбраны
вентральные рога серого вещества. Иммунопозитивные клетки подсчитывали в
квадрате площадью 0,05 мм2 с изображения z-стека, состоящего из шести срезов с
интервалом0,5мкм.Цифровыеизображениясрезовспинногомозга
анализировали с помощью программы ImageJ (NIH). При подсчете количества
иммунопозитивных клеток учитывали присутствие в клетках ядер, окрашенных
DAPI. Плотность специфической флуоресценции в процентах вычисляли как
отношение суммы ненулевых пикселей в снимке данного канала флуоресценции к
площади изображения в пикселях.
Генные и генно-клеточные препараты. Рекомбинантные репликативно-
дефектные вирусные векторы были созданы на основе аденовируса человека 5-го
серотипа (Ad5) с использованием клеточной культуры НЕК 293 (Human
Embryonic Kidney 293) в ФГБУ «Национальный исследовательский центр
эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи»
Минздрава РФ (Москва) по методу, описанному ранее [Islamov R.R. et al., 2017b].
В настоящем исследовании были использованы Ad5, несущие ген зеленого
флуоресцирующего белка gfp (Ad5-GFP), ген ангиогенина ANG (Ad5-ANG), ген
нейрональной молекулы клеточной адгезии ncam1 (Ad5-NCAM) и сосудистого
эндотелиального фактора роста vegf165 (Ad5-VEGF).
Для доставки в ЦНС трех рекомбинантных генов (vegf165, ANG и ncam1)
готовили генный препарат, содержащий три аденовирусных вектора в равном
соотношении:Ad5-VEGF(1/3),Ad5-ANG(1/3)иAd5-NCAM(1/3)
[Islamov R.R et al., 2017a].Дляинтратекальнойинфузиигенныйпрепарат
содержал 2 × 107 вирусных частиц (Ad5-VEGF + Ad5-ANG + Ad5-NCAM или
Ad5-GFP) в 20 мкл физиологического раствора. При создании генно-клеточного
препарата для доставки в спинной мозг рекомбинантных генов (vegf165, ANG и
ncam1) в качестве клеточного носителя были использованы МККП.
Уровень мРНК генов vegf165, ang, ncam1 в трансдуцированных МККП
определяли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени
(ПЦР-РВ). Эффективность продукции рекомбинантного белка в генетически
модифицированныхМККПоцениваливклеткахпослетрансдукции
аденовирусом Ad5-GFP. Через 72 часа культивирования МККП + Ad5-GFP in vitro
культуру клеток изучали с помощью инвертированного люминсцентного
микроскопа Axio Observer Z1 (Carl Zeiss, Германия).
Продукцию рекомбинантных молекул VEGF, GDNF и NCAM in vivo
изучали в ростральном фрагменте спинного мозга через 30 суток после
интратекальной инфузии генного препарата или трансплантации генетически
модифицированных МККП методом иммунофлуоресцентного окрашивания с
помощью специфических антител к белкам-мишеням. Ростральный фрагмент был
выбран с целью подтверждения способности аденовирусных векторов и МККП
проникать от места инъекции (поясничный отдел) через эпицентр в ростральную
часть спинного мозга. Экспрессию рекомбинантных молекул в МККП выявляли
путем двойного иммунофлуоресцентного окрашивания антителами против VEGF
(Abcam, 1 : 200), ангиогенина (Abcam, 1 : 200), NCAM (Abcam, 1 : 200) и
человеческого ядерного антигена HNA (Millipore, 1 : 150). Для визуализации ядер
клетоксрезыдополнительноокрашивалирастворомпропидияиодида
(PI, Invitrogen, 1 : 1000) или DAPI (Abcam, 1 : 5000). При подсчете количества
иммунопозитивных клеток учитывали наличие в клетках ядер, окрашенных DAPI.
Доставка рекомбинантныхгенов в спинной мозг крысы после
моделирования КТСМ. Через 4 часа после нанесения КТСМ животным
выполняли ламинэктомию на уровне L4−L5, далее интратекально вводили генные
или генно-клеточные препараты. Согласно дизайну эксперимента животные были
разделены на пять экспериментальных групп (табл.).
Таблица
Экспериментальные группы животных
Интратекальная инъекция препарата в 20 мкл
Группа
физиологического раствора
КТСМ (контроль, n = 4)20 мкл физиологического раствора (NaCl 0,9%)
КТСМ/Ad5-GFP (контроль,
2 × 107 вирусных частиц Ad5-GFP
n = 8)
КТСМ/МККП+Ad5-GFP
2 × 106 МККП, трансдуцированных Ad5-GFP,
(n = 6)
КТСМ/Ad5-VEGF-ANG-2 × 107 вирусных частиц, несущих Ad5-VEGF (1/3), Ad5-
NCAM (n = 4)ANG (1/3) и Ad5-NCAM (1/3)
КТСМ/МККП+Ad5-VEGF-2 × 106 МККП, трансдуцированных Ad5-VEGF (1/3), Ad5-
ANG-NCAM (n = 7)ANG (1/3) и Ad5-NCAM (1/3)
Статистическийанализ.Выявлениеразличиймеждугруппами
проводили с помощью теста Краскела − Уоллиса (нулевая гипотеза: все группы
принадлежат одной совокупности, при p < 0,05, нулевая гипотеза отвергалась). В качестве апостериорного критерия для теста Краскела − Уоллиса использовали U-тест Манна-Уитни, с помощью которого выявляли различия между каждой экспериментальной и контрольной группами, поправку на множественность не вводили. Данные поведенческих тестов, объемов кинематики суставов, моторных вызванных потенциалов, сохранности серого вещества и относительной площади миелина,подсчетагенно-модифицированныхМККПвспинноммозге представленыввидемедианы[1квартиль;3квартиль].Результаты иммунофлуоресцентного анализа клеточный маркеров, ПЦР-РВ представлены в виде средней ± стандартное отклонение. Анализ полученных данных проводили с использованием базовых пакетов языка R. Статистически значимыми считали различия при p < 0,05. Результаты. Морфо-функциональные изменения спинного мозга после моделирования КТСМ. На 30-е сутки у подопытных животных анализ поведенческих тестов ВВВ и Ротарод обнаружил снижение двигательной активности. У крыс с КТСМ значение теста ВВВ составило 8,5 балла [7,75, 9], при максимальном значении 21 балл (p < 0,05), а время тестирования на Ротароде снизилось с 2–3 минут до 9,2 сек [8,4; 9,6] (p < 0,05). Кинематику тазобедренного, коленного и голеностопного суставов задней левой конечности оценивали по величине угловых значений. Объем движения у интактных животных в тазобедренном суставе составил 22° [9; 24], в коленном – 71° [69; 71] и в голеностопном 88° [87; 102]. У крыс с контузионной травмой наблюдалось незначительное снижение величины угла в тазобедренном суставе (19° [19; 21]) и резкое выраженное уменьшение объема движений в коленном и голеностопном суставах – 11° [11; 26] и 69° [57; 72] соответственно (p < 0,05). На 30-е сутки после моделирования нейротравмы анализ электромиограммы икроножной мышцы не выявил статистически значимых отличий в значениях порога, амплитуды, латентного периода и длительности М-ответа у крыс с КТСМ при сравнении с интактными животными (p > 0,05). При исследовании Н-ответа
икроножной мышцы было обнаружено статистически значимое увеличение
порога, снижение амплитуды и сокращение латентного периода у крыс с КТСМ
при сравнении с интактными животными. При этом длительность Н-ответа у этих
животных не отличалась (p > 0,05).
При исследовании электромиограммы икроножной мышцы в ответ на
магнитную стимуляцию шейно-грудного отдела спинного мозга было обнаружено
увеличение порога, снижение амплитуды, увеличение латентного периода и
длительности вызванных моторных потенциалов у крыс с КТСМ (p < 0,05). Выявленныефункциональныенарушениясогласуютсясданными морфологического исследования спинного мозга. У интактных животных относительная площадь серого вещества на уровне нижних грудных сегментов составляет 98% [97,1; 98,8]. У крыс с КТСМ ростральнее эпицентра травмы площадь серого вещества снизилась до 81,2% [74,8; 87,6], а каудальнее – до 89% [87,2; 90,7] (p < 0,05). Анализ сохранности белого вещества обнаружил незначительное снижение относительной площади миелина в переднем канатике (68,9% [66; 72,2]) при сравнении с интактными животными (71,8% [70,5; 73]) (p > 0,05). При этом статистически значимое снижение относительной площади
миелина документировано в боковом (58,2% [57; 64,3]) и заднем (59,5% [53; 63,4])
канатиках относительно значений у интактных животных – 72,9% [72,6; 74,1] и
80,2% [79; 80,8] соответственно (p < 0,05). Молекулярные и клеточные изменения в спинном мозге после нейротрамы изучали иммунофлуоресцентным методом. Так, в передних рогах спинного мозга у интактных животных количество Hsp27-позитивных клеток – 9,3 ± 2,5, средняя интенсивность флуоресценции синаптофизина составила 37,0 ± 2,5, PSD95 – 33,8 ± 2,7, количество GFAP-позитивных астроцитов достигло 8,5 ± 2,8, NG2-позитивных олигодендроглиальных клеток – 26,2 ± 4,4, клеток микроглии – 6,3 ± 0,8. На 30-е сутки после КТСМ количество Hsp27-позитивных клеток в каудальном фрагменте спинного мозга статистически значимо увеличивалось до 29,5 ± 3,8, а экспрессия синаптофизина и PSD95 снижалась до 16,8 ± 1,3 и 14,3 ± 2,8соответственно(p < 0,05).КоличествоNG2-позитивных олигодендроглиальных клеток незначительно уменьшалось до 21,1 ± 4,1, при этом количество астроцитов увеличивалось более чем в два раза – 19,2 ± 3,0, а Iba1-позитивных клеток – до 17 ± 0,8 (p < 0,05). Анализ экспрессии рекомбинантных генов. Эффективность экспрессии трансгенов в составе Ad5-GFP, МККП + Ad5-GFP, Ad5-VEGF-ANG-NCAM и МККП + Ad5-VEGF-ANG-NCAM была подтверждена in vitro и in vivo. Методом ПЦР-РВ в МККП + Ad5-VEGF-ANG-NCAM было установлено значительное повышениесодержаниямРНКгеновvegf165,angиncam1. Иммунофлуоресцентныманализомбылаподтвержденапродукция рекомбинантных молекул VEGF, ANG и NCAM в клетках серого и белого вещества ростральнее эпицентра травмы в спинном мозге крысы с КТСМ после интратекальной доставки генного препарата Ad5-VEGF-ANG-NCAM. Также выше эпицентра травмы были обнаружены МККП, продуцирующие VEGF, ANG и NCAM, после интратекальной инъекции крысам с КТСМ генно-клеточного препарата МККП + Ad5-VEGF-ANG-NCAM. Оценка эффективности доставки рекомбинантных генов vegf165, ang и ncam1 на морфо-функциональное восстановление спинного мозга крыс с КТСМ. При сравнении с контрольными животными интратекальная доставка рекомбинантных генов, кодирующих VEGF, ANG и NCAM, с помощью аденовирусных векторов вызывает следующие положительные изменения: 1) способствует восстановлению двигательных функций (улучшению параметров поведенческих тестов и увеличению объема движений в голеностопном суставе); 2) снижает амплитуду и латентный период вызванных моторных потенциалов икроножной мышцы в ответ на магнитную стимуляцию спинного мозга; 3) увеличивает сохранность серого вещества и относительную площадь миелина в боковых и задних канатиках белого вещества; 4) снижает экспрессию молекулы клеточного стресса (Hsp27) и повышает экспрессию синаптического белка синаптофизина; 5) сдерживает развитие астроглиоза (снижается количество GFAP-позитивныхастроцитовиIba1-позитивныхклетокмикроглии)и способствует миелинизации нервных отростков (увеличивается количество NG2-позитивных олигодендроглиальных клеток). На фоне интратекальной доставки vegf165, ang и ncam1 с помощью МККП, также при сравнении с крысами с КТСМ, было установлено улучшение параметров поведенческих тестов и кинематики голеностопного сустава. Данные электрофизиологических исследований икроножной мышцы свидетельствовали о восстановлении порога, амплитуды и латентного периода Н-ответа при электрической стимуляции седалищного нерва и значения латентного периода вызванного моторного потенциала в ответ на магнитную стимуляцию шейно- грудного отдела спинного мозга. При гистологическом изучении спинного мозга было установлено положительное влияние генно-клеточного препарата на сохранность серого и белого вещества, которое сочеталась со снижением астроглиоза, экспрессии Hsp27 в клетках серого вещества и повышением экспрессии синаптического белка синаптофизина в нейронах. При сравнительном анализе прямой и клеточно-опосредованной доставки vegf165, ang и ncam1 установлено, что генный (Ad5-VEGF-ANG-NCAM) и генно-клеточный(МККП + Ad5-VEGF-ANG-NCAM)препаратывцелом оказывают аналогичное положительное действие на морфо-функциональное восстановление спинного мозга после нейротравмы. При этом следует учитывать, что при прямой доставке рекомбинантных генов происходит бесконтрольная трансдукция аденовирусными векторами различных клеточных типов в ЦНС и эффективностьдействиягенногопрепаратаобусловленапродукцией рекомбинантныхмолекулVEGF,ANGиNCAMклеткамимозга. НейротрансплантациягенетическимодифицированныхМККПexvivo предполагает продукцию рекомбинантных молекул VEGF, ANG и NCAM только трансплантированными клетками. Такой подход исключает прямое воздействие вирусного вектора на организм реципиента и позволяет контролировать уровень трансдукции клеток. Кроме того, положительное действие генно-клеточного препарата на посттравматическую регенерацию спинного мозга может быть также обусловлено непосредственным влиянием МККП, о чем свидетельствуют более выраженные положительные изменения некоторых изученных параметров после интратекального введения МККП + Ad5-VEGF-ANG-NCAM. Результаты, полученные в данном исследовании, позволяют предположить, что интратекальная доставка в ЦНС одновременно трех рекомбинантных генов vegf165,angиncam1являетсяэффективнымспособомсдерживания нейродегенерации и стимулирования нейрорегенерации в ЦНС. Доставка комбинации генов vegf165, ang и ncam1 с помощью МККП представляет собой новый потенциально успешный подход к лечению пациентов со спинномозговой травмой. ВЫВОДЫ: 1. На 30-е сутки после моделирования контузионной травмы спинного мозга у крысы установлено: 1) снижение двигательной активности; 2) уменьшение объема движений в суставах задних конечностей; 3) патологические изменениявызванныхмоторныхпотенциаловикроножноймышцы; 4) уменьшение относительной площади серого вещества и миелина в белом веществе спинного мозга; 5) повышение экспрессии молекулы клеточного стресса(белкатепловогошокаHsp27);6)снижениеэкспрессии синаптических белков (синаптофизина и PSD95) в нейронах; развитие астроглиоза (увеличение количества GFAP-позитивных астроцитов и Iba1- позитивных клеток микроглии). 2. Интратекальная доставка в ЦНС рекомбинантных генов vegf165, ang, ncam1 с помощью аденовирусных векторов (Ad5) обеспечивает трансдукцию клеток мозга и продукцию в них рекомбинантных молекул в течение 30 суток. 3. Комбинация из трех репликативно-дефектных аденовирусов человека 5-го серотипа (Ad5), несущих гены vegf165, ang и ncam1, эффективно трансдуцирует мононуклеарные клетки крови пуповины человека ex vivo, обеспечивает в них синтез мРНК трансгенов и продукцию рекомбинантных молекул VEGF, GDNF и NCAM. После интратекальной инъекции генетически модифицированные МККП мигрируют в ткань мозга в область повреждения,гдеонисохраняютспособностьпродуцировать рекомбинантные молекулы в течение 30 суток. 4. Интратекальная доставка сочетания рекомбинантных генов vegf165, ang и ncam1 в спинной мозг крысы после контузионной травмы с помощью аденовирусных векторов или мононуклеарных клеток крови пуповины человека имеет выраженный позитивный эффект на: 1) восстановление двигательной активности у животных; 2) увеличение объема движений в суставах задних конечностей; 3) улучшение электрофизиологических показателей икроножной мышцы; 4) сохранность серого и белого вещества спинногомозга;5)увеличениеэкспрессиисинаптическихбелков (синаптофизина) в нейронах; 6) снижение иммуноэкспрессии молекул клеточного стресса (уменьшение количества Hsp27-позитивных клеток); 7) сдерживаниеразвитияастроглиоза(уменьшениеколичества GFAP-позитивных астроцитов); 8) поддержание миелинизации нервных отростков (увеличение количества NG2-позитивных олигодендроглиальных клеток). 5. Интратекальная доставка сочетания рекомбинантных генов vegf165, ang и ncam1 в спинной мозг крысы после контузионной травмы с помощью мононуклеарных клеток крови пуповины человека в целом имеет более выраженныйположительныйэффектнаморфо-функциональное восстановление спинного мозга при сравнении с доставкой трансгенов с помощью аденовирусных векторов.