Вольтамперометрическое определение гепарина в лекарственных препаратах с использованием ряда синтетических катионных красителей

ВВЕДЕНИЕ ………………………………………………………………………………………………………. 5

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР………………………………………………………………. 11

1.1 История открытия и изучение строения гепарина ……………………………………. 11

1.2 Классификация гепаринов по спектру действия и химической структуре…. 15

1.3 Физико-химические свойства гепарина ……………………………………………………. 18

1.4 Полифункциональные свойства гепарина ………………………………………………… 20

1.6 Методы определения гепарина ………………………………………………………………… 23

1.6.1 Комбинированные инструментальные методы определения гепарина … 24

1.6.2 Спектральные методы определения гепарина …………………………………….. 25

1.6.3 Электрохимические методы определения гепарина ……………………………. 28

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ …………………………………………………. 34

2.1 Оборудование, химическая посуда ………………………………………………………….. 34

2.2 Реактивы, приготовление растворов ………………………………………………………… 38

2.3 Объекты анализа …………………………………………………………………………………….. 41

2.4 Методика эксперимента ………………………………………………………………………….. 42

2.4.1 Методика вольтамперометрического определения гепарина в
комплексе с метиленовым голубым ……………………………………………………………. 42

2.4.2 Методика вольтамперометрического определения гепарина в
комплексе с малахитовым зеленым ……………………………………………………………. 42

2.4.3 Методика вольтамперометрического определения гепарина в
комплексе с толуиленовым синим ……………………………………………………………… 43

2.4.4 Определение антиоксидантной активности гепарина методом
вольтамперометрии……………………………………………………………………………………. 44

2.4.5 Спектрофотометрическая методика определения гепарина ………………… 45
2.5 Статистическая обработка результатов измерений …………………………………… 46

ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ
ЭЛЕКТРООКИСЛЕНИЯ-ВОССТАНОВЛЕНИЯ РЯДА КАТИОННЫХ
КРАСИТЕЛЕЙ РАЗЛИЧНЫХ КЛАССОВ И ИХ ПОСЛЕДУЮЩЕЕ
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПРИ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКОМ
ОПРЕДЕЛЕНИИ ГЕПАРИНА В ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТАХ …………….. 47

3.1 Исследование электрохимических свойств синтетического красителя
тиазинового класса – метиленового голубого и его комплекса с гепарином …… 48

3.2 Исследование электрохимических свойств синтетического красителя
трифенилметанового класса – малахитового зелёного и его комплекса с
гепарином …………………………………………………………………………………………………….. 60

3.3 Исследование электрохимических свойств синтетического красителя
индаминового класса – толуиленового синего и его комплекса с гепарином….. 71

ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ
ГЕПАРИНА МЕТОДОМ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИИ ………………………………………. 89

4.1 Методика определения антиоксидантной активности гепарина ……………….. 89

4.2 Результаты вольтамперометрического исследования антиоксидантной
активности гепарина в различных образцах ………………………………………………….. 91

ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО
ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕПАРИНА В ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТАХ С
ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТС И УСТАНОВЛЕНИЕ ЕЕ МЕТРОЛОГИЧЕСКИХ
ХАРАКТЕРИСТИК …………………………………………………………………………………………. 94

5.1 Оценка специфичности вольтамперометрической методики определения
гепарина с использованием ТС ……………………………………………………………………… 94

5.2 Определение посторонних примесей в препаратах гепарина методом
капиллярного электрофореза ………………………………………………………………………… 96
5.3 Определение гепарина в лекарственных препаратах с использованием
спектрофотометрической методики ………………………………………………………………. 97

5.4 Методика количественного определения гепарина в лекарственных
препаратах ……………………………………………………………………………………………………. 99

5.5 Метрологическая оценка вольтамперометрической методики
количественного определения гепарина в лекарственных препаратах с
использованием красителя ТС …………………………………………………………………….. 101

5.5.1 Установление предела обнаружения и нижнего предела
количественного определения методики…………………………………………………… 102

5.5.2 Подтверждение линейности разработанной методики ………………………. 103

5.5.3 Оценка правильности, повторяемости и внутрилабораторной
прецизионности методики ……………………………………………………………………….. 107

ЗАКЛЮЧЕНИЕ …………………………………………………………………………………………….. 109

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ…………………………………………. 111

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………………………………………. 113

Приложение 1. ………………………………………………………………………………………………. 131

Приложение 2 ……………………………………………………………………………………………….. 136

Приложение 3 ……………………………………………………………………………………………….. 145

Приложение 4 ……………………………………………………………………………………………….. 146

Результаты исследования показали, что для электрохимического
определения полианионного гепарина в лекарственных препаратах методом
вольтамперометрии возможно применение синтетических красителей катионной
природы. Разработанная методика определения гепарина в лекарственных
препаратах в условиях постоянно-токовой анодной вольтамперометрии с
дифференцированием на МЭ с использованием толуиленового синего выгодно
отличается от существующей, широко применяемой спектрофотометрической
методики, что указывает на перспективность и расширение возможностей
электроаналитической химии.
На основании полученных результатов сформулированы следующие
выводы:
1. Исследованы электрохимические свойства ряда синтетических
катионных красителей (МГ, МЗ, ТС), относящихся к различным классам
(тиазинового, трифенилметанового и индаминового). Изучено влияние некоторых
факторов на сигналы красителей (рН раствора, материал электрода, природа
фонового электролита, скорость развертки потенциала). Предложены возможные
механизмы протекания электродных процессов с участием МГ, МЗ, ТС;
2. Изучены физико-химические закономерности электрохимического
поведения комплексов «гепарин-краситель». По экспериментальным
зависимостям Iп.–W и lgIп.–lgW выявлено, что исследуемые комплексы
адсорбируются на поверхности индикаторных электродов;
3. Подобраны рабочие условия для количественного
вольтамперометрического определения гепарина в лекарственных препаратах с
использованием красителей. При определении гепарина в комплексе с МГ на СУЭ
в фоновом электролите с рН 6,86 область прямолинейной зависимости
концентрации гепарина от тока электроокисления комплекса Нер–МГ при
Е = –0,19 В находится в диапазоне от 2 до 24 мг/дм 3, предел обнаружения
0,31 мг/дм3. В случае определения гепарина в комплексе с МЗ на РПЭ в фоновом
электролите с рН 1,65 область прямолинейной зависимости концентрации
гепарина от тока электровосстановления комплекса Нер–МЗ при Е = –0,87 В
находится в диапазоне от 2 до 25 мг/дм3, предел обнаружения 0,48 мг/дм3. При
определении гепарина в комплексе с ТС на МЭ в фоновом электролите с рН 1,9
область прямолинейной зависимости концентрации гепарина от тока
электроокисления комплекса Нер–ТС2 при Е = 0,24 В находится в диапазоне от
1 до 23 мг/дм3, предел обнаружения 0,2 мг/дм3. Выявлено, что для
вольтамперометрического определения гепарина в лекарственных препаратах,
наиболее рационально применять ТС;
4. Установлено, что при добавлении гепаринсодержащих образцов
происходит ингибирование процесса катодного электровосстановления кислорода
с изменением времени протекания процесса. Настоящее наблюдение указывает на
проявление антиоксидантных свойств у гепарина;
5. Разработана методика количественного вольтамперометрического
определения гепарина в лекарственных препаратах с использованием
толуиленового синего. Оценена специфичность разработанной методики.
Установлено что дерматан сульфат (DS) и гиперсульфатированный хондроитин
сульфат (OSCS) мешают вольтамперометрическому определению гепарина. Для
выбора анализируемых объектов при вольтамперометрическом определении
гепарина с использованием ТС предложено проводить предварительный анализ
образцов гепарина на наличие DS и OSCS методом капиллярного электрофореза с
УФ-детектированием;
6. Рассчитаны метрологические характеристики
вольтамперометрической методики количественного определения гепарина в
лекарственных препаратах с использованием красителя толуиленового синего.
Выполнена оценка правильности разработанной методики с использованием
«независимого» спектрофотометрического метода.
УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

АДФ – аденозиндифосфат
АМФ – аденозинмонофосфат
АОА – антиоксидантная активность
АТ-III – антитромбин III
АТФ – аденозинтрифосфат
ВМГ – высокомолекулярный гепарин
ДИВА – дифференциально-импульсная вольтамперометрия
Ед – единицы действия
ИСП-МС – масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой
МГ – метиленовый голубой
МЗ – малахитовый зелёный
МЭКХ – мицеллярная электрокинетическая капиллярная хроматография
НМГ – низкомолекулярный гепарин
НФГ – нефракционированный гепарин
ПАВ – поверхностно-активное вещество
РПЭ – ртутно-плёночный электрод
СУЭ – стеклоуглеродный электрод
ТК – толуиленовый красный
ТС – толуиленовый синий
УСЭ – углеродсодержащий электрод
МЭ – углеродсодержащий электрод, модифицированный углеродными чернилами
УЧ – углеродные чернила
ХСЭ – хлоридсеребряный электрод
ЭВ О2 – электровосстановление кислорода
ЯМР – спектроскопия ядерного магнитного резонанса
D – коэффициент диффузии, см2/с;
DC – доксициклин
DS – дерматансульфат
E1/2 – потенциал, соответствующий половине высоты пика, В
Eп – потенциал пика, В
F – постоянная Фарадея, 96485,3329 Кл/моль
GAG – глюкозаминогликан
GlcA – β-D-глюкуроновая кислота
GlcA (2S) – 2-O-сульфатированная β-D-глюкуроновая кислота
GlcN – β-D-глюкозамин
GlcNAc – N-ацетилированный β-D-глюкозамин
GlcNAc (6S) – 6-O-сульфатированный N-ацетилированный β-D-глюкозамин
GlcNS – N-сульфатированный β-D-глюкозамин
GlcNS (3S) – 3-О-сульфатированный N-сульфатированный β-D-глюкозамин
GlcNS (6S) – 6-O-сульфатированный N-сульфатированный β-D-глюкозамин
Hep–МГ комплекс гепарин–метиленовый голубой
Нер-МЗ – комплекс гепарин–малахитовый зеленый
Нер–ТС (Hep-ТС2) – комплекс гепарин–толуиленовый синий
Ido (2S) – 2-O-сульфатированная L-идуроновая кислота
IdoA – L-идуроновая кислота
Iп – ток пика, мкА
K – показатель антиоксидантной активности, мкг/(дм3мин)
ks – гетерогенная константа скорости реакции, cм/с
n – общее число переносимых электронов
OSCS – гиперсульфатированный хондроитин сульфат
pNА – паранитроанилин
R – универсальная газовая постоянная 8,314 Дж/моль·К
T – температура, К
W – скорость развертки (сканирования) потенциала, мВ/с, В/с
α – эффективный коэффициент переноса электронов катодного процесса
ΔE – разность потенциалов, В
Λ – безразмерный параметр по Матсуда и Айябэ