Вольтамперометрическое определение нитрит-ионов и S-нитрозотиолов в биологических жидкостях

Актуальность работы.
Соединения азота, в частности, оксид азота II (NO) и образующиеся после его
окисления нитрит-ионы, а также его субстраты S-нитрозотиолы, играют важную
роль в биохимических процессах организма. Особая роль этих соединений
обусловлена, прежде всего, стимуляцией иммунной системы организма, которая
распознает и уничтожает чужеродные тела и раковые клетки. Однако
злокачественное новообразование способно к избеганию иммунологического
надзора организма. Более того, клетки иммунной системы могут способствовать
росту опухоли через индукцию иммуносупрессии противоопухолевых механизмов
и усиление ангиогенеза. Существует ряд клеток иммунной системы, которые в
зависимости от их функционального статуса могут быть связаны как
опухолеподдерживающей, так и противоопухолевой активностью иммунной
системы.
Макрофаги являются важными клетками системы врожденного иммунитета,
выполняющими ряд функций, среди которых индукция иммунного ответа,
регенерация тканей и т.д. В зависимости от выполняемой функции различным
популяциям макрофагов присущи различные свойства [1]. Существует два типа
макрофагов: М1 и М2-поляризованные формы [2,3]. Образование оксида азота в
результате действия фермента индуцибельной NO-синтазы (iNOS), является одним
из ключевых факторов, позволяющих различить М1 и М2- поляризованные
макрофаги [3,4,8]. Оксид азота является эффекторной молекулой,
обуславливающей цитотоксичность М1-поляризованных макрофагов [2,3,5],
макрофаги М2 типа оксид азота не продуцируют [3,5].
Управление сигнальными путями, по которым образуются макрофаги М1
или М2 предоставит возможность манипулировать фенотипом и, прежде всего,
функцией макрофага при раке, направляя их в сторону предпочтительного М1-типа
и улучшения исхода заболевания.
Известно также, что образование NO в организме человека может
происходить посредством высвобождения этой молекулы из S-нитрозотиолов.
Считается, что S-нитрозотиолы являются донорами NO и играют важную роль при
транспортировке и выделении этой молекулы в организме человека [6–8].
Разнообразие биологических функций S-нитрозотиолов постоянно раскрывается.
Таким образом, механизм разложения S-нитрозотиолов имеет большое значение
для понимания биохимии организма человека.
Важным вопросом в этом является эффективная и быстрая система детекции
оксида азота или продуктов его окисления в виде нитрит-ионов, а также в виде его
субстратов S-нитрозотиолов, для фиксирования происходящих в клетке
изменений.
На сегодняшний день в литературе имеется достаточное количество методов
по определению нитрит-ионов. Однако, в биологических жидкостях их
определение затруднено в связи с мешающим влиянием компонентов матрицы. Что
касается S-нитрозотиолов, то до сих пор не существует золотого стандарта по
определению этих соединений в биологических объектах. Это связано с тем, что в
биологических средах количество нитрозотиолов варьируются от десятой нмоль до
менее десяти мкмоль в литре. Несмотря на обилие исследований в этой области,
представляется актуальным разработка новых, более простых и чувствительных
методов для мониторинга метаболитов и субстратов оксида азота в биологических
жидкостях.
На основании вышеизложенного, целью работы является исследование
физико-химических закономерностей окисления-восстановления нитрит-ионов и
S-нитрозотиолов на графитовом модифицированном электроде (ГМЭ) и разработка
вольтамперометрических методик их количественного определения.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие
задачи:
1. Изучить физико-химические закономерности влияния различных факторов
(рН фонового электролита, потенциала и времени накопления, скорости развертки
потенциала) на процесс электроокисления нитрит-ионов на ГМЭ;
2. Разработать вольтамперометрическую методику определения нитрит-
ионов как метаболитов оксида азота на ГМЭ для применения ее к биологическим
жидкостям. Оценить метрологические характеристики методики;
3. Изучить мешающее влияние компонентов биологической матрицы на
аналитический сигнал нитрит-ионов;
4. Провести сравнительное определение нитрит-ионов в надклеточных
жидкостях М1 и М2 поляризованных макрофагов вольтамперометрическим и
спектрофотометрическим методами;
5. Изучить физико-химические закономерности окисления-восстановления
S-Нитрозо-N-ацетилпеницилламин (SNAP) как представителя S-нитрозотиолов на
ГМЭ;
6. Разработать методику определения S-нитрозотиолов как субстратов оксида
азота для применения ее к биологическим жидкостям. Оценить метрологические
характеристики методики;
7. Провести сравнительное определение S-нитрозотиолов в крови человека
вольтамперометрическим и флуориметрическим методами.
Научная новизна.
1. Иcследованы закономерности электроокиcления нитрит-ионов на ГМЭ.
Разработан вольтамперометрический подход для экспрессного определения
нитрит-ионов как метаболитов оксида азота в макрофагах, выделенных из
моноцитов периферической крови человека.
2. Исследованы закономерности и предложен вероятный механизм
электровосстановления S-Нитрозо-N-ацетилпеницилламина на поверхности ГМЭ.
Показано, что процесс электровосстановления носит необратимый двухстадийный
характер. Лимитирующая стадия процесса характеризуется переносом первого
электрона.
3. Впервые разработан вольтамперометрический подход для экспрессного
определения S-нитрозотиолов в модельных средах как субстратов оксида азота на
ГМЭ. Проведена оценка метрологических характеристик методики. Разработанная
методика применена для определения S-нитрозотиолов в биологических
жидкостях.
Практическая значимость.
Разработанная вольтамперометрическая методика определения нитрит-
ионов на ГМЭ применена для их определения как NO-метаболитов в надклеточных
жидкостях макрофагов М1 и М2 типов. Проведена оценка метрологических
характеристик методики. Результаты исследования показали принципиальную
возможность использования разработанного вольтамперометрического метода для
оценки содержания нитрит-ионов в супернатантах культуры индуцированных
макрофагов для оценки их фенотипа.
Полученные результаты рекомендованы к применению в онкодиспансерах
для оперативного мониторинга терапии онкологических заболеваний по
содержанию NO-метаболитов в супернатантах моноцитов и макрофагов,
выделенных из периферической крови человека. Экономическая эффективность
внедряемой методики обусловлена простотой в использовании, низкой
себестоимостью анализа, экспрессностью и высокой чувствительностью.
Разработана вольтамперометрическая методика экспрессного определения S-
нитрозотиолов как субстратов оксида азота на ГМЭ, которая нашла применение
для количественного обнаружения этих соединений в биологических жидкостях.
Рассчитаны метрологические характеристики методики.
Положения, выносимые на защиту.
Результаты исследования влияния различных факторов (рН фонового
электролита, потенциала и времени накопления, скорости развертки) на процесс
электрохимического окисления нитрит-ионов на ГМЭ.
Результаты исследования влияния компонентов биологической матрицы на
электрохимическое окисление нитрит-ионов.
Вольтамперометрическая методика определения нитрит-ионов на ГМЭ
Метрологические характеристики методики.
Результаты исследования влияния различных факторов (рН фонового
электролита, потенциала и времени накопления, скорости развертки потенциала)
на процесс электрохимического восстановления S-Нитрозо-N-
ацетилпеницилламина как представителя S-нитрозотиолов на ГМЭ.
Вольтамперометрическая методика определения S-нитрозотиолов на ГМЭ в
модельных средах. Метрологические характеристики методики.
Степень достоверности и апробация результатов.
Результаты работы были представлены и обсуждались на XVIII
Международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых
имени профессора Л.П. Кулёва «Химия и химическая технология в XXI веке»
(Томск, 2017); VI Международной научной конференции «Теоретическая и
экспериментальная химия» (Караганда, 2017); XIX Международной научно-
практической конференции “Химия и химическая технология в XXI веке”
студентов и молодых ученых имени профессора Л.П. Кулёва (Томск, 2018); 17
Международной конференции по электроанализу (ESEAC 2018), (Родос, 2018); 14
Международной научной конференции «Современные методы аналитической
химии» (Прага, 2018); XX Международной научно-практической конференции
«Химия и химическая технология в XXI веке» студентов и молодых ученых имени
профессора Л.П. Кулёва (Томск, 2019); 7 Региональном симпозиуме по
электрохимии (RCE-SEE) и 8 симпозиуме Курта Швабе (Сплит, 2019); X
Международной научной конференции «Современные методы в теоретической и
экспериментальной химии» (Плес, 2019); 15 Международной научной
конференции «Современные методы аналитической химии», (Прага, 2019).
Публикации.
По результатам работы опубликовано 3 статьи в журналах, 2 из которых в
журнале, рекомендованном ВАК и входящем в базу данных Web of Science, и 1
статья в журнале 1 квартиля, индексируемом базой данных Scopus, а также 10
тезисов докладов.
Структура диссертации.
Диссертационная работа изложена на 122 страницах машинописного текста
и включает 23 рисунка, 63 таблицы и список литературы состоящий из 158
источников.
Личный вклад автора состоял в изучении и систематизации литературных
данных по методам выделения, определения NO-метаболитов и S-нитрозотиолов,
а также в проведении экспериментальных исследований и интерпретации
полученных данных.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ и ЧНФ в
рамках научного проекта № 19-53-26001; Госзадания «Наука» № 4.5752.2017;
Госзадания «Наука» № FSWW-2020-0022.