Изучение механизмов фотоактивации потенциал-зависимых флуоресцентных белков на основе археородопсина-3

Выпускная квалификационная работа посвящена определению механизма, отвечающего за потенциал-зависимость флуоресценции бактериального родопсина археородопсина-3 и его производных. Актуальность работы заключается в том, что археородопсин-3 и его производные, полученные путем внесения в белок аминокислотных замен, широко используются в оптогенетических исследованиях для визуализации активности нейронов, что возможно благодаря уникальным характеристикам флуоресценции данных белков, интенсивность которой зависит от величины мембранного потенциала клетки. Определение механизма, ответственного за потенциал-зависимость флуоресценции археородопсина-3 и его производных позволяет проводить рациональное конструирование новых производных археородопсина-3 с оптимальными для оптогенетических применений свойствами. В работе, которая была проведена с использованием как экспериментальных спектроскопических методов, биотехнологических методов и методов компьютерного моделирования, были получены следующие результаты – было определено состояния белка, фотоактивация которого приводит к возникновению флуоресцентного сигнала, были определены механизмы стабилизации данного состояния; был определен механизм, определяющий потенциал-зависимость флуоресценции белка.

Стр.

Введение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

Глава 1. Обзор литературы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.1 Структура бактериальных родопсинов. . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.2 Фотоизомеризация хромофора. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.3 Фотоцикл бактериородопсина. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.4 Исследование спектральных характеристик основного состояния
и интермедиатов фотоцикла бактериородопсина. . . . . . . . . . . 9
1.4.1 Спектры комбинационного рассеяния. . . . . . . . . . . . . 9
1.4.2 Спектры инфракрасного поглощения (ИК спектры). . . . . 13
1.4.3 Флуоресценция бактериородопсина. . . . . . . . . . . . . . 14
1.4.4 Сравнение фотоциклов бактериородопсина и
археородопсина-3. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
1.5 Характеристики флуоресценции археородопсина-3 и его
мутантных форм. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
1.6 Предложенные модели механизма потенциал-зависимости
флуоресценции археородопсина-3. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
1.7 Модификация стабильности О-состояния в бактериородопсине
путем введения аминокислотных замен. . . . . . . . . . . . . . . . 20

Глава 2. Методы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.1 Экспериментальные методы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.2 Теоретические методы. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.2.1 Получение трехмерных структур белков. . . . . . . . . . . 23
2.2.2 Расчет спектральных свойств. . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.2.3 Расчет pKa аминокислот. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.2.4 Расчет энергии Гиббса между состояниями белка. . . . . . 24

Глава 3. Результаты и обсуждение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
3.1 Анализ экспериментальных результатов. . . . . . . . . . . . . . . 27
3.2 Анализ результатов компьютерного моделирования. . . . . . . . . 38
Выводы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

Благодарности . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

Список литературы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

Приложение А. Праймеры для мутагенеза . . . . . . . . . . . . . . 54

Приложение Б. Использованные буферы . . . . . . . . . . . . . . . 55

Приложение В. Результаты секвенирваний . . . . . . . . . . . . . . 56

1. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial
rhodopsins / D. R. Hochbaum [и др.] // Nature methods. — 2014. — т. 11,
№ 8. — с. 825—833.
2. Zhang H., Cohen A. E. Optogenetic approaches to drug discovery in
neuroscience and beyond // Trends in biotechnology. — 2017. — т. 35, № 7. —
с. 625—639.
3. Optical recording of action potentials in mammalian neurons using a microbial
rhodopsin / J. M. Kralj [и др.] // Nature methods. — 2012. — т. 9, № 1. —
с. 90—95.
4. Microbial and animal rhodopsins: structures, functions, and molecular
mechanisms / O. P. Ernst [и др.] // Chemical reviews. — 2014. — т. 114,
№ 1. — с. 126—163.
5. Shim S., Dasgupta J., Mathies R. A. Femtosecond time-resolved stimulated
Raman reveals the birth of bacteriorhodopsin’s J and K intermediates //
Journal of the American Chemical Society. — 2009. — т. 131, № 22. — с. 7592—
7597.
6. Lanyi J. K. Proton transfer and energy coupling in the bacteriorhodopsin
photocycle // Journal of bioenergetics and biomembranes. — 1992. — т. 24,
№ 2. — с. 169—179.
7. Ames J. B., Mathies R. A. The role of back-reactions and proton uptake
during the N. fwdarw. O transition in bacteriorhodopsin’s photocycle: a kinetic
resonance Raman study // Biochemistry. — 1990. — т. 29, № 31. — с. 7181—
7190.
8. Alshuth T., Stockburger M. Structural changes in the retinal chromophore of
bacteriorhodopsin studied by resonance Raman spectroscopy // Berichte der
Bunsengesellschaft für physikalische Chemie. — 1981. — т. 85, № 6. — с. 484—
489.
9. Infrared and visible absolute and difference spectra of bacteriorhodopsin
photocycle intermediates / R. W. Hendler [и др.] // Applied spectroscopy. —
2011. — т. 65, № 9. — с. 1029—1045.
10. Lórenz-Fonfrıa V. A., Kandori H., Padrós E. Probing specific molecular
processes and intermediates by time-resolved Fourier transform infrared
spectroscopy: Application to the bacteriorhodopsin photocycle // The Journal
of Physical Chemistry B. — 2011. — т. 115, № 24. — с. 7972—7985.
11. Fourier transform infrared spectra of a late intermediate of the
bacteriorhodopsin photocycle suggest transient protonation of Asp-212 / A. K.
Dioumaev [и др.] // Biochemistry. — 1999. — т. 38, № 31. — с. 10070—10078.
12. Comparative studies of the fluorescence properties of microbial rhodopsins:
spontaneous emission versus photointermediate fluorescence / K. Kojima [и
др.] // The Journal of Physical Chemistry B. — 2020. — т. 124, № 34. —
с. 7361—7367.
13. Fluorescence spectra of bacteriorhodopsin and the intermediates O and Q at
room temperature / H. Ohtani [и др.] // FEBS letters. — 1995. — т. 359,
№ 1. — с. 65—68.
14. Ohtani H., Itoh H., Shinmura T. Time-resolved fluorometry of purple
membrane of Halobacterium halobium O640 and an O-like red-shifted
intermediate Q // FEBS letters. — 1992. — т. 305, № 1. — с. 6—8.
15. Fluorescence enhancement of a microbial rhodopsin via electronic
reprogramming / M. d. C. Marin [и др.] // Journal of the American
Chemical Society. — 2018. — т. 141, № 1. — с. 262—271.
16. Conformational changes in the archaerhodopsin-3 proton pump: detection of
conserved strongly hydrogen bonded water networks / E. C. Saint Clair [и
др.] // Journal of biological physics. — 2012. — т. 38, № 1. — с. 153—168.
17. Near-IR resonance Raman spectroscopy of archaerhodopsin 3: effects of
transmembrane potential / E. C. Saint Clair [и др.] // The Journal of Physical
Chemistry B. — 2012. — т. 116, № 50. — с. 14592—14601.
18. Screening fluorescent voltage indicators with spontaneously spiking HEK cells /
J. Park [и др.] // PloS one. — 2013. — т. 8, № 12. — e85221.
19. Directed evolution of a far-red fluorescent rhodopsin / R. S. McIsaac [и др.] //
Proceedings of the National Academy of Sciences. — 2014. — т. 111, № 36. —
с. 13034—13039.
20. Archaerhodopsin variants with enhanced voltage-sensitive fluorescence in
mammalian and Caenorhabditis elegans neurons / N. C. Flytzanis [и др.] //
Nature communications. — 2014. — т. 5, № 1. — с. 1—9.
21. Mechanism of voltage-sensitive fluorescence in a microbial rhodopsin / D.
Maclaurin [и др.] // Proceedings of the National Academy of Sciences. —
2013. — т. 110, № 15. — с. 5939—5944.
22. Electric-field-induced Schiff-base deprotonation in D85N mutant
bacteriorhodopsin / P. Kolodner [и др.] // Proceedings of the National
Academy of Sciences. — 1996. — т. 93, № 21. — с. 11618—11621.
23. Crystal structure of the D85S mutant of bacteriorhodopsin: model of an O-like
photocycle intermediate / S. Rouhani [и др.] // Journal of molecular biology. —
2001. — т. 313, № 3. — с. 615—628.
24. Specificity of anion binding in the substrate pocket of bacteriorhodopsin /
M. T. Facciotti [и др.] // Biochemistry. — 2004. — т. 43, № 17. — с. 4934—
4943.
25. Facciotti M. T., Rouhani S., Glaeser R. M. Crystal structures of bR (D85S)
favor a model of bacteriorhodopsin as a hydroxyl-ion pump // FEBS letters. —
2004. — т. 564, № 3. — с. 301—306.
26. Hydrogen bonding interactions with the Schiff base of bacteriorhodopsin.
Resonance Raman spectroscopy of the mutants D85N and D85A. / P. Rath [и
др.] // Journal of Biological Chemistry. — 1993. — т. 268, № 24. — с. 17742—
17749.
27. Crystal structure of the O intermediate of the Leu93→ Ala mutant of
bacteriorhodopsin / J. Zhang [и др.] // Proteins: Structure, Function, and
Bioinformatics. — 2012. — т. 80, № 10. — с. 2384—2396.
28. Tóth-Boconádi R., Keszthelyi L., Stoeckenius W. Photoexcitation of the
O-intermediate in bacteriorhodopsin mutant L93A // Biophysical journal. —
2003. — т. 84, № 6. — с. 3857—3863.
29. Static and time-resolved absorption spectroscopy of the bacteriorhodopsin
mutant Tyr-185. fwdarw. Phe: Evidence for an equilibrium between bR570
and an O-like species / S. Sonar [и др.] // Biochemistry. — 1993. — т. 32,
№ 9. — с. 2263—2271.
30. Fourier transform Raman spectroscopy of the bacteriorhodopsin mutant
Tyr-185. fwdarw. Phe: Formation of a stable O-like species during light
adaptation and detection of its transient N-like photoproduct / P. Rath [и
др.] // Biochemistry. — 1993. — т. 32, № 9. — с. 2272—2281.
31. FTIR difference spectroscopy of the bacteriorhodopsin mutant Tyr-185.
fwdarw. Phe: Detection of a stable O-like species and characterization of its
photocycle at low temperature / Y. He [и др.] // Biochemistry. — 1993. —
т. 32, № 9. — с. 2282—2290.
32. Existence of two O-like intermediates in the photocycle of Acetabularia
rhodopsin II, a light-driven proton pump from a marine alga / J. Tamogami
[и др.] // Biophysics and physicobiology. — 2017. — т. 14. — с. 49—55.
33. An assessment of water placement algorithms in quantum mechanics/molecular
mechanics modeling: the case of rhodopsins’ first spectral absorption band
maxima / D. M. Nikolaev [и др.] // Physical Chemistry Chemical Physics. —
2020. — т. 22, № 32. — с. 18114—18123.
34. Catalysis of Ground State cis to trans Isomerization of Bacteriorhodopsin’s
Retinal Chromophore by a Hydrogen-Bond Network / N. Elghobashi­
Meinhardt [и др.] // The Journal of membrane biology. — 2018. — т. 251,
№ 3. — с. 315—327.
35. Shibata M., Tanimoto T., Kandori H. Water molecules in the Schiff base region
of bacteriorhodopsin // Journal of the American Chemical Society. — 2003. —
т. 125, № 44. — с. 13312—13313.
36. Kandori H. Role of internal water molecules in bacteriorhodopsin //
Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics. — 2000. — т. 1460, №
1. — с. 177—191.
37. Shibata M., Kandori H. FTIR studies of internal water molecules in the Schiff
base region of bacteriorhodopsin // Biochemistry. — 2005. — т. 44, № 20. —
с. 7406—7413.
38. Photocycle of Sensory Rhodopsin II from Halobacterium salinarum (Hs SRII):
Mutation of D103 Accelerates M Decay and Changes the Decay Pathway of a
13-cis O-like Species / G. Dai [и др.] // Photochemistry and photobiology. —
2018. — т. 94, № 4. — с. 705—714.
39. Crystal structures of an O-like blue form and an anion-free yellow form of
pharaonis halorhodopsin / S. Kanada [и др.] // Journal of molecular biology. —
2011. — т. 413, № 1. — с. 162—176.
40. Structures of the archaerhodopsin-3 transporter reveal that disordering of
internal water networks underpins receptor sensitization / J. F. B. Juarez [и
др.] // Nature communications. — 2021. — т. 12, № 1. — с. 1—10.
41. AlignMe—a membrane protein sequence alignment web server / M. Stamm [и
др.] // Nucleic acids research. — 2014. — т. 42, W1. — W246—W251.
42. Zhang Y. I-TASSER server for protein 3D structure prediction // BMC
bioinformatics. — 2008. — т. 9, № 1. — с. 1—8.
43. Morozenko A., Stuchebrukhov A. Dowser++, a new method of hydrating
protein structures // Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. —
2016. — т. 84, № 10. — с. 1347—1357.
44. The ONIOM method and its applications / L. W. Chung [и др.] // Chemical
reviews. — 2015. — т. 115, № 12. — с. 5678—5796.
45. Gaussian 09w reference / A. Frisch [и др.] // Wallingford, USA, 25p. — 2009.
46. Neese F. The ORCA program system // Wiley Interdisciplinary Reviews:
Computational Molecular Science. — 2012. — т. 2, № 1. — с. 73—78.
47. PROPKA3: consistent treatment of internal and surface residues in empirical
p K a predictions / M. H. Olsson [и др.] // Journal of chemical theory and
computation. — 2011. — т. 7, № 2. — с. 525—537.
48. Chipot C., Pohorille A. Free energy calculations // Springer series in chemical
physics. — 2007. — т. 86. — с. 159—184.
49. Saint Clair E. C. FTIR difference and resonance raman spectroscopy of
rhodopsins with applications to optogenetics : дис. . . . канд. / Saint Clair
Erica C. — Boston University, 2013.
50. Characterization of the branched-photocycle intermediates P and Q of
bacteriorhodopsin / N. B. Gillespie [и др.] // The Journal of Physical
Chemistry B. — 2002. — т. 106, № 51. — с. 13352—13361.
51. Watanabe H. C., Ishikura T., Yamato T. Theoretical modeling of
the O-intermediate structure of bacteriorhodopsin // Proteins: Structure,
Function, and Bioinformatics. — 2009. — т. 75, № 1. — с. 53—61.