Идентификация и структурно-функциональный анализ генов, определяющих содержание аскорбиновой кислоты у дикорастущих и культивируемых видов томата

Характер накопления аскорбата по мере созревания плодов в образцах анализируемых видов томата
Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) было определено содержание аскорбата в тканях плода на четырёх стадиях его развития (завязавшийся плод (IG), зеленый плод финального размера (MG), бланжевый плод (Br), биологически спелый плод (RR)) у 28 образцов 11 видов томата. В отличие от известных данных по содержанию аскорбата в плодах отдельных образцов томата нескольких (обычно не более трех) видов (Hanson et at, 2004; Adalid et al, 2010), исследуемые в данной работе образцы охватывали все возможные морфофизиологические варианты растений томата. А именно, одновременно были использованы дикорастущие и культивируемые, красноплодные и зеленоплодные, самоопыляемые и перекрестноопыляемые виды. Это позволило провести поиск возможных корреляций между динамикой накопления аскорбата по мере созревания плода и отличительными признаками видов томата секции Lycopersicon.
В результате проведенного HPLC-анализа было показано, что у большинства исследуемых образцов дикорастущих и культивируемых томатов происходит увеличение содержания аскорбата в процессе развития плода, и наибольшее
количество аскорбиновой кислоты детектируется в плодах биологической спелости, что совпало с данными, полученными ранее (Gautier et al., 2008, Ioannidi et al., 2009). Для некоторых образцов дикорастущих видов S. chmielewskii, S. arcanum и S. peruvianum var. dentatum динамика была иная: изначально высокое содержание аскорбата в завязавшихся плодах падало по мере их созревания. Плоды сортов S. lycopersicum также значительно отличались как содержанием аскорбата на каждой из стадий созревания, так и динамикой его накопления по мере созревания: от плавного увеличения до скачкообразного роста на какой-либо из стадий. При этом содержание аскорбата на ранних стадиях развития плода (IG, MG) у сортов не было пропорционально его содержанию в спелом плоде. Так, в растущем плоде сортов Долгоносик и Красная красотка оно было приблизительно одинаково (24.6 и 21.9 мг/100г), тогда как в спелом плоде различалось почти в 4.5 раза (45 и 208 мг/100г). Следует отметить также значительный разброс в содержании аскорбата в спелых плодах образцов томата: от 0,3 мг/100г у образца S. habrochaites до 208 мг/100г у S. lycopersicum сорт Красная красотка.
В результате были выявлены образцы томата характеризующиеся наименьшим и наибольшим содержанием аскорбата в плоде биологической спелости. Минимальное количество аскорбата зарегистрировано у образцов S. habrochaites, S. arcanum и S. lycopersicum (сорта Викинг, Лонг Джон и Желтая белорусская). Максимальное содержание аскорбата выявлено в плодах образцов S. cheesmaniae, S. lycopersicum var. humboldtii и S. lycopersicum (сорта Де-Барао оранжевый, Красная красотка и Троя). Кроме того, в проанализированных сортах томата наблюдалась выраженная обратная корреляция между размером плода и концентрацией аскорбата. Исключением являлся крупноплодный томат сорта Красная красотка, концентрация аскорбата на стадии биологической спелости плода которого составила 208 мг/100г, что являлось наибольшим значением среди всех сортов. Однако у данного сорта имеются признаки замедления процесса разрушения хлорофилла по мере созревания плода, что может объяснить появление излишков аскорбата за счёт активности фотосинтезирующей системы.
2. Идентификация и характеристика новых генов-гомологов, играющих ключевые роли в метаболизме аскорбиновой кислоты у дикорастущих и
культурных видов томата.
На основе литературных данных были выбраны четыре гена, которые, как считается, играют ключевые роли в биосинтезе и регенерации аскорбата в клетках растений (Ioannidi et al., 2009; Zhang et al., 2011; Mounet-Gilbert et al., 2016). В список вошли три гена биосинтеза аскорбата пути Смирнофф-Уэлера (GDP- маннозофосфорилаза (GMP, VTC1), GDP-D-маннозо-3’5’-эпимераза (GME1) и GDP- L-галактозофосфорилаза (GGP, VTC2/VTC5) и ген аскорбат-глутатионового пути рециклинга аскорбиновой кислоты (дегидроаскорбатредуктаза (DHAR1)).
2.1. Характеристика новых генов-гомологов GME1, кодирующих GDP-D- маннозо-3’5’-эпимеразу у дикорастущих и культивируемых видов томата.
GDP-D-маннозо-3’5’-эпимераза (GME1) играет важную роль в накоплении аскорбата в листьях и зрелых плодах томата (Zhang et al., 2011). Данный фермент участвует в пятой ступени метаболического пути Смирнофф-Уэлера, осуществляя реакцию эпимеризации GDP-D-маннозы в GDP-L-галактозу (Smirnoff, 2018). В данной работе с использованием специально разработанных праймеров последовательности генов-гомологов GME1 были амплифицированы, клонированы и секвенированы у 11 культивируемых и дикорастущих видов томата. Последовательности были депонированы в NCBI (MK895092-MK895103) (табл.1).
Таблица 1. Характеристика идентифицированных генов-гомологов GME1 томата.
Количество SNPs в гене (*1) и замещений аминокислотных остатков в белке (*2) по сравнению с референсной последовательностью сорта Heinz 1706 [NM_001247914.2] из генбанка NCBI
Структурный анализ последовательностей идентифицированных генов- гомологов GME1 показал, что все они содержат 6 экзонов (рис.1). Длина гена варьирует от 1962 п.н. (S. galapagense) до 1985 п.н. (S. peruvianum VIR4361). Зависимости размера гена от эволюционного возраста видов томата (более древних зеленоплодных и более молодых красноплодных видов) выявлено не было.
Всего было обнаружено 136 SNPs (6.9% вариабельности; подсчеты проведены относительно референсной последовательности сорта Heinz 1706 [NM_001247914.2]): 134 SNPs у зеленоплодных и всего лишь пять – у красноплодных видов томата. Также были выявлены 5 SNPs (T294C, T738A, T783C, T1746A и C1967T), которые присутствовали только в последовательности GME1 самоопыляемых видов (S. lycopersicum, S. pimpinellifolium, S. pimpinellifolium var. racemigerum, S. cheesmaniae, S. galapagense и S. chmielewskii) (рис.1).

Рисунок 1. Экзон-интронная структура новых генов-гомологов GME1, кодирующих GDP-маннозо- 3′,5′-эпимеразу у видов томата. Цифры над геном соответствуют длинам экзонов, пн. Цифры снизу – длины интронов, п.н. Цвет шрифта соответствует цвету плода в биологической спелости.
В кодирующей последовательности идентифицированных гомологов GME1 было обнаружено 28 SNPs, два из которых – у красноплодных видов. Наибольшее количество замен присутствовало у образцов S. peruvianum (7- 8 SNPs), S. arcanum (12 SNPs) и S. neorickii (13 SNPs). Только две замены (G5A и G843C) оказались несинонимичными и были специфичны для зеленоплодных видов S. neorickii и S. peruvianum var. dentatum.
Полученные последовательности генов-гомологов GME1 были транслированы; длина всех белков составила 376 а.о., что соответствовало молекулярной массе 42 кДа. Только у двух зеленоплодных видов S. neorickii и S. peruvianum var. dentatum в белковых последовательностях присутствовали единичные замещения аминокислотных остатков – G2E и E281D, соответственно. С помощью программы PROVEAN был предсказан нейтральный характер данных замещений, что предполагает отсутствие их влияния на ферментативную активность GME1. Это косвенно подтверждается тем, что корреляции между данными замещениями и содержанием аскорбата обнаружено не было как в спелых, так и в растущих плодах. Кроме того, плоды обоих образцов (S. neorickii и S. peruvianum) существенно не отличались от плодов других анализируемых образцов томата по содержанию аскорбата и динамике его накопления.
2.2 Характеристика новых генов-гомологов GDP-L-галактозофосфорилазы GGP (VTC2) дикорастущих и культивируемых видов томата
Ранее было показано, что сверхэкспрессия гена GGP приводит к повышению уровня аскорбата в 2-6 раз у таких растений как картофель, клубника, Arabidopsis thaliana, рис (Bulley et al., 2009, 2012; Zhou et al. 2012; Ali et al. 2019). В данной работе были впервые идентифицированы (амплифицированы, клонированы и
секвенированы) полноразмерные гены-гомологи GGP у 11 видов томата. Полученные последовательности были депонированы в базу данных NCBI (MH337798-MH337809) (табл. 2).
Таблица 2. Характеристика идентифицированных генов-гомологов GGP томата.
Количество SNPs в гене (*1) и замещений аминокислотных остатков в белке (*2) по сравнению с референсной последовательностью сорта Heinz 1706 [NM_001247914.2] из генбанка NCBI
Протяжённость полученных последовательностей генов-гомологов GDP-L- галактозофосфорилазы варьировала между генотипами и составляла от 2550 пн. (у S. peruvianum VIR4361) до 2560 пн. (S. cheesmaniae и S. galapagense) (рис. 2).
Рисунок 2. Экзон-интронная структура новых генов-гомологов GDP-L-галактозофосфорилазы (GGP) видов томата. Цифры над геном соответствуют длинам экзонов, пн. Цифры снизу – длины интронов, п.н. Цвет шрифта соответствует цвету плода в биологической спелости.
Всего в анализируемых последовательностях генов-гомологов GGP был выявлено 251 SNPs; общий уровень вариабельности составил 9.81% (относительно

референсной последовательности сорта Heinz 1706 [NM_001247914.2]). Большая часть SNPs (167) локализовалась в интронах.
В экзонах было выявлено 84 SNPs, 29 из которых оказались несинонимичными и приводили к замещению аминокислотных остатков в кодируемых белках. Наиболее вариабельным кодирующим фрагментом оказался участок экзон III – экзон VII.
В ходе анализа вариабельности последовательностей GGP были обнаружены 16 нуклеотидных замен, коррелировавших со способом опыления (само- или перекрёстноопыляемые) видов: экзон I – C71G; интрон I – T160A; экзон II – C269T; интрон III – C549T, G699A, A865G, A963T, A1195G; экзон IV – С1272T, T1301G; интрон V – С1741T; экзон VI – G2091A; интрон VI – С2196T, G2209A; экзон VII – G2237A, C2549T (рис. 3). У зеленоплодных видов помимо единичных нуклеотидных замен GGP последовательности содержали 21 индель, тогда как у эволюционно более молодых красноплодных видов было выявлено всего два инделя в интроне III.
Рисунок 3. Вариабельные сайты в аминокислотной последовательности GGP. Красными стрелками отмечены радикальные замещения, предсказанные программой PROVEAN, предположительно приводящие к изменению конформации белка. Синей стрелкой обозначено замещение А24G, коррелирующее с цветом плода. Цвет шрифта соответствует цвету плода в биологической спелости.
Экзонные последовательности генов-гомологов GGP были транслированы и проанализированы in silico. Все кДНК имели одинаковую рамку считывания и кодировали белки длиной 437 а.о., что соответствует белку молекулярной массой 48 кДа. Анализ аминокислотных последовательностей гомологов GGP исследуемых видов томата и других видов растений в программе MEME 5.3.2 (Bailey et al, 2009) выявил 10 консервативных консенсусных последовательностей длиной от 5 – 49 а.о. (рис. 4).
Показано, что N-концевой мотив (1-50 а.о.) GGP является консервативным только для видов рода Solanum. Интересно, что второй мотив (63-77 а.о.) оказался

консервативным для видов Solanum и A. thaliana, однако отсутствовал у Capsicum annuum (перец овощной), который, как и томат, относится к семейству Solanaceae. Кроме того, в гомологе GGP перца также отсутствовал внутренний мотив (269-309 а.о.), присутствующий у всех анализируемых видов. C-концевой мотив (385-434 а.о.) был выявлен только у GGP видов подрода Solanoideae (рис.4).
Рисунок 4. Схематическое отображение консервативных мотивов в аминокислотной структуре GGP, определенных с использованием программы МЕМЕ5.3.2
Ранее было показано, что ген GDP-L-галактозофосфорилазы выполняет не только ферментативную, но и регуляторную функцию. В 5’-upstream области гена GGP расположена открытая рамка считывания (uORF), которая индуцируется высокой концентрацией аскорбата и регулирует трансляцию GGP (Laing et al, 2015; Li et al, 2018; Zhang et al, 2018).
Поэтому дополнительно у исследуемых 12 образцов томата с
специально разработанных пар праймеров были амплифицированы и секвенированы
помощью
последовательности
5’-UTR
-uORF генов-гомологов GGР длиной 183 п.н., которые
затем были транслированы (рис. 5). Проведенный анализ полученных
последовательностей показал отсутствие полиморфизмов в области uORF у видов
томата как с высоким (S. pimpinellifolium var. racemigerum и S. cheesmaniae), так и с
низким (S. habrochaites и S. arcanum) содержанием аскорбата в спелых плодах.
Можно предположить, что uORF у видов томата не осуществляет обратный
контроль биосинтеза аскорбата, либо может активироваться при резком росте
содержания аскорбата, выявляемом в стрессовых условиях. Исследование
механизма регуляции экспрессии GGP у томата посредством uORF требует
дополнительных транскриптомных и протеомных исследований.
Рисунок 5. Пептидные последовательности, кодируемые неканонической uORF в 5’-UTR генов- гомологов GGP. Красными рамками выделены участки, консервативные у большинства видов растений
2.3 Характеристика новых генов-гомологов GDP-манноза пирофосфорилазы (GMP) дикорастущих и культивируемых видов томата
В настоящей работе были идентифицированы полноразмерные последовательности 12 генов-гомологов GMP у 11 видов томата (табл. 3). Протяженность полученных последовательностей составила от 1605 п.н. до 1619 п.н. Длина данного гена у S. lycopersicum сорта Силвестре рекордо составила 1619 п.н. и была равна последовательности GMP S. lycopersicum сорта Heinz 1706. Гомологичный ген GMP картофеля (S. tuberosum) имеет размер 1659 п.н., в то время как у A. thaliana гомологичный ген CYT1 значительно короче (1340 п.н.) за счет интронных делеций.
Таблица 3. Характеристика идентифицированных генов-гомологов GMP томата.
Количество SNPs в гене (*1) и замещений аминокислотных остатков в белке (*2) по сравнению с референсной последовательностью сорта Heinz 1706 [NM_001247914.2] из генбанка NCBI
Различия в длинах генов-гомологов GMP исследуемых образцов томата обусловлены наличием мелких инсерций и делеций в интронах. Все кодирующие

последовательности одинаковы по размеру (1085 п.н.) и структуре (содержат четыре экзона, как и ген GMP картофеля) (рис. 6).
Рисунок 6. Экзон-интронная структура новых генов-гомологов GDP-манноза пирофосфорилазы (GMP) видов томата. Цифры над геном соответствуют длинам экзонов, п.н. Цифры снизу – длины интронов, п.н. Цвет шрифта соответствует цвету плода в биологической спелости.
Всего в анализируемых последовательностях GMP выявлено 75 SNPs; общий уровень вариабельности составил 4.6% (относительно референсной последовательности сорта Heinz 1706 [NM_001247914.2]). Большая часть замен (49 SNPs) локализовалась в интронах, тогда как в экзонах полиморфных сайтов было в два раза меньше – 26 SNPs.
Как и в случае GME1 и GGP, вариабельность исследуемых генов-гомологов GMP достигалась в основном за счет полиморфных сайтов и инделей в последовательностях GMP зеленоплодных видов томата. Так, из 75 вариабельных сайтов 63 SNPs были найдены у зеленоплодных видов, в то время как у красноплодных видов их в 5 раз меньше (12 SNPs). Также, только у самоопыляемых видов томата в области интрона III GMP была обнаружена замена С904Т. Наиболее вариабельным оказался интрон I.
Длина аминокислотной последовательности GMP у всех видов томатов составила 361 а.о., что соответствует белку с молекулярной массой около 39 кДа. Из 12 SNPs, детектированных в экзонах, три приводили к замещениям аминокислотных остатков: A93T у красноплодного вида S. pimpinellifolium var. racemigerum, D99N у S. galapagense и G102A у S. neorickii. Все эти замещения расположены в одном консервативном мотиве протяжённостью 76-125 а.о., выявленном с помощью программы MEME 5.3.2. При построении пространственной 3D структуры (программа Phyre2) с вероятностью более 90% было предсказано, что в позиции 103–118 а.о. находится трансмембранная спираль, входящая в NTP-трансферазный домен (протяжённость 2-229 а.о.) (Jensen et al, 1998). Таким образом, все три замещения расположены перед трансмембранной спиралью и, вероятно, не влияют на её структуру.

2.4 Характеристика новых генов-гомологов дегидроаскорбатредуктазы DHAR1 дикорастущих и культивируемых видов томата
Дегидроаскорбатредуктаза (DHAR1) является одним из двух основных ферментов, участвующих в аскорбат-глутатионовом пути рециклинга аскорбиновой кислоты. В данной работе были впервые идентифицированы (клонированы и секвенированы) гены-гомологи DHAR1 у 11 видов томата. Полученные последовательности были депонированы в базу данных NCBI (табл. 4).
Таблица 4. Характеристика идентифицированных генов-гомологов DHAR1 видов томата.
Количество SNPs в гене (*1) и замещений аминокислотных остатков в белке (*2) по сравнению с референсной последовательностью сорта Heinz 1706 [NM_001247914.2] из генбанка NCBI
У всех 11 проанализированных генотипов видов томата ген содержал 6 экзонов и имел размер от 3859 (S. galapagense) до 4111 п.н. (S. peruvianum var. dentatumVIR3966) (рис.7).
Рисунок 7. Экзон-интронная структура новых генов-гомологов дегидроаскорбатредуктазы DHAR1 видов томата. Цифры над геном соответствуют длинам экзонов, пн. Цифры снизу – длины интронов, п.н. Цвет шрифта соответствует цвету плода в биологической спелости.

Длина кДНК DHAR1 для всех анализируемых образцов томата инвариабельна и составила 633 п.н., в то время как у видов других семейств размеры кДНК гена были намного больше. Например, длина кДНК DHAR1 арабидопсиса -1221 п.н, кукурузы – 2085 п.н, сои – 3206 п.н, риса – 3539 п.н.
Анализ полиморфизма последовательности генов-гомологов DHAR1 позволил выявить 554 SNPs, что указывает на достаточно высокий для генов растений уровень вариабельности (14,2%) и значительно превосходящий полиморфизм анализируемых генов биосинтеза аскорбата у видов томата.
Как ожидалось, полиморфизм генов гомологов DHAR1 у зеленоплодных видов томата более чем в три раза превосходил вариабельность гена у образцов красноплодных видов: 479 (87%) SNPs vs. 75 (13%).
В ходе анализа идентифицированных последовательностей генов-гомологов DHAR1 было обнаружено 85 инделей в интронной области. Большинство протяженных инсерций были свойственны для зеленоплодных образцов. Самая протяженная вставка длиной 839 п.н. располагалась в области I интрона у образцов S. habrochaites.
Транслируемый белок DHAR1 всех анализируемых образцов состоял из 210 а.о. (23 кДа). В кДНК генов-гомологов DHAR1 было выявлено 53 нуклеотидных замен, включая 24 несинонимичных (соответствующие замещения аминокислотных остатков приведены на рис. 8). Это согласуется с ранее полученными данными о том, что SNPs, встречающиеся в экзонных последовательностях генов, в 45% случаев являются несинонимичными (The 100 Tomato Genome Sequencing Consortium, 2014). Подавляющее количество радикальных замещений аминокислотных остатков было видоспецифично и присуще зеленоплодным образцам (рис. 8).
Рисунок 8. Вариабельные сайты в аминокислотной последовательности DHAR1. Красными стрелками отмечены радикальные замещения, предположительно приводящие к изменению конформации белка. Цвет шрифта соответствует цвету плода в биологической спелости.

Анализ аминокислотной последовательности с использованием программы UniProt выявил в структуре гомологов DHAR1 два глутатион-N-трансферазных домена с N- и С-терминальной активностью в позициях 10-88 а.о и 66-210 а.о., соответственно. Алгоритм программы PROVEAN предсказал наличие 13 радикальных замещений аминокислотных остатков, которые могут оказывать влияние на конформацию, а значит, возможно, и на активность белка. Четыре из этих замещений находятся в N-терминальном домене, остальные – в С- терминальном домене. Кроме того, согласно модели активных сайтов для связывания субстрата (Do et al., 2016), мы можем предположить, что замещение F103L у DHAR1 S. peruvianum var. dentatum может вносить изменение в аскорбат- связывающий и GSH-связывающий сайты. Таким образом, с высокой степенью вероятности можно ожидать изменения концентрации аскорбиновой кислоты в образце S. peruvianum var. dentatum в условиях стресса, в силу возможного изменения ферментативной активности продукта гена DHAR1.
3. Анализэкспрессииновыхгенов-гомологовGMP,GME1,GGPиDHAR1 3.1 Сравнительный межвидовой органоспецифический анализ экспрессии
генов биосинтеза и рециклинга аскорбата
Для определения органоспецифичной экспрессии исследуемых генов метаболизма аскорбиновой кислоты был проведен сравнительный анализ транскрипции GGP, GME1, GMP и DHAR1 в четырех различных органах (корень, лист, цветок и плод в биологической спелости) трех образцов (культивируемого красноплодного (S. lycopersicum) и дикорастущих зеленоплодных (S. peruvianum, S. habrochaites) видов томата.
Рисунок 9. Анализ экспрессии генов биосинтеза и рециклинга аскорбата GMP, GME1, GGP и DHAR1 в различных органах трёх видов томата (S. lycopersicum. S. peruvianum, S. habrochaites). К – корень, Л – лист, Ц – цветок, П – плод в биологической спелости.

3.2. Анализ зависимости количества аскорбата и уровня экспрессии генов в плодах дикорастущих видов и сортов томата на стадии биологической
спелости
Для определения зависимости содержания аскорбата от уровня экспрессии исследуемых генов его метаболизма был проведен анализ транскрипции генов GGP, GME1, GMP и DHAR1 в плодах биологической спелости 10 сортов S. lycopersicum, дикорастущего образца S. lycopersicum var. humboldtii и образца зеленоплодного вида S. peruvianum (VIR4361). Согласно данным биохимического анализа, данные образцы характеризуются наиболее высоким и наиболее низким содержанием аскорбата (табл. 5).
Сопоставление результатов биохимического и экспрессионного анализов выявило отсутствие строгой корреляции количества транскриптов GGP/ GME1 / GMP / DHAR1 с конечным содержанием аскорбата в спелом плоде (табл. 5).
Таблица 5. Зависимость количества аскорбата в плодах биологической спелости от уровня экспрессии генов метаболизма аскорбата.
На основе полученных результатов было предположено, что на конечное содержание аскорбата в спелом плоде томата определяющее влияние может оказывать не интенсивность экспрессии генов биосинтеза и рециклинга аскорбата на последней стадии созревания плода, а то, насколько активны были данные гены на более ранних этапах развития плода. Поэтому у исследуемого набора видов и сортов томата была также оценена экспрессия генов GGP, GME, GMP и DHAR1 на стадиях формирования плода, его роста и перехода к созреванию.

3.3. Анализ зависимости количества аскорбата и уровня экспрессии генов биосинтеза и рециклинга аскорбата в процессе созревания плодов у
дикорастущих образцов и сортов томата
Набор выбранных для экспрессионного анализа образцов включал три сорта S. lycopersicum, характеризующиеся различным содержанием аскорбата на этапах созревания плода (сорт Хохлома – низкое содержание; сорт Силвестре рекордо – среднее содержание; сорт Де-Барао – высокое содержание), а также образцы дикорастущего подвида томата овощного S. lycopersicum var. humboldtii (содержание аскорбата высокое) и дикорастущего вида S. peruvianum (VIR4361) (содержание аскорбата среднее) (рис.10).
Проведённый биохимический анализ показал, что у всех выбранных образцов видов и сортов томата по мере развития плода происходит последовательное накопление аскорбата, которое достигает максимума в спелых плодах (рис.10).
Рисунок 10. Результаты сравнительного межвидового и межсортового анализа содержания аскорбата и экспрессионных паттернов анализируемых генов в плодах томата по мере их созревания. а) морфология исследуемых плодов томата; б) содержание витамина С в плодах; экспрессии генов: DHAR1 (в); GME1 (г); GMP (д); GGP (е) в динамике формирования плода. IG – завязавшийся плод; MG – зеленый плод финального размера; Br – бланжевый плод; RR – плод в биологической спелости

У красноплодных образцов томата овощного была выявлена обратная корреляция между уровнем экспрессии DHAR1 и накоплением аскорбата в спелых плодах томата. Вполне возможно, что такая зависимость является следствием деградации хлорофилла по мере созревания плодов томата (Schouten et al., 2014).
Для гена GME1 не было выявлено единого профиля экспрессии у тестируемых образцов томата. Тем не менее, у большинства образцов наибольшее количество транскриптов было детектировано в завязавшемся плоде (стадия IG) с постепенным снижением уровня экспрессии к стадии биологической спелости.
Для двух других исследуемых генов GDP-маннозофосфорилазы (GMP) и GDP- галактозофосфорилазы (GGP) связи между экспрессионными паттернами и накоплением аскорбата в плодах найдено не было.
4. Заключение
1. Определены и охарактеризованы полноразмерные последовательности гомологов ключевых генов L-галактозного пути биосинтеза и рециркуляции аскорбата GGP, GME, GMP и DHAR1 у 11 образцов дикорастущих и культивируемых видов томата (Solanum секция Lycopersicon), различающихся содержанием витамина С в плодах. Выявлен крайне низкий уровень полиморфизма кодирующих последовательностей (GME1 – 0.25%; GGP – 1.3%; GMP – 0.7% и DHAR1 – 0.18%) у красноплодных образцов (S. pimpinellifolium, S. cheesmaniae, S. galapagense S. lycopersicum). У более древних зеленоплодных образцов (S. chmielewskii, S. chilense, S. corneliomulleri, S. pennellii, S. peruvianum, S. arcanum, S. habrochaites) обнаружен значительно более высокий уровень вариабельности (GME1 – 6.9%; GGP – 8.8%; GMP – 3.8% и DHAR1 – 1.18%). Показано, что у 17 сортов томата овощного S. lycopersicum кодирующие последовательности анализируемых генов-гомологов инвариантны.
2. Определена динамика накопления аскорбиновой кислоты по мере созревания плодов у 30 образцов дикорастущих и культивируемых видов и сортов томата. Показано, что у зеленоплодных видов накопление аскорбата по мере созревания плодов имеет видоспецифичный характер, в то время как у красноплодных томатов наблюдается общая динамика увеличения концентрации аскорбата по мере созревания плода.
3. Не выявлено зависимости между полиморфизмом генов GME1, GMP, GGP и DHAR1 и содержанием аскорбата в спелых плодах томата.
4. Охарактеризован профиль транскрипции генов DHAR1, GME1, GMP и GGP в различных органах (лист, корень, цветок, зелёный плод, плод биологической спелости) трех видов томата (S. lycopersicum. S. peruvianum и S. habrochaites). Максимальный уровень экспрессии выявлен в листьях, самый низкий – в зрелых плодах. Показан высокий уровень транскрипции генов GME1, GMP и GGP в цветках зеленоплодного дикорастущего вида S. habrochaites.
5. Обнаружено отсутствие корреляции между количеством аскорбата в спелом плоде томата и уровнем экспрессии генов как биосинтеза аскорбата (GME1, GMP и GGP), так и восстановления окисленного аскорбата (DHAR1).
6. Охарактеризован профиль транскрипции генов DHAR1, GME1, GMP и GGP в динамике развития плода (завязавшийся плод, растущий плод, бланжевый плод, плод в биологической спелости) у образцов томата, контрастных по уровню аскорбата в спелых плодах. Выявлены:
 обратная зависимость между уровнем экспрессии гена DHAR1 и концентрацией аскорбата в плодах красноплодных видов томата;
 различия в профилях экспрессии гена GME1: у большинства образцов уровень экспрессии гена максимален на ранней стадии развития плодов с постепенным снижением уровня экспрессии к стадии биологической спелости;
 отсутствие корреляции между уровнями экспрессии генов GGP и GMP и содержанием аскорбата на четырёх стадиях развития плода у всех анализируемых образцов томата.