Молекулярно-генетическая диагностика лице-лопаточно-плечевой миодистрофии Ландузи-Дежерина
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы исследования
Степень разработанности темы
Цель и задачи исследования
Научная новизна
Теоретическая и практическая значимость работы
Методология и методы исследования
Положения, выносимые на защиту
Степень достоверности результатов
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Апробация работы
Личное участие автора в выполнении исследования
Публикации
Объем и структура работы
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Повторяющиеся последовательности генома, их вовлеченность в
развитие патологических состояний
1.2 Клиническая характеристика миодистрофии Ландузи-Дежерина
1.2.1 Клинические проявления
1.2.2 Морфологические изменения
1.3 Классификация и молекулярно-генетические механизмы развития МЛД 18
1.3.1 Этиопатогенез МЛД 1 типа
1.3.2 Этиопатогенез МЛД 2 типа
1.4 Современные методики молекулярно-генетической диагностики МЛД
1.4.1 Гибридизация по Саузерну
1.4.2 Метод молекулярного комбинга
1.4.3 Методы, основанные на использовании ПЦР
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Материалы исследования
2.2 Методы исследования
2.2.1 Выделение геномной ДНК из лимфоцитов крови
2.2.2 Проведение рестрикции геномной ДНК в агарозных блоках
2.2.3 Проведение пульс-электрофореза фрагментов геномной ДНК
2.2.4 Подбор праймеров
2.2.5 Методика определения числа макросателлитных повторов D4Z4
методом количественной ПЦР
2.2.6 Гаплотипирование аллелей массивов D4Z4 с помощью аллель-
специфичной ПЦР-системы
2.2.7 Трансформация E.coli контрольными генетическими конструкциями
с известной длиной массивов D4Z4
2.2.8 Выделение контрольных генетических конструкций С85 и λ260201
из E. coli
2.2.9 Выделение ПЦР продуктов из геля
2.2.10 Секвенирование по Сенгеру
2.2.11 Проведение гибридизации по Саузерну
2.2.12 Молекулярный комбинг
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Разработка методики диагностики МЛД
3.1.1 Разработка ПЦР-системы для специфичной амплификации D4Z4
повторов хромосомы 4
3.1.2 Оптимизация условий пульс-электрофореза рестрицированной
геномной ДНК
3.1.3 Подбор условий для проведения количественной ПЦР на матрице
геля после пульс-электрофореза
3.1.4 Гаплотипирование аллелей массивов D4Z4
3.2 Валидация разработанной методики диагностики МЛД1
3.2.1 Анализ образцов геномной ДНК с помощью гибридизации по
Саузерну
3.2.2 Анализ образцов геномной ДНК с помощью молекулярного
комбинга
3.2.3 Сравнение результатов диагностики МЛД, полученными с
использованием разных методик
3.2.4 Сравнение результатов гаплотипирования образцов ДНК
3.2.5 Анализ представленности пермиссивных аллелей массивов D4Z4 в
группе обследованных индивидов
3.3 Алгоритм молекулярно-генетической диагностики МЛД1
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЯ
Приложение 1. Пример клинического случая МЛД1 с ранним вариантом
дебюта
Приложение 2. Пример клинического случая МЛД1 с классическим
вариантом дебюта
Приложение 3. Пример клинического случая МЛД1 с поздним вариантом
дебюта
Приложение 4. Результаты диагностики МЛД1 для пациента с одним
укороченным аллелем массива повторов D4Z4 четвертой хромосомы
Приложение 5. Результаты диагностики МЛД1 для пациента с двумя
укороченными аллелями массива повторов D4Z4 четвертой хромосомы
Приложение 6. Результаты диагностики МЛД1 у пациента без укороченных
аллелей
Приложение 7. Таблица с результатами диагностики МЛД1 методиками
гибридизации по Саузерну, молекулярного комбинга и количественной
ПЦР с агарозным гелем
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
МЛД – миодистрофия Ландузи-Дежерина;
ПЦР – полимеразная цепная реакция;
SNP – single nucleotide polymorphism
STR – short tandem repeats;
SSLP – simple sequence length polymorphism;
CNV – copy number variation;
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота;
РНК – рибонуклеиновая кислота;
т.п.н. – тысяч пар нуклеотидов;
ПГТ – предимплантационное генетическое тестирование.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
В первой части обзора представлены современные представления о
повторяющихся последовательностях генома и их вовлеченности в развитие
патологических состояний. Во второй части рассматриваются клинические проявления и
морфологические изменения, сопровождающие рассматриваемую патологию. В третьей
части приведены варианты классификаций, основанные на клинических и молекулярно-
генетических особенностях отдельных типов миодистрофии Ландузи-Дежерина. В
заключительной части обсуждаются вопросы молекулярно-генетической диагностики
различных типов миодистрофии Ландузи-Дежерина.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы исследования
Пациенты и их родственники для проведения молекулярно-генетического
исследования направлялись из научно-консультативного отдела ФГБНУ «МГНЦ», а
также региональных отделений медико-генетического консультирования. Выборка
пациентов и их фенотипически здоровых родственников сформирована в период с 2012
по 2021 гг. Объем выборки пациентов составил 129 индивидов, объем выборки
фенотипически здоровых родственников составил 47 индивидов.
Методы исследования
Выделение геномной ДНК из лимфоцитов крови проводилось методом фиксации
лимфоцитов в агарозных блоках с последующей депротеинизацией, что позволяло
минимально фрагментировать ДНК.
Проведение рестрикции геномной ДНК осуществлялось непосредственно в
агарозных блоках, что также позволяло минимизировать фрагментацию нитей ДНК. Для
рестрикции использовались следующие варианты сочетания эндонуклеаз: EcoRI/HindIII
и EcoRI/AvrII, а также единичные эндонуклеазы EcoRI, HindIII, XapI.
Проведениепульс-электрофорезарестрицированнойгеномной ДНК
осуществлялось в электрофорезной камере с гексогональным электродом «Gene
Navigator» (Pharmacia Biotech, Sweden), источник питания «2301 MacroDrive 1 Power
Supply» (LKB Bromma, Stockholm, Sweden); пульсация задавалась с помощью блока
управления «2015 Pulsaphor Plus Control Unit» (LKB Bromma, Stockholm, Sweden);
температура в электрофорезной камере поддерживалась при помощи «2219-001
Multitemp II Thermostatic Circulator» (LKB Bromma, Stockholm, Sweden).
Подбор праймеров. При дизайне праймеров использовано программное
обеспечение Oligo 7. В качестве референсных использованы последовательности
GeneBank: AF117653.3 и AY028079.1 относящиеся к хромосомам 4q35 и 10q26
соответственно.
Определения числа макросателлитных повторов D4Z4 методом количественной
ПЦР проводилась в приборе «Step One Plus» (Applied Biosystems, Foster City, USA). Для
специфичной амплификации последовательностей D4Z4 хромосомы 4 использованы
следующая пара праймеров: Rep1,5F 5’-GTGCTTGCGCCACCCACGT-3’, Rep1R 5’-
GCCGCGCGGAGGCGGAG-3’ в сочетании с ДНК-зондом zond2Rep1 5’FAM-
AGTCCGTGGTGGGGCTGGGG-BHQ1 3’. Количественная ПЦР проводилась в двух
технических повторностях для каждого фрагмента геля. Средние значения пороговых
циклов каждого фрагмента геля обрабатывались в программе Microsoft Excel. Обсчет
данных ПЦР осуществлялся методом 2−ΔΔCt.
Гаплотипирование аллелей массивов D4Z4 с помощью аллель-специфичной ПЦР-
системы. Фрагмент геля, содержащий таргетный аллель, использовали в качестве
матрицы для ПЦР-гаплотипирования. Для определения гаплотипа интересующего аллеля
оптимизирована ранее описанная аллель-специфичная ПЦР-система (Papanikos F. Et al.,
2014).
Выделение ПЦР продуктов из геля. Для выделения ДНК из геля использовалась
коммерческая система Cleanup Standard (Евроген, Москва, Россия), в соответствии с
протоколом производителя.
Секвенирование по Сенгеру. Двунаправленное автоматическое прямое
секвенирование по Сенгеру осуществлялось лабораторией ЗАО «Евроген» (Москва,
Россия). Для анализа хроматограмм сиквенса использовано программное обеспечение
«Finch TV 1.4.0» (Geospiza Inc., WA, USA).
Проведение гибридизации по Сузерну. Для определения количества D4Z4 повторов
методом Саузерн-блоттинга использовался стандартный протокол диагностики (Stefan J.
et al., 2017).
Проведение молекулярного комбинга. Исследование образцов геномной ДНК
методикой молекулярного комбинга осуществлялось на коммерческой платформе
«FiberVision® Molecular Combing Platform» (Genomic Vision, France) на базе лаборатории
генетики человека Лейденского университета, Нидерланды, в соответствии с протоколом
производителя.
Статистическая обработка данных. Статистическая оценка различий частот
укороченных аллелей массивов D4Z4 хромосомы 4 в зависимости от пола в группах
пациентов и их фенотипически здоровых родственников проводилась с использованием
критерия χ2. Сборка таблиц и построение гистограмм проводилась в программе Microsoft
Exсel.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Разработка ПЦР-системы для специфичной амплификации D4Z4 повторов
хромосомы 4
Для специфичной амплификации D4Z4 повторов четвертой хромосомы
разработана ПЦР-система, специфичность которой достигается за счет наличия двух
последовательных 6-ти нуклеотидных повторов присутствующих на четвертой
хромосоме. Данный участок комплементарен реверсному праймеру. В свою очередь
десятая хромосома имеет только один такой 6-ти нуклеотидный повтор, что исключает
возможность ее амплификации в ходе ПЦР (рис. 1). Секвенирование референсных космид
λ260201, С85 и геномной ДНК подтвердили данную разницу в нуклеотидной
последовательности между 4 и 10 хромосомами (рис. 1, 2). Схема расположения
праймеров и флуоресцентного зонда представлены на рис. 3.
Рисунок 1. Сравнение референсных последовательностей D4Z4 хромосом 4 и 10.
Примечание: А – фрагмент выравнивания последовательности D4Z4 хромосомы 4
(AF117653.3) против референсной последовательности хромосомы 10 (AY028079.1).
Пунктиры в последовательности хромосомы 10 демонстрируют 6-ти нуклеотидную
делецию. Б – хроматограмма сиквенса ПЦР-продуктов (пара праймеров Rep1F и
Rep1R1seq), полученных с использованием космид λ260201 и С85, демонстрирует
специфичность 6-ти нуклеотидной делеции для последовательности 10 хромосомы (С85).
В синие прямоугольники выделены 6-ти нуклеотидные полиморфные участки.
Рисунок 2. Сиквенсограмма участка 6-ти нуклеотидного полиморфизма
последовательностей D4Z4, полученная с матрицы геномной ДНК.
Примечание:Верхняянуклеотиднаяпоследовательность соответствует
последовательности повторов D4Z4 хромосомы 4. В синие прямоугольники выделены
последовательности 6-ти нуклеотидных повторов хромосомы 4. Нижняя нуклеотидная
последовательность соответствует последовательности D4Z4 хромосомы 10. Серыми
пунктирными линиями сопоставлены идентичные участки последовательностей
хромосом 4 и 10. Минорные пики хроматограммы соответствуют нуклеотидной
последовательности 10-й хромосомы.
Рисунок 3. ПЦР-система для специфичной амплификации D4Z4 повторов
хромосомы 4.
Примечание: Последовательности форвардного праймера (Rep1.5F), реверсного
праймера (Rep1R) и Taq-man зонда (zond2Rep1) выделены в зеленые прямоугольники.
Пунктирные линии в последовательности 10-й хромосомы обозначают делетированные
нуклеотиды.
Однако, высокий процент содержания GC нуклеотидов (>70%) в
последовательности D4Z4 осложнял амплификацию и снижал эффективность реакции.
Для увеличения эффективности ПЦР проведена оптимизация условий прохождения ПЦР,
а также состава ПЦР-смеси с использованием бетаина в конечной концентрации 1.2М в
качестве энхансера для ПЦР-амплификации GC-насыщенных районов.
Данная ПЦР-система использовалась для амплификации геномных ДНК матриц
контрольных образцов с известной длинной массивов D4Z4 хромосомы 4. Полученные
амплификаты секвенированы по Сенгеру, для определения специфичности полученных
последовательностей (рис. 4). Таким образом разработана количественная ПЦР-система
для специфичной амплификации участка повторов D4Z4 хромосомы 4.
Рисунок 4. Схема расположения пары праймеров Rep1,5F и Rep1R, и
хроматограмма сиквенса ПЦР-продукта, полученного с использованием данной пары
праймеров на матрице геномной ДНК.
Примечание: А – места отжига праймеров Re1,5F и Rep1R, расположенные ближе к
теломерному концу (tel.) каждого из повторов D4Z4. Б – Фрагмент выравнивания
последовательности D4Z4 хромосомы 4 (AF117653.3) против референсной
последовательности хромосомы 10 (AY028079.1). Красным шрифтом обозначена
последовательность реверсного праймера Rep1R. Пунктиры в последовательности
хромосомы 10 демонстрируют 6-ти нуклеотидную делецию. Хроматограмма сиквенса
ПЦР-продукта демонстрирует специфичную амплификацию последовательности 4
хромосомы с матрицы геномной ДНК. В прямоугольники выделены 6-ти нуклеотидные
повторы.
Оптимизация условий пульс-электрофореза рестрицированной геномной ДНК
Оптимизацию данного шага проводили с целью уменьшения продолжительности
пульс-электрофореза, но сохранения достаточного разрешения в диапазоне длин от 10 до
38 т.п.н., именно в этом диапазоне представлены укороченные до 1-10 повторов аллели.
В результате условия разделения имели следующие характеристики: напряжение
15,5 В/см, время пульса 0,5 сек, температура буфера +5ºС. Эти условия использованы на
всём протяжении выполнения данной работы.
После пульс-электрофореза, дорожки агарозного геля нарезаны на фрагменты
согласно длинам маркера молекулярного веса. При этом шаг нарезки в диапазоне длин от
8 до 48 т.п.н. составляет 1-2 повтора D4Z4 (3,3-6,6 т.п.н.). Диапазон дорожки геля от лунки
и до бэнда маркера молекулярного веса размером в 48 т.п.н. делится на два фрагмента,
причем фрагмент ближний к низкомолекулярной фракции содержит весь мажорный бэнд
геномной ДНК.
Далее полученные после нарезки фрагменты геля использованы в качестве
матрицы для ПЦР с парой праймеров Rep1,5F и Rep1R.
Подбор условий для проведения количественной ПЦР на матрице геля после
пульс-электрофореза
При постановке ПЦР с детекцией результатов по конечной точке с образцами
фрагментов геля в некоторых случаях удавалось получить выраженную разницу в
количестве ПЦР-продукта между фрагментами геля, в которых ожидаемо содержались
массивы D4Z4 и между остальными фрагментами геля. Но были образцы, для которых
такой разницы, не наблюдалось.
Такое явление может быть объяснено деградацией ДНК в ходе выделения,
хранения и пульс-электрофореза, либо низкой концентрацией ДНК для амплификации.
Для решения проблемы предпринят переход на ПЦР в реальном времени с
использованием TaqMan-зондов (рис. 5).
В итоге, количественная ПЦР-система позволила решить проблему обнаружения
фрагмента агарозного геля с максимальным содержанием таргетного локуса. В
последующих экспериментах данная количественная ПЦР-система использовалась для
определения длин массивов повторов D4Z4 аллелей хромосомы 4 и для сравнения с
результатами, полученными методиками гибридизации по Саузерну и молекулярного
комбинга.
Рисунок 5. Показатели эффективности количественной ПЦР с парой праймеров
Rep1,5F+Rep1R и с TaqMan зондом Rep1zond2.
Примечание: Эффективность ПЦР определялась по стандартной кривой разведений
геномной ДНК. Использовано 5 разведений матрицы с шагом 1:10, по три повторности
каждое разведение (красные квадраты на графике). А – стандартная кривая для ПЦР с
использованием смеси геномной ДНК и чистого (не содержащего ДНК) агарозного геля,
подвергнутого воздействию пульс-электрофореза. Б – стандартная кривая для ПЦР с
использованием в качестве матрицы геномной ДНК без добавления агарозного геля.
Гаплотипирование аллелей массивов D4Z4
Основанный на ПЦР (трех-праймерная ПЦР) подход к определению гаплотипа
интересующего аллеля ранее предложен (Papanikos F. et al., 2014) с соавторами.
Оптимизация условий и состава ПЦР проводилась с использованием следующих
контрольных образцов: фаговый клон λ260201 (гаплотип А хромосомы 4); космида С85
(гаплотип А хромосомы 10); фрагмент геля Р8, содержащий аллель массива повторов
D4Z4 хромосомы 4, гаплотип В (пациент №131); фрагмент геля Р10, содержащий аллель
массива повторов D4Z4 хромосомы 4, гаплотип А (пациент №131); отрицательный
контроль геля – фрагмент геля из зоны вне дорожек, использован для контроля
контаминации геля в ходе пуль-электрофореза (рис. 6). После проведения оптимизации
состава ПЦР-смеси, а именно используемой ДНК-полимеразы и количества праймеров,
проведено гаплотипирование имеющихся образцов. Для этого, в качестве матрицы для
ПЦР использованы фрагменты гелей после пульс-электрофореза, которые, согласно
результатам ПЦР в реальном времени, содержали аллели массивов D4Z4.
В результате оптимизации для возможности амплификации в присутствии
агарозного геля, данная система для ПЦР-гаплотипирования специфично амплифицирует
таргетный локус даже в присутствии агарозного геля (рис. 6).
Рисунок 6. Результаты ПРЦ-гаплотипирования массивов D4Z4 аллелей хромосомы 4.
Примечание: В качестве матриц для ПЦР использованы: К – отрицательный контроль, не
содержащий гель; Кг– отрицательный контроль с использованием пульс-
электрофорезного агарозного геля в качестве матрицы; Р8 – фрагмент агарозного геля,
содержащего аллель четвертой хромосомы с тандемом повторов D4Z4 имеющих
гаплотип B; Р10 – фрагмент агарозного геля, содержащего аллель четвертой хромосомы
с тандемом повторов D4Z4 имеющих гаплотип А; С85 – космидная матрица С85
(содержит аллель хромосомы 10 с тандемом повторов D4Z4 имеющих гаплотип А); λ26 –
космидная матрица λ260201 (содержит аллель хромосомы 4 с тандемом повторов D4Z4
имеющих гаплотип А). М – маркер молекулярного веса. ПЦР-продукт длиной 242 п.о.
образуется с как 4, так и 10 хромосом. ПЦР-продукт длиной 140 п.о. образуется только с
матрицы, содержащей аллель четвертой хромосомы с тандемом повторов D4Z4 имеющих
гаплотип А
Валидация разработанной методики диагностики МЛД1. Анализ образцов
геномной ДНК с помощью гибридизации по Саузерну
Данный этап работы выполнялся на базе лаборатории генетики человека
Лейденского университета, Нидерланды.
Образцы ДНК 30 российских пациентов с МЛД и их 12 фенотипически здоровых
родственников выделены в агарозных блоках из свежей венозной крови. Для определения
длин тандемов D4Z4 на аллелях 4 и 10 хромосом использовалась дифференциальная
рестрикция и гибридизация по Саузерну с радиоактивно-меченными ДНК-зондами.
С помощью системы двойной рестрикции EcoRI/AvrII (рис. 7) можно установить
изменение длины области повторов D4Z4 на 4 хромосоме, в то время как все повторы 10
хромосомы элиминируются из анализа при помощи эндонуклеазы рестрикции AvrII. При
определении гаплотипов, геномная ДНК обрабатывалась рестриктазой HindIII и
гибридизовалась с пробами комплементарными гаплотипам либо А, либо B (рис. 7). Для
разделения рестрикционных фрагментов по длине использован пульс-электрофорез.
Рисунок 7. Определение длин аллелей тандемов повторов D4Z4 и их гаплотипов
методикой гибридизации по Саузерну.
Примечание: А – определение длин массивов D4Z4, E – дорожка с ДНК после рестрикции
эндонуклеазой EcoRI; A – дорожка с ДНК после рестрикции эндонуклеазами EcoRI/AvrII;
X – дорожка с ДНК после рестрикции эндонуклеазой XapI. Б – определение гаплотипа А;
H – дорожка с ДНК после рестрикции эндонуклеазой HindIII. Слева от изображения
блотов указаны длины фрагментов маркера молекулярного веса.
Анализ образцов геномной ДНК с помощью молекулярного комбинга
Молекулярным комбингом проанализировано 5 образцов ДНК пациентов с
клиническим диагнозом МЛД, среди которых: 2 образца, не обследованные/частично
обследованы ранее другими молекулярно-генетическими методами (№126, №146). Один
образец с установленными длинами массивов D4Z4 и их гаплотипами, но
неустановленной хромосомной принадлежностью (№146); один образец не
охарактеризован из-за низкой концентрации геномной ДНК, оказавшейся недостаточной
для детекции при гибридизации по Саузерну (№126). Следующая группа из 3 образцов,
обследованных методом гибридизации по Саузерну (№125, №134, №136) включала: один
образец с неустановленной хромосомной принадлежностью двух аллелей массивов D4Z4,
но с установленным гипометилированием массивов D4Z4 (№125); два образца с
подозрением на наличие мозаицизма по одному из аллелей 4 хромосомы (№134, № 136).
Для всех образцов обследованных молекулярным комбингом получены данные о
длине аллелей массивов D4Z4 и их гаплотипе и хромосомной принадлежности, на этом
основании сделаны выводы о наличии/отсутствии у данных индивидов МЛД1 (табл. 1).
Полученные методиками гибридизации по Саузерну и молекулярного комбинга
данные использованы для сравнения с результатами, полученными при использовании
разработанной методики для диагностики МЛД1: количественной ПЦР для определения
числа повторов D4Z4 на аллелях четвертой хромосомы и ПЦР-гаплотипирование данных
аллелей.
Сравнение результатов диагностики МЛД, полученными с использованием разных
методик
Следующей задачей явилось сравнение разработанной методики с гибридизацией
по Саузерну и молекулярным комбингом. Для этого образцы геномной ДНК пациентов с
клиническими признаками миодистрофии Ландузи-Дежерина и их родственников
исследованы гибридизацией по Саузерну и молекулярным комбингом. Полученные
данные использовались далее в качестве референсных при детекции D4Z4 повторов с
помощью количественное ПЦР с фрагментами геля в качестве матрицы.
Для анализа методикой количественной ПЦР с фрагментами пульс-
электрофорезного геля доступно оказалось 42 образца, среди них: пациенты с
фенотипическими проявлениями МЛД – 30 пациентов (минимум один укороченный
тандем D4Z4, n=21; без укороченных тандемов D4Z4, n=9); фенотипически здоровые
родственники – 12 (один укороченный тандем D4Z4, n=4; без укороченных тандемов
D4Z4, n=8).
При гибридизации по Саузерну, сравнение гибридизационного сигнала с длинами
маркера молекулярного веса происходит визуально, это может вносить ошибку в
определение точного числа повторов D4Z4. Учитывая это, совпадением считалось
разница в пределах 2-х D4Z4-повторов. Несовпадение – разница на 3 и более D4Z4-
повтора.
Совпадение результатов наблюдалось в 93% (n=39). Среди них 20 индивидов имели
один укороченный аллель тандема D4Z4 хромосомы 4. Два индивида имели два
укороченных аллеля тандема D4Z4 хромосомы 4. Для 17 индивидов не обнаружено
укороченных аллелей тандемов D4Z4 хромосомы 4.
В одном случае (2%, один укороченный аллель тандема D4Z4) установить длину
методом количественной ПЦР не удалось. Наиболее вероятно, данный образец геномной
ДНК деградировал к моменту проведения анализа. Для двух неродственных индивидов
(5%, один укороченный аллель тандема D4Z4) получены ложноотрицательные
результаты. Наиболее вероятным объяснением в этом случае является путаница в
образцах геномной ДНК. К сожалению, повторного цикла диагностики с вновь
выделенной геномной ДНК провести не удалось ввиду отказа участников от дальнейших
исследований.
Сравнение результатов гаплотипирования образцов ДНК
Вторым обязательным критерием молекулярно-генетического подтверждения
диагноза МЛД1 является определение сцепления укороченного массива повторов D4Z4 с
гаплотипом «А». Поэтому обязательным шагом являлась валидация и методики ПЦР-
гаплотипирования. Для этого 40 индивидов, с имеющимися референсными результатами
гаплотипирования массивов D4Z4 аллелей четвертой хромосомы, проведено ПЦР-
гаплотипирование. Среди обследованных индивидов, в соответствии с референсными
результатами: 17 не имели укороченных аллелей, но хотя-бы один аллель имел гаплотип
А; 2 индивида с двумя укороченными аллелями, но только по одному аллелю с
гаплотипом А; и 21 индивид с одним укороченным аллелем с гаплотипом А (табл. 1).
В 39 случаях наблюдалось совпадение результатов ПЦР-гаплотипирования с
референсными данными. В 1 случае, для которого также не удалось провести определение
количества повторов D4Z4, не удалось провести и ПЦР-гаплотипирование по той же
причине – недостаточное количество/качество ДНК во фрагменте геля.
Результатысравнениягаплотипированияподтверждаютвозможность
использования аллель-специфичной ПЦР в качестве диагностической методики
определения гаплотипа А тандемов D4Z4.
Анализ представленности пермиссивных аллелей массивов D4Z4 в группе
обследованных индивидов
Для более полной характеристики укороченных массивов повторов D4Z4
хромосомы 4 у российских пациентов с МЛД и их родственников, дополнительно, к
имеющимся результатам, проведено обследование 133 индивидов из российской
популяции. Среди них: 99 пациентов с признаками МЛД и их 34 фенотипически здоровых
родственников. Всем индивидам проведена диагностика с использование количественной
ПЦР с фрагментами пульс-электрофорезного геля для определения длин аллелей
тандемов D4Z4 четвертой хромосомы и, в случае их укорочения, – ПЦР-
гаплотипирование данных аллелей.
Суммируя результаты ДНК-диагностики МЛД методиками гибридизации по
Саузерну, молекулярного комбинга и количественной ПЦР с последующим ПЦР-
гаплотипированием, обнаружено следующее: в группе из 129 пациентов МЛД
подтвержден для 85 (65,9%) из них; для 3 пациентов установлен диагноз МЛД2; для 41
пациента диагноз МЛД не подтвержден в группе из 46 фенотипически здоровых
родственников обнаружено 12 (26%) индивидов имеющих пермиссивный аллель; для 34
(74%) индивидов укороченных аллелей не обнаружено; на основании полученных данных
построены гистограммы распределения пермиссивных аллелей в группах пациентов и
фенотипически здоровых родственников (рис. 8); при сравнении соотношений полов в
группах пациентов и фенотипически здоровых родственников преобладания в
зависимости от пола не выявлено (χ2 = 1.29. p = 0.26).
АБРодственники
Пациенты
20
Число аллелей
Число аллелей
10
00
123456789 10 11 1212345678910 11 12
Число повторов D4Z4Число повторов D4Z4
Рисунок 8. Распределение длин пермиссивных аллелей массивов D4Z4 четвертой
хромосомы в группе пациентов с МЛД (А) и их фенотипически здоровых
родственников(Б).
Алгоритм молекулярно-генетической диагностики МЛД1
На основании результатов проделанной работы, предложен модифицированный
алгоритм диагностики МЛД. При этом этапы гибридизации по Саузерну для определения
длин массивов D4Z4 и гаплотипирования заменяются на ПЦР в реальном времени и ПЦР
с детекцией по конечной точке, соответственно. Схема алгоритма представлена на
рисунке 9.
В случае обнаружения укороченного аллеля массива повторов D4Z4 четвертой
хромосомы, следующий обязательный шаг – это гаплотипирование данного аллеля. В
случае если обнаруженный аллель сцеплен с гаплотипом «А», диагноз подтверждается.
Если укороченный аллель не сцеплен с гаплотипом «А», диагноз МЛД не
подтверждается.
В случае, если не обнаруживается укороченного аллеля массива повторов D4Z4
четвертой хромосомы, диагноз МЛД 1-го типа не подтверждается. Далее рекомендовано
ПЦР-гаплотипирование с геномной ДНК. В случае если обнаруживается гаплотип «А»,
то остается вероятность диагноза МЛД 2-4–го типов. В таких случаях рекомендован
поиск мутаций в генах ответственных за развитие МЛД 2-4-го.
Рисунок 9. Комплексный алгоритм молекулярно-генетической диагностики МЛД.
ВЫВОДЫ
1. Для проведения ДНК-диагностики у пациентов с миодистрофией Ландузи-
Дежерина разработана методика обнаружения пермиссивных аллелей, включающая
определение числа повторов D4Z4 аллелей хромосомы 4 и установление их сцепления с
гаплотипом «А».
2. Для валидации полученных результатов проведён сравнительный анализ
определения длин массивов D4Z4 на 42 образцах от пациентов с миодистрофией Ландузи-
Дежерина и их родственников с помощью разработанной методики и методик
гибридизации по Саузерну и молекулярного комбинга. Совпадение результатов
наблюдалось в 93%; несовпадение в 5%; спорные результаты в 2%.
3. Показано, что разработанная методика имеет преимущества над гибридизацией
по Саузерну и молекулярным комбингом в скорости и стоимости исследования.
Методика может быть использована в клинической практике как исследование первой
линии при наличии у пациентов фенотипических признаков лице-лопаточно-плечевой
миодистрофии Ландузи-Дежерина.
4. Впервые проведено исследование аллелей массивов D4Z4 суммарно у 129
российских пациентов с МЛД. Диагноз МЛД1 подтвержден у 85 (66%), у 3 пациентов
установлен диагноз МЛД2 (2,33%), у 41 пациента диагноз МЛД не подтвержден (31,7%).
Среди фенотипически здоровых родственников обнаружено 12 индивидов имеющих
пермиссивные аллели.
5. В группе из 85 пациентов с подтвержденным диагнозом, среднее значение числа
повторов D4Z4 пермиссивных аллелей составило 5 единиц. У индивидов без клинических
проявлений заболевания, число повторов D4Z4 пермиссивных аллелей составило 6 и
более.
6. Разработан комплексный алгоритм и рекомендации по применению метода ДНК-
диагностики лице-лопаточно-плечевой миодистрофии Ландузи-Дежерина.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. По результатам проведенного исследования представлен алгоритм
подтверждающей и дифференциальной диагностики миодистрофии Ландузи-Дежерина,
включающий как этапы поиска укороченного аллеля массива повторов D4Z4 хромосомы
4 и обязательно ПЦР-гаплотипирования укороченного аллеля для проверки его сцепления
с гаплотипом «А».
2. При обнаружении у пациентов с миодистрофии Ландузи-Дежерина аллеля 4
хромосомы с числом повторов D4Z4 11-12 единиц и сцепления данного аллеля с
гаплотипом «А», рекомендовано секвенирование генов ответственных за развитие МЛД
2-4 типов.
3. При отсутствии в исследуемом образце аллелей массивов D4Z4 хромосомы 4,
сцепленных с гаплотипом «А», любой из типов МЛД исключается из диагностического
поиска данного заболевания.
4. Разработанный метод определения длин массивов повторов D4Z4 может быть
использован для определения длин массивов других макросателлитных повторов с целью
диагностики других заболеваний.
Актуальность темы исследования
В геноме человека широко представлены повторяющиеся нуклеотидные
последовательности (повторы). Их доля, по оценкам разных авторов, может достигать
~70%. Отдельный интерес представляют из себя макросателлитные повторы – тандемно
повторяющиеся последовательности ДНК с длиной одного повтора в несколько тысяч пар
нуклеотидов. Для таких повторов показано, что их число в тандеме может оказывать
влияние на корректное функционирование области генома, содержащей массив
макросателлитных повторов. Для некоторых тандемов макросателлитных повторов
характерна нестабильность с частыми случаями дупликаций, делеций и транслокаций
единиц тандема.
Однако, из-за относительно большого размера и повторяющихся элементов,
определение числа повторов в интересующем тандеме с помощью широкодоступных
методик, например, таких как ПЦР, хромосомный микроматричный анализ или
секвенирование, зачастую является невозможным. Классической методикой,
позволяющей определять количественные изменения макросателлитных повторов,
является гибридизация по Саузерну. Необходимо отметить, что этот метод изобретен
достаточно давно (1975г.) и, несмотря на происходящий сегодня биотехнологический
прогресс, остается золотым стандартом в изучении числа и структуры макросателлитных
повторов. Стоит также отметить, что с помощью гибридизации по Саузерну возможно
определение вариации числа копий раздельно, как на материнской, так и на отцовской
хромосоме.
При этом гибридизация по Саузерну является достаточно трудоемкой и
протяженной по времени методикой. Кроме того, в классическом варианте она
предполагает использование радиоизотопных соединений, что, естественно, накладывает
ограничения на использование данной методики в лабораториях. Альтернативное
использование нерадиоактивных способов детекции (например, с помощью биотина или
дигоксигенина) не получило широкого распространения из-за сложности в процессе
гибридизации ДНК-зондов. Недавно появились более современные методы определения
числа повторов, например, метод молекулярного комбинга, который сокращает
количество шагов необходимых для определения характеристик макросателлитных
массивов, но является довольно дорогостоящим, а его применение описано лишь для
некоторых типов макросателлитных повторов.
Проблема обнаружения вариации числа копий макросателлитных повторов в
геноме стоит не только перед фундаментальной наукой, но и при выполнении
прикладных целей. В качестве практического примера можно привести генетическое
заболевание лице-лопаточно-плечевую миодистрофию Ландузи-Дежерина (МЛД),
характеризующуюся изменением числа копий макросателлитных повторов D4Z4.
Показано, что у больных данным заболеванием, тандем повторов D4Z4 на одном из
аллелей 4-й хромосомы насчитывает от 1 до 10 повторяющихся копий, тогда как у
здорового человека может достигать 100 копий. До настоящего времени молекулярная
диагностика данного заболевания в Российской Федерации не производилась, а за
рубежом она является дорогостоящей из-за использования радиоактивных изотопов и
оборудования высокой стоимости. Для решения сложившейся ситуации, в ходе данной
работы разработан новый метод для определения числа макросателлитных повторов, и
проведен сравнительный анализ методов гибридизации по Саузерну и молекулярного
комбинга с новым методом.
Степень разработанности темы
На сегодняшний день в ФГБНУ «МГНЦ» ежемесячно обследуются от 2 до 5
пациентов с фенотипическими признаками МЛД. В то время как клиническая
диагностика данной патологии, в большинстве случаев, не вызывает затруднений, ее
молекулярно-генетическая диагностика требует использования узкоспециализированных
методик.
До последнего времени молекулярная диагностика данного заболевания в
Российской Федерации не проводилась, а за рубежом она является малодоступной из-за
использования радиоактивных изотопов и узкоспециализированного оборудования и
проводится в небольшом числе лабораторий.
Поэтому важным является поиск широкодоступных и более дешевых методик
молекулярно-генетического подтверждения МЛД.
Цель и задачи исследования
Целью исследования явилось изучение молекулярно-генетических основ,
разработка методики, валидация ДНК-диагностики лице-лопаточно-плечевой
миодистрофии Ландузи-Дежерина на группе российских пациентов.
Для достижения цели поставлены следующие задачи:
1. Разработать методику обнаружения пермиссивных аллей, включающую
определение числа повторов D4Z4 хромосомы 4 и определение их сцепления с
гаплотипом «А» на образцах ДНК группы пациентов с клиническим диагнозом
миодистрофия Ландузи-Дежерина.
2. Провести валидацию разработанной методики на ДНК от пациентов с
миодистрофией Ландузи-Дежерина и их родственников.
3. Провести исследование аллелей массивов D4Z4 у российских пациентов с
миодистрофией Ландузи-Дежерина и их родственников.
4. Изучить молекулярно-генетические характеристики пермиссивных аллелей у
пациентов и их родственников.
5. Разработать алгоритм и рекомендации по применению методики ДНК-
диагностики лице-лопаточно-плечевой миодистрофии Ландузи-Дежерина.
Научная новизна
Впервые определен спектр и частота представленности аллелей массивов повторов
D4Z4 хромосомы 4q35 у пациентов с миодистрофией Ландузи-Дежерина и их
фенотипически здоровых родственников из Российской популяции.
Впервые разработана и применена методика определения числа макросателлитных
повторов D4Z4 хромосомы 4, основанная на использовании количественной ПЦР.
Валидация методики проведена с использованием референсных образцов с известными
числами повторов D4Z4 хромосомы 4.
Впервые использована методика аллельспецифичной ПЦР для определения
гаплотипа 4qA в образцах фрагментов агарозного геля, не требующая дополнительной
стадии очистки ДНК от агарозы.
Теоретическая и практическая значимость работы
Разработана методика определения вариаций числа макросателлитных повторов
D4Z4 аллелей хромосомы 4 для проведения ДНК-диагностики у пациентов с лице-
лопаточной плечевой миодистрофией Ландузи-Дежерина.
Разработан метод использования фрагментов геля после пульс-электрофореза в
качестве ПЦР-матрицы для определения дистального гаплотипа массива повторов D4Z4
хромосомы 4.
Наряду с гибридизацией по Саузерну и методом молекулярного комбинга,
разработанная методика может быть использована в клинической практике как
исследование первой линии при наличии у пациентов фенотипических признаков лице-
лопаточно-плечевой миодистрофии Ландузи — Дежерина.
Разработан алгоритм и рекомендации по ДНК диагностике миодистрофии
Ландузи-Дежерина.
Методология и методы исследования
Информированное согласие на участие в исследовании и обработку персональных
данных получено от всех участников. Проведение исследования одобрено этическим
комитетом ФГБНУ «МГНЦ». Выборка для молекулярно-генетического исследования
сформирована из пациентов с клиническим диагнозом миодистрофия Ландузи-Дежерина
и их фенотипически здоровых родственников.
Положения, выносимые на защиту
1. Разработана методика выявления пермиссивных аллей, включающая
определение числа повторов D4Z4 хромосомы 4 и идентификация их сцепления с
гаплотипом «А».
2. Проведена валидация разработанной методики с использованием
референсных образцов ДНК с известными числами повторов D4Z4 хромосомы 4.
3. Проведено исследование аллелей массивов D4Z4 у российских пациентов с
МЛД и их родственников.
4. Проведен анализ распределения числа повторов D4Z4 аллелей хромосомы 4
среди пациентов и их родственников.
5. Разработаны алгоритм и рекомендации по применению методики
молекулярно-генетической диагностики МЛД.
Степень достоверности результатов
Основные положения диссертационной работы базируются на материалах
первичной документации и полностью им соответствуют. Результаты, полученные
автором в процессе комплексного исследования миодистрофии Ландузи-Дежерина в
российской популяции, свидетельствуют о решении поставленных задач. Достоверность
результатов исследования подтверждена верификацией полученных данных на
референсных образцах от 129 пациентов с миодистрофией Ландузи-Дежерина и 46
фенотипически здоровых родственников. Результаты исследования соответствуют
данным, представленным в отечественной и зарубежной литературе. Исследование
выполнено при использовании различных методов диагностики (количественная ПЦР,
секвенирование по Сенгеру, гибридизация по Саузерну, молекулярный комбинг и др.) и
методов статистического анализа. Изложенные в диссертационном исследовании
положения, выводы и рекомендации являются достоверными. Для сравнительного
анализа привлечено достаточное количество современных источников отечественной и
зарубежной литературы (129 источников). Выводы полноценно и объективно отражают
результаты проведенных исследований.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
В соответствии с областями исследования специальности 1.5.7. (03.02.07) –
Генетика (биологические науки) – «Генетика человека. Медицинская генетика.
Наследственные болезни. Молекулярные основы наследственности. Мутационная
изменчивость. Популяционная генетика» – работа включает в себя обсуждение генетики
человека, медицинской генетики, наследственных заболеваний.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены в двух устных выступлениях автора и в двух
выступлениях соавторов. Устные доклады: «50 лет ВОГиС: успехи и перспективы» (8 –
10 ноября 2016 г. Москва); «Всероссийская научно-практическая конференция с
международным участием «Молекулярная диагностика 2017» (18-20 апреля 2017 г.
Москва). Соавторство устных докладов: «A new approach for FSHD diagnostic». A.
Borovikov, N. Zernov, M. Skoblov. Future of Biomedicine 2017 (FOB 2017), Vladivostok, 10-
15 September 2017; «The Russian registry of patients with facioscapulohumeral muscular
dystrophy». Aysylu Murtazina, Nikolay Zernov, Galina Rudenskaya, Inna Sharkova, Natalia
Semenova, Nina Demina, Varvara Galkina, Ludmila Bessonova, Artem Borovikov, Elena
Dadali, Mikhail Skoblov. 28th Annual FSHD Society International Research Congress, JUNE
24–25, 2021. В виде тезисов и постерных сообщений материалы диссертации
представлены на 5 конференциях: постерный доклад “Genotype-phenotype correlations in
FSHD” N. Zernov, M. Skoblov. 11th International Multiconference “Bioinformatics of Genome
Regulation and StructureSystems Biology” – BGRSSB7 2018. Novosibirsk, Russia. 20-25
August 2018; постерный доклад “Genotype-phenotype correlations in FSHD” 11th
International Multiconference “Bioinformatics of Genome Regulation and Structure Systems
Biology”. N. Zernov, M. Skoblov. BGRSSB7 2018. Novosibirsk, Russia. 20-25 August 2018;
постерный доклад «DNA diagnostics for facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD) by
qPCR-based approach». N. Zernov, M. Skoblov. European Human Genetics Conference,
Gothenburg, Sweden, June 15–18, 2019; European Human Genetics Conference, Berlin,
Germany, JUNE 6–9, 2020; 27th Annual FSHD Society International Research Congress, JUNE
25–26, 2020. Работа одобрена этическим комитетом, прошла экспертную комиссию,
рекомендована к защите на заседании Диссертационного совета ФГБНУ «МГНЦ».
Личное участие автора в выполнении исследования
Автор изучил современные данные отечественной и зарубежной литературы по
теме диссертации. Автор самостоятельно проводил все эксперименты, проводил анализ
экспериментов с использованием основных методов молекулярной биологии. Зернов Н.В.
лично участвовал в анализе и интерпретации полученных результатов, сформулированы
основные результаты и выводы. Написание глав собственных исследований, обсуждение
результатов и формулировка выводов выполнены автором самостоятельно.
По результатам исследований автором опубликовано 6 статей в журналах,
рекомендованных ВАК при Минобрнауки России для соискателей ученой степени
кандидата медицинских наук.
Публикации
Результаты диссертационной работы представлены в 6 статьях в журналах (Scopus
и Web of Science), рекомендованных ВАК при Минобрнауки России для соискателей
ученой степени кандидата биологических наук.
Объем и структура работы
Структура диссертации включает: введение, обзор литературы, материалы и
методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, практические рекомендации,
список литературы и приложения. Работа представлена на 114 страницах, содержит 15
рисунков, 6 таблиц и 7 приложений. Список литературы включает в себя 129
наименований, все являются зарубежными источниками.
В результате проведенной работы была разработана новая методика ДНК-
диагностики миодистрофии Ландузи-Дежерина. Данная методика основана на ПЦР, что
делает ее широкодоступной для применения в большинстве диагностических лабораторий,
в отличии от стандартных методик гибридизации по Саузерну и молекулярного комбинга.
Разработанная методика была валидирована сравнением с результатами диагностики
гибридизацией по Саузерну и молекулярным комбингом.
Разработанная методики использовалась для исследования аллелей массивов D4Z4
для российских пациентов и их фенотипически-здоровых родственников. На территории
России подобное исследование проводилось впервые. Была обнаружена статистически
значимая разница в накоплении пермиссивных аллелей между пациентами и носителями. В
группе пациентов наиболее часто встречались пермиссивные аллели с числом повторов
D4Z4 от 3 до 6 единиц. Тогда как среди бессимптомных носителей больше всего индивидов
имели пермиссивные аллели с 6-9 повторами D4Z4.
В целях молекулярно-генетического подтверждения МЛД1 разработанная методика
рекомендована как исследование первой линии т.к. предоставляет всю необходимую
информацию для постановки диагноза: число повторов D4Z4 на укороченном аллеле и
сцепление данного аллеля с гаплотипом «А».
ВЫВОДЫ
1. Для проведения ДНК-диагностики у пациентов с миодистрофией Ландузи-
Дежерина разработана методика обнаружения пермиссивных аллелей, включающая
определение числа повторов D4Z4 аллелей хромосомы 4 и установление их сцепления с
гаплотипом «А».
2. Для валидации полученных результатов проведён сравнительный анализ
определения длин массивов D4Z4 на 42 образцах от пациентов с миодистрофией Ландузи-
Дежерина и их родственников с помощью разработанной методики и методик
гибридизации по Саузерну и молекулярного комбинга. Совпадение результатов
наблюдалось в 93%; несовпадение в 5%; спорные результаты в 2%.
3. Показано, что разработанная методика имеет преимущества над гибридизацией
по Саузерну и молекулярным комбингом в скорости и стоимости исследования.
Методика может быть использована в клинической практике как исследование первой
линии при наличии у пациентов фенотипических признаков лице-лопаточно-плечевой
миодистрофии Ландузи-Дежерина.
4. Впервые проведено исследование аллелей массивов D4Z4 суммарно у 129
российских пациентов с МЛД. Диагноз МЛД1 подтвержден у 85 (66%), у 3 пациентов
установлен диагноз МЛД2 (2,33%), у 41 пациента диагноз МЛД не подтвержден (31,7%).
Среди фенотипически здоровых родственников обнаружено 12 индивидов имеющих
пермиссивные аллели.
5. В группе из 85 пациентов с подтвержденным диагнозом, среднее значение числа
повторов D4Z4 пермиссивных аллелей составило 5 единиц. У индивидов без клинических
проявлений заболевания, число повторов D4Z4 пермиссивных аллелей составило 6 более.
6. Разработан комплексный алгоритм и рекомендации по применению метода ДНК-
диагностики лице-лопаточно-плечевой миодистрофии Ландузи-Дежерина.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. По результатам проведенного исследования представлен алгоритм
подтверждающей и дифференциальной диагностики миодистрофии Ландузи-Дежерина,
включающий как этапы поиска укороченного аллеля массива повторов D4Z4 хромосомы
4 и обязательно ПЦР-гаплотипирования укороченного аллеля для проверки его сцепления
с гаплотипом «А».
2. При обнаружении у пациентов с миодистрофии Ландузи-Дежерина аллеля 4
хромосомы с числом повторов D4Z4 11-12 единиц и сцепления данного аллеля с
гаплотипом «А», рекомендовано секвенирование генов ответственных за развитие МЛД
2-4 типов.
3. При отсутствии в исследуемом образце аллелей массивов D4Z4 хромосомы 4,
сцепленных с гаплотипом «А», любой из типов МЛД исключается из диагностического
поиска данного заболевания.
4. Разработанный метод определения длин массивов повторов D4Z4 может быть
использован для определения длин массивов других макросателлитных повторов с целью
диагностики других заболеваний.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Список статей, опубликованных в журналах, рекомендованных ВАК при
Минобрнауки России
1. Зернов Н.В., Марахонов А.В., Вяхирева Ю.В., Гуськова А.А., Дадали Е.Л.,
Скоблов М.Ю. Клинико-генетические характеристики и особенности диагностики лице-
плече-лопаточной миодистрофии Ландузи –Дежерина // Генетика. – 2017. – Т. 53. №6. –
С. 651-662. (Scopus, WoS)
2. Вяхирева Ю.В., Зернов Н.В., Марахонов А.В., Гуськова А.А., Скоблов М.Ю.
Современные подходы к лечению миодистрофий //Медицинская генетика. – 2016. – Т 15.
№10. – С. 3-16.
3. Дадали Е.Л., Шаркова И.В., Зернов Н.В., Руденская Г.Е., Скоблов М.Ю. Клинико-
генетические характеристики лице-плечелопаточной миодистрофии Ландузи—Дежерина
типа 1 // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. – 2017. – Т. 117. №11. – С.
122-128. (Scopus)
4. Zernov N, Skoblov M. Genotype-phenotype correlations in FSHD // BMC medical
genomics. – 2019. – V 12 (Suppl 2). – P 43. doi.org/10.1186/s12920-019-0488-5 (Scopus, WoS)
5. Зернов Н.В., Гуськова А.А., Скоблов М.Ю. Новый подход к диагностике
миодистрофии Ландузи-Дежерина, основанный на полимеразцной цепной реакции //
Медицинская генетика. – 2019. – Т. 18. №7. – С 3-9. doi.org/10.25557/2073-7998.2019.07.3-
9
6. Zernov N.V., Guskova A.A., Skoblov M.Y. FSHD1 Diagnosis in a Russian Population
Using a qPCR-Based Approach // Diagnostics. – 2021. – V 11, № 6. – P 982.
doi.org/10.3390/diagnostics11060982 (Scopus, WoS)
Список публикаций в других изданиях
7. Zernov N., Skoblov M. Genotype-phenotype correlations in FSHD // Abstracts the 11th
International Conference Integrative bioinformatics and systems biology (WIBSB-2018). First
Sino-Russian Workshop. – 2018. – P. 71.
8. Zernov N., Skoblov M. DNA diagnostics for facioscapulohumeral muscular dystrophy
(FSHD) by qPCR-based approach // European Journal of Human Genetics. – 2019. V 27,
Supplement 2. – P. 1174-1813. doi.org/10.1038/s41431-019-0494-2.
9. Зернов Н.В., Гуськова А.А., Скоблов М.Ю. Молекулярно-генетическая
характеристика миодистрофии Ландузи-Дежерина в российской популяции //
Медицинская генетика. – 2020. – Т. 19. №4. – С 57-58. doi.org/10.25557/2073-
7998.2020.04.57-58.
10. Zernov N.V., Guskova A.A., Skoblov M.Yu. qPCR based approach for FSHD1
diagnostic and its implementation for studying Russian population // 27th Annual FSHD Society
International Research Congress. – 2020. – P. 63.
Помогаем с подготовкой сопроводительных документов
Хочешь уникальную работу?
Больше 3 000 экспертов уже готовы начать работу над твоим проектом!
5 (8 отзывов)
4.8 (17 отзывов)
5 (20 отзывов)
4.8 (9 отзывов)
4.9 (35 отзывов)
4.5 (9 отзывов)
4.7 (46 отзывов)
5 (428 отзывов)
4.9 (522 отзыва)
