Исследование молекулярного механизма действия малых доз радиации на функциональную активность генов стволовых клеток человека

Материалом для исследования стали мезенхимные стволовые клетки (МСК), полученные из 6-ти образцов жировой ткани операционного материала молочной железы, из коллекции клеточных культур ФГБНУ «МГНЦ» (г. Москва). МСК охарактеризовали по поверхностным CD-маркерам стволовых клеток методом проточной цитофлуориметрии (CyFlow (PARTEC, Германия)) с использованием соответствующих антител. Полученный профиль характерен для МСК.
Методы исследования
Культура МСК подвергалась однократному облучению следующими дозами радиации: 3, 10 и 50 сГр. В качестве источника ионизирующего гамма-излучения использовалась установка “Арина-7” (Россия).
К среде культивирования МСК добавлялись образцы окисленной внеклеточной ДНК в концентрации 50 нг/мкл. Внеклеточная ДНК из среды культивирования клеток выделялась фенольным методом. Концентрация вкДНК определялась с использованием интеркалирующего красителя Picogreen (Invitrogen, США). Пробы окисленной ДНК для эксперимента приготовлены обработкой образца геномной ДНК в присутствии 300mM Н2О2/Fe2+/EDTA или 300mM Н2О2 при облучении ультрафиолетом (λ = 312 нм). Для исследования проникновения вкДНК в МСК использовалась генетическая конструкция на основе плазмиды с маркерным геном («green» белок, GFP), содержащая легкоокисляющиеся повторы (G)n. Определение уровня 8-окси-дезоксигуанозина во внеклеточной ДНК осуществлялось дот иммуноблоттингом на нитроцеллюлозном фильтре с использованием антител к 8-окси-дезоксигуанозину (SantaCruz 66036)
Для оценки метаболической активности клеток проводился МТТ-тест. Оптическая плотность измерялась на планшетном спектрофотометре при длине волны 540 нм. Выживаемость клеток рассчитывалась по формуле: (ОП опытных лунок – ОП среды/ОП контр. лунок – ОП среды) Х 100%, где ОП — оптическая плотность.
Методом проточной цитометрии на проточном цитофлуориметре (СyFlow, “Partek”, Германия) исследован уровень АФК с помощью красителя: DCFH-DA (“Molecular Probes/Invitrogen”, “CA”, США).
Определение количества одно- и двунитевых разрывов ДНК произведено с помощью метода “ДНК-комет” (single cell gel electrophoresis) по стандартному протоколу на слайдах с агарозной подложкой. Флуоресцирующая ДНК в «хвосте кометы» отражает степень повреждения ДНК.
Методом проточной цитофлуориметрии исследованы: содержание 8-окси- дезоксигуаноина в составе ДНК ядер клеток с ипользованием первичных (Sc-66036, SantaGruz, CША) и вторичных (anti-mouse-FITC, SC-2010, SantaGruz, CША) моноклональных антител, уровень двухцепочечных разрывов ДНК методом анализа гамма-фокусов фосфорилированной формы гистона Н2АХ с применением антител к гистонам H2AX (NB100-78356G, “NovusBio”, США) и уровень экспрессии белков с использованием соответствующих моноклональных антител (BCL2 (Sc-783), BRCA2 (NBP1-88361), NOX4 (SC-30141), NRF2 (ab194984), p53 (sc-126-f), PCNA (ab2426)). Подготовка клеток проводилась по протоколу: фиксированные 3,7% формальдегидом (AppliChem) клетки отмывались 0,5% раствором альбумина и пермеабилизовались 90% метанолом. Затем суспензия клеток инкубировалась с первичными антителами 12 часов при +4°С и, при необходимости, со вторичными антителами (FITC, SantaGruz, CША) 1 час
при комнатной температуре в темноте, после чего производился анализ на проточном цитофлуориметре (СyFlow, «Partek», Германия).
Флуоресцентная микроскопия проводилась на флуоресцентном микроскопе AxioImagerA2 (Carl Zeiss). Клетки культивировались в маленьких чашках Петри. Фиксация клеток проводилась по стандартному протоколу: фиксация клеток 3,7% формальдегидом 10 минут при 4°С, затем пермеабилизирование 0,1% раствором Тритона X-100 (FERAK BERLIN) при 4°С в течение 15 минут, инкубирование клеток с первичными антителами, меченными FITC.
Из культуры МСК выделялась тотальная РНК набором Yellow Solve (Клоноген, Россия), согласно прилагаемой методике. Концентрация выделенной РНК определялась с помощью красителя Quant-iT RiboGreen RNA reagent (“MoBiTec”, Германия), на планшетном спектрофлуориметре («EnSpire», PerkinElmer, Финляндия), длина волны возб. 487 нм, длина волны флу. 524 нм. Стандартная относительная ошибка определения составляет 5%. Реакция обратной транскрипции проводилась с помощью реактивов фирмы «Силекс» (Россия) по стандартной методике.
ПЦР в реальном времени проводилась с использованием соответствующих праймеров (“Евроген”) на приборе StepOnePlus (“Applied Byosystems”, США). Для детекции амплифицируемого продукта использован интеркалирующий краситель SybrGreen. Состав реакционной ПЦР-смеси в объеме 25 мкл: 10,35 мкл стерильной воды mQ, 6 мкл Mg2+, 2,5 мкл ПЦР-буфера (700 ммоль/л Tris-HCl, pH 8,6; 166 ммоль/л сульфатааммония, 35 ммоль/л MgCl2), 2 мкл 1,5 ммоль/л раствора dNTP; 0,75 мкл ДМСО (диметилсульсоксид), по 1 мкл 30 пкмоль/л раствора праймеров, кДНК 1 мкл, Tag- полимераза (термостабильная ДНК-полимераза I) 0,3 мкл, краситель SybrGreen 0,2 мкл. Температуру отжига ПЦР подбиралась индивидуально для каждой пары праймеров. Стандартные условия ПЦР: денатурация (95°С, 4 минуты), затем 40 циклов амплификации в режиме: 94°С – 20 сек, (56-62)°С – 30 сек, 72°С – 30 сек. Элонгация – 72°С в течение 5 минут. Уровень экспрессии генов проанализирован в нескольких (не менее трех) независимых экспериментах на клетках от разных доноров, обработка результатов проведена с помощью программного обеспечения прибора; ошибка составляла 2%.
Статистическая обработка проводилась с использованием следующих программ: Excel Microsoft Office, Statistica 6.0, StatGraph. При анализе предполагаемых различий между выборками применялась нуль-гипотеза об отсутствии различий, которая оценивалась с помощью расчета U-критерия Манна-Уитни. Различия достоверны при p <0,05. Распределения параметров сравнивались по методу Колмогорова-Смирнова. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Повреждающее влияние радиации в дозах 3, 10 и 50 сГр на мезенхимные стволовые клетки (МСК) жировой ткани человека С использованием МТТ-теста показано, что воздействие радиации в дозе до 10 сГр на МСК человека не оказывает статистически значимого повреждения, тогда как действие радиации в дозе 50 сГр снижает число метаболически активных клеток на 40% через 3 суток. Малые дозы радиации индуцируют в МСК кратковременный синтез АФК АФК являются важным компонентом в жизнедеятельности клетки, однако чрезмерный синтез АФК приводит к окислительному стрессу. При действии радиации в дозе 3 сГр синтез АФК повышается на 20% через 20 минут и на 40% через 2 часа. Действие радиации в дозе 10 сГр на МСК через 20 минут кратковременно повышает уровень синтеза АФК клетками в 3,8 раза; уровень АФК падает через 2 часа, до контрольных значений. При действии радиации в дозе 50 сГр регистрируется повышение уровня синтеза АФК как при кратковременном, так и при более длительном воздействии: через 20 минут в 2,3 и через 2 часа в 1,6 раза (рисунок 1 А, Б). Данные, полученные методом проточной цитофлуориметрии, подтвердили методом флуоресцентной микроскопии в живых клетках с красителем H2DCFH-DA (рисунок 1 В, данные для 10 сГр). Рисунок 1. Анализ уровня АФК при действии радиации в дозах 3, 10 и 50 сГр: А, В - методом проточной цитометрии; Б - флуоресцентной микроскопии с использованием красителя H2DCFH-DA; В - * – отличия достоверны относительно контроля; Б - Увеличение ×40. Выдвинуто предположение, что возрастание уровня АФК в клетках происходит, в основном, за счёт работы NADPH-оксидаз, одним из представителей, которых является NOX4. Малые дозы радиации активируют экспрессию NOX4 и на уровне гена, и на уровне белка Показано, что через 20 минут после воздействия малых доз радиации 3, 10 и 50 сГр происходит увеличение уровня экспрессии гена NOX4 после воздействия - в 3,1; 2,4 и 1,9 раз, соответственно (Кальянов и др., 2017). Через 2 часа уровень экспрессии гена NOX4 снижается, повышенная экспрессия (в 1,6 раз) сохраняется только при действии 50 сГр (Рисунок 2 А). Данные флуоресцентной микроскопии показали, что в контрольных клетках NOX4 локализуется в основном в цитоплазме и на клеточной мембране. При действии малых доз радиации экспрессия NOX4 увеличивается не только в цитоплазме, но и в ядрах клеток. Методом проточной цитофлуориметрии показано, что уровень синтеза белка NOX4 возрастает пропорционально повышению уровня экспрессии гена, что коррелирует с данными, полученными при использовании флуоресцентной микроскопии. Синтез белка NOX4 наблюдался через 20 минут после действия радиации в цитоплазме МСК, а через 40 минут – по поверхности ядер клеток и в ядрах МСК. Рисунок 2. Анализ уровня экспрессии гена NOX4 (А) и уровня 8-oxodG (Б, в субпопуляции клеток с высоким уровнем флуоресценции) при действии радиации в дозах 3, 10 и 50 сГр методами ПЦР в реальном времени (А) и проточной цитофлуориметрии (Б); * – отличия относительно контроля достоверны. Б - Метод флуоресцентной микроскопии с использованием антител к 8-oxodG конъюгированных с FITC (зелёный) ядра окрашены DAPI (синий), увеличение ×40. Таким образом, повышенная экспрессия NOX4 как на уровне гена, так и на уровне белка коррелирует с повышением уровня АФК после воздействия радиации в малых дозах, что в свою очередь может вызывать окисление и повреждение ДНК ядер. Малые дозы радиации индуцируют повышение уровня окислительных модификаций и разрывов ДНК в ядрах МСК При помощи антител к 8-oxodG в фиксированных клетках определен уровень окисления ДНК. Методом проточной цитофлуориметрии выявлено наличие в контроле двух популяций клеток: с высоким уровнем 8-oxodG (R); и с низким уровнем 8-oxodG. В контрольных клетках фракция R составляет 8 ± 2% всей популяции. После действия радиации в дозе 3 сГр, 10 сГр и 50 сГр уровень флуоресценции увеличивается через 20-30 минут в 5, 10 и в 5,5 раз, соответственно (Рисунок 2 Б). После действия радиации в дозе 3 сГр уровень флуоресценции 8-oxodG фракции R через 2 часа остается неизменным, в дозе 10 сГр и 50 сГр уменьшается до контрольных значений (Рисунок 2 Б). Общее количество 8-oxodG возрастает после действия радиации (3, 10 и 50 сГр) в 5, 7,5 и 3,2 раза, соответственно, через 20-30 минут. Через 2 часа после облучения уровень 8-oxodG снижается в 1,5-2,5 раза. Методом флуоресцентной микроскопии показано, что интенсивность флуоресценции 8-oxodG увеличивается в цитоплазме и ядрах клеток через 30 минут при действии радиации в дозе 3, 10 и 50 сГр (Рисунок 2 В) (Кальянов и др., 2019). Образование окислительных модификаций ДНК приводят к однонитевым и двунитевым разрывам ДНК. Методом комет показано, что через 15-20 минут после воздействия малых доз радиации (3, 10 и 50 сГр) образуется большое количество разрывов ДНК, в дозах радиации 3 и 10 сГр уровень разрывов снижается до контрольных значений через 2 часа (Рисунок 3А). Рисунок 3. А. Визуализация метода комет, повреждения ДНК ядер клеток на уровне отдельных клеток при воздействии малых доз радиации 3, 10 и 50 сГр через 15 минут и 2 часа. Б. Определение уровня гамма-H2AX, методом проточной цитофлуориметрии, процент флуоресцирующих клеток (1) и уровень суммарной флуоресценции (2). В - Метод флуоресцентной микроскопии с использованием антител к гамма-H2AX, увеличение ×40. Однонитевые разрывы ДНК могут способствовать увеличению двунитевых разрывов ДНК, одним из маркёров двунитевых разрывов ДНК является белок H2AХ. В контроле фракция R, содержащая клетки с большим количеством маркера гамма-H2AX, составляет 6 ± 1% от всей популяции. Воздействие ИИ в дозе 3, 10 и 50 сГр через 30 минут приводит к увеличению количества клеток с высоким уровнем флуоресценции в 2, 6 и 9,5 раз, соответственно. Через 2 и 24 часа после действия радиации в дозе 50 сГр уровень флуоресценции гамма-H2AX фракции R остается повышенным, а при действии радиации в дозе 3 и 10 сГр через 24 часа снижается, достигая уровня контроля (рисунок 3 Б). Аналогичные изменения уровня гистона наблюдались для всех фракций МСК (рисунок 3 Б). Методом флуоресцентной микроскопии обнаружено увеличение клеток, содержащих множественные двунитевые разрывы ДНК ядер МСК через 15 минут после действия малых доз радиации (рисунок 3 В). Активация генов репарации, про- и антиапоптотических генов в МСК после облучения дозами ИИ 3, 10 и 50 сГр Повышение уровня АФК вызывает окислительный стресс и может активировать антиокислительный ответ. Центральным медиатором системы антиоксидантного ответа является стресс-активированный транскрипционный фактор NRF2. Через 20 минут после действия радиации в дозе 10 сГр на МСК уровень экспрессии гена NRF2 повышается в 2,4 раза и через 2 часа снижается до контрольных значений (рисунок 4 А). Уровень экспрессии гена NRF2 не изменяется после действия радиации в дозе 3 сГр ни через 20 минут, ни через 2 часа после облучения, и повышается незначительно при действии радиации в дозе 50 сГр через 20 минут, снижаясь до контроля через 2 часа после облучения (рисунок 4 А). Уровень белка транскрипционного фактора NRF2 также возрастает в 2,2 раза через 20 минут после воздействия 10 сГр. Данные флуоресцентной микроскопии показывают, что при действии радиации в дозе 10 сГр экспрессия NRF2 возрастает и в цитоплазме, и в ядре МСК. Рисунок 4. А. Анализ уровня экспрессии гена NRF2 при действии 3, 10 и 50 сГр радиации. * - достоверно отличаются от контроля. Б. Уровень экспрессии белка BRCA2 методом проточной цитофлуориметрии, * – отличия относительно контроля достоверны. В. Зависимость между уровнем BRCA2 и уровнем двунитевых разрывов в клетке (H2AX) при действии радиации в дозе 10 сГр. BRCA1 и BRCA2 принимают участие в репарации разрывов ДНК. Через 30 минут после воздействия на МСК малыми дозами радиации в дозе 3 и 10 сГр повышается уровень экспрессии гена BRCA1 – в 2,2 и 3,5 раз, соответственно. Через 2 часа уровень экспрессии гена остается повышенным в 2 и 2,5 раза, соответственно. Уровень экспрессии гена BRCA2 изменяется аналогичным образом: после действия 3 и 10 сГр радиации через 30 минут уровень экспрессии гена BRCA2 возрастает в 2,2 и 3,5 раза, соответственно. После действия радиации в дозе 3 и 10 сГр уровень экспрессии гена BRCA2 остается повышенным в 1,8 раз через 2 часа по отношению к контролю. Доза радиации в 50 сГр не оказывает значимого влияния на уровень экспрессии генов BRCA1 и BRCA2. Результаты, полученные исследованием уровня экспрессии генов, подтверждены и на уровне белков. Показано, что между уровнем BRCA2 и образованием двунитевых разрывов в клетке (уровнем гамма-H2AX-фокусов) существует корреляция. Полученные данные демонстрируют эффективность репарации ДНК при воздействии МДР в дозах 3 сГр и 10 сГр. Вызванный вследствие облучения клеток окислительный стресс повреждает хроматин ядер клеток, сопровождающийся впоследствии остановкой клеточного цикла и блокированием пролиферации. Показано, что через 30 минут в облученных малыми дозами радиации МСК повышается количество клеток в фазе G1 и G2, то есть наблюдается G1-, и G2/M-арест клеточного цикла, наиболее ярко выраженный при действии 50 сГр радиации; через 24 часа прогрессия клеточного цикла возобновляется. Исследовано количество клеток с признаками апоптоза после воздействия радиации в дозе 3, 10 и 50 сГр. Через 20 минут после действия 3, 10 и 50 сГр радиации в МСК наблюдаются признаки апоптоза – фракция апоптотических клеток возрастает в 2-2,5 раза. Через 2 часа в МСК снижается уровень апоптоза до контрольных значений (при действии 3 сГр) и статистически значимо ниже контрольных значений (при действии 10 и 50 сГр). Регулирующими факторами выживания клетки и апоптоза являются белки семейства BCL2. При действии радиации в дозе 50 сГр показано, что высокий уровень экспрессии проапоптотического гена ВAX сохраняется на протяжении 24 часов. Повышенной экспрессия генов семейства BCL2 (BCL2, BCL2A1, BCL2L1) остаётся в течение 2-72 часа после действия 3 сГр и 10 сГр радиации, что свидетельствует о развитии сильного антиапоптотического ответа в МСК при действии радиации. Полученные данные подтверждены на уровне белка методом проточной цитофлуориметрии и методом флуоресцентной микроскопии. Показано, что при действии радиации в дозе 3 сГр и 10 сГр на МСК уровень экспрессии антиапоптотического BCL2 возрастает (Kostyuk S.V. и др., 2018). Таким образом, д Рисунок 1. Схематичное изображение действия малых доз радиации на стволовые клетки. Таким образом, на основании полученных результатов для дальнейшей работы выбрана доза радиации 10 сГр, так как она вызывала наиболее сильный и быстрый адаптивный ответ в МСК. В среде культивирования клеток при действии малых доз радиации возрастает концентрация окисленной вкДНК; малые дозы радиации способствуют проникновению окисленной вкДНК в цитоплазму МСК Концентрация вкДНК в среде культивирования МСК при стандартных условиях и отсутствии дополнительных факторов стресса равна 8 ± 2 нг/мл (примерно 1% от всей ядерной ДНК). При воздействии радиации в дозе 10 сГр через 30 минут возрастает уровень гибели клеток, увеличивается концентрация вкДНК в 2-3 раза. Уровень 8-оксигуанозина (маркер окисления вкДНК) возрастает в 1,8 - 2 раза (Sergeeva, V. A. и др., 2017). Выдвинуто предположение, что окисленные последовательности вкДНК могут играть роль медиатора при реализации ответа клеток на воздействие малых доз радиации на МСК. Исследовалось проникновение в МСК фрагментов вкДНК в зависимости от уровня окисления. Для этой цели созданы генетические конструкции на основе плазмиды с маркерным геном («green» белок, GFP), содержащие легкоокисляющиеся повторы (G)n. Методами проточной цитофлуориметрии и флуоресцентной микроскопии показано, что введение в плазмиды поли-dG вставки, способной быстро окисляться в условиях окислительного стресса, приводит к проникновению плазмид в стволовые клетки. Ионизирующее излучение вызывает изменение окислительного гомеостаза в среде культивирования клеток, что приводит к окислительной модификации фрагментов вкДНК и способствует проникновению фрагментов вкДНК в клетки. Интенсивность флуоресценции клеток относительно контрольных клеток возрастает в ряду: оза радиации 10 сГр вызывает сильный и быстрый антиапоптотический и адаптивный ответ в МСК, доза радиации 3 сГр вызывает незначительный адаптивный эффект, а доза радиации 50 сГр оказывает сильное повреждающее действие на МСК, не вызывая при этом ярко выраженной адаптивной реакции (рисунок 5). K < pEGFP-C1 < п(G)12 < п(G)24 < pEGFP-C1 << п(G)12 < п(G)24 Рисунок 6. Проникновение фрагментов вкДНК в MCК. А. Способы добавления к МСК плазмид, содержащих ген флуоресцирующего белка. Б. Слева – в среду культивирования МСК вносили генетическую конструкцию, содержащую ген флуоресцирующего белка, в концентрации 100 нг/мл, клетки инкубировали 24 часа в СО2 инкубаторе при 37°С; справа – после внесения в среду культивирования МСК генетической конструкции клетки облучали 10 сГр ИИ (флуоресцентная микроскопия, увеличение х40). Таким образом, в результате окислительного стресса, сопровождающего действие малых доз радиации, фрагменты ДНК погибших клеток окисляются (вкДНКокс), проникают в цитоплазму живых клеток в популяции, и могут индуцировать в клетках окислительный стресс. Сравнительный анализ воздействия малых доз радиации (10 сГр) и окисленной внеклеточной ДНК (выделенной из среды культивирования облученных клеток) и модельных фрагментов вкДНК на МСК Исследование действия малых доз радиации (10 сГр) и окисленной внеклеточной ДНК на уровень активных форм кислорода в МСК Культуры МСК облучались дозой 10 сГр. Отдельно в среду культивирования МСК добавлялись образцы окисленной вкДНК (вкДНКокс) и вкДНК из среды культивирования облученных дозой 10 сГр клеток (вкДНКокс_обл) в концентрации 10-250 нг/мл и анализировали ранний ответ клеток (до 3 часов культивирования). Показано, что окисленные фрагменты вкДНК и малые дозы радиации (10 сГр) индуцируют кратковременный синтез АФК в МСК. Добавленные в среду культивирования МСК модельные окисленные фрагменты вкДНК и вкДНК облученных клеток (в концентрации 50 нг/мл), так же, как и облучение МСК дозой 10 сГр в течение первых 5-15 минут после воздействия, приводит к резкому увеличению синтеза АФК примерно в 2 раза. Через 45 минут после добавления к среде культивирования фрагментов окисленной вкДНК и воздействия радиации в дозе 10 сГр уровень АФК возвращался к контрольным значениям. Исследование действия малых доз радиации (10 сГр) и окисленной внеклеточной ДНК на экспрессию гена NOX4 Поскольку малые дозы радиации и вкДНКокс оказывали одинаковое влияние на синтез АФК, выдвинуто предположение, что они схожим образом регулируют экспрессию NOX4, синтезирующего свободные радикалы. И действительно, радиация в дозе 10 сГр, и фрагменты вкДНКокс и вкДНКокс_обл вызывают увеличение уровня экспрессии гена NOX4 через 10-20 минут после воздействия в 2-2,5 раза, возврат к контрольному уровню экспрессии гена происходит через 1 час после добавления к культивируемым клеткам фрагментов вкДНКокс и вкДНКокс_обл; и через 3 часа после облучения. Данные ПЦР по изменению транскрипционной активности гена NOX4 подтверждены методом проточной цитофлуориметрии на уровне изменения экспрессии белка. Исследование роли митохондрий в реализации ответа МСК на действие малых доз радиации (10 сГр) и фрагментов окисленной вкДНК Одним из источников АФК в цитоплазме клеток являются митохондрии. Проведено исследование изменения митохондриального потенциала в МСК с использованием красителя митохондрий – Mito-tracker Red 580 (TMRM red). Методом проточной цитофлуориметрии показано, что митохондриальный потенциал повышается в МСК в 2-3 раза при действии радиации в дозе 10 сГр через 0,5-3 часа так же, как и при действии окисленной вкДНК; через 24 часа происходит снижение митохондриального потенциала (рисунок 7). Рисунок 7. А - Митохондриальный потенциал в МСК через час после воздействия малых доз радиации и фрагментов вкДНКокс, метод флуоресцентной микроскопии. Увеличение Х40. Б Анализ митохондриального потенциала митохондрий при действии радиации в дозе 10 сГр и воздействии вкДНКокс (50 нг/мл). Метод проточной цитофлуориметрии. Митохондрии обеспечивают в клетках метаболическую активность, связанную с производством энергии путем окислительного фосфорилирования. Показано, что при действии радиации в дозе 10 сГр и после добавления к среде культивирования МСК окисленных фрагментов вкДНК в концентрации 50 нг/мл возрастает уровень экспрессии большого числа генов, регулирующих работу митохондрий (генов I, III, IV, V комплексов дыхательной цепи митохондрий: ACAD9, NDUFA1, NDUFA4, NDUFA5, NDUFA10, NDUFC2, NDUFS1, NDUFS2; BCS1L, CYC1, UQCRFS1, UQCRC1, UQCRH, CYB; SURF1, SCO1, COX15, COX5A; ATP2B4, ATP5B, ATP5C1, ATP5J, ATP5G3, ATP6, ATP8), причем экспрессия ряда генов остается повышенной через 24 часа после воздействия. Кроме того, выявлено, что радиация в дозе 10 сГр, так же, как и вкДНКокс вызывает в МСК повышение в 2-3 раза уровня экспрессии генов FIS1 и MFN1, регулирующих слияние и деление митохондрий в клетках, через 3-24 часа после воздействия. Облучение малыми дозами радиации (10 сГр) и окисленные фрагменты вкДНК вызывают окисление и образование разрывов ДНК ядер в МСК Через 20-30 минут после облучения или обработки фрагментами вкДНКокс и вкДНКокс_обл общий уровень флуоресценции 8-оксиdG увеличивается в 7-8 раз; через 2 часа уменьшается, но остается в 1,5-2 раза выше, чем уровень контроля. Окисленные фрагменты вкДНК и радиация в дозе 10 сГр приводили к образованию множественных разрывов ДНК в МСК, однако, через 3 часа после воздействия количество клеток, содержащих двунитевые разрывы ДНК, значительно снижалось. Двунитевые разрывы ядерной ДНК, образовавшиеся после воздействия радиации в дозе 10 сГр и окисленной вкДНК, оценивались методом проточной цитофлуориметрии с помощью антител к фосфорилированной форме гистона гамма-H2AX. Количество клеток с большим количеством маркера гамма-H2AX возрастает уже через 15 минут более чем в 2 раза после облучения МСК дозой 10 сГр и при действии окисленной ГЦ-ДНК (фракция R); контрольных значений уровень флуоресценции достигает через 3 часа. Таким образом, при действии радиации в дозе 10 сГр, так же, как и при действии окисленных фрагментов вкДНК в первые 15 минут после воздействия, происходит значительное, но кратковременное увеличение уровня АФК в МСК, наблюдается образование быстрорепарируемых одно- и двунитевых разрывов ДНК. Все исследованные показатели возвращаются к контрольным значениям через 3 часа. Облучение малыми дозами радиации (10 сГр) и окисленные фрагменты вкДНК вызывают репарацию ДНК Ядерные белки BRCA1 и BRCA2 участвуют в репарации разрывов ДНК и регуляции клеточного цикла. Окисленные фрагменты ДНК, также, как и малые дозы радиации, через 30 минут после воздействия вызывают 3,5-4,5-кратное увеличение уровня экспрессии генов BRCA1 и BRCA2, которое остается повышенным в 2-2,5 раза через 2 часа. Результаты подтверждены на уровне белка методом проточной цитометрии. После радиационного воздействия или после добавления окисленных фрагментов вкДНК через 0,5 - 2 часа уровень экспрессии BRCA и BRCA2 остается повышенным в 2-2,5 раза. Таким образом, при действии радиации в малых дозах и окисленных фрагментов вкДНК в МСК увеличивается уровень двунитевых разрывов и одновременно происходит активация репарации ДНК, что приводит к уменьшению количества разрывов в клетках в более поздние сроки наблюдения. Снижение пролиферации, как правило, совпадает по времени с арестом клеточного цикла. Радиация в дозе 10 сГр и добавление к среде культивирования МСК окисленных фрагментов вкДНК через 30 минут повышает количество клеток в фазе G1 и G0/G1, т.е. наблюдается кратковременный G1-арест клеточного цикла, что подтверждается снижением уровня экспрессии гена CCND1 в 1,5-2 раза и повышением уровня экспрессии генов CDKN2 и CDKN1A в 1,5-2 раза; через 3 часа показатели клеточного цикла в МСК возвращаются к контрольным, уровень экспрессии гена CCND1 повышается на 20-25 % по сравнению с контролем, а уровень экспрессии генов CDKN2 и CDKN1A снижается до контрольных значений. Таким образом, в значительной части ранее пролиферирующих клеток воздействие малых доз радиации (10 сГр) и добавление к среде культивирования окисленных фрагментов вкДНК кратковременно блокирует клеточный цикл в G1– фазе, что обеспечивает время для репарации повреждений, затем прогрессия клеточного цикла возобновляется. Малые дозы радиации (10 сГр) и фрагменты окисленной вкДНК активируют антиокислительный ответ в МСК, опосредованный транскрипционным фактором NRF2 Через 1 час после облучения дозой 10 сГр уровень экспрессии гена NRF2 увеличивается в 5,5 раз. Возрастает экспрессия гена NRF2 и после добавления к среде культивирования фрагментов вкДНКокс и вкДНКокс_обл: через час после воздействия повышается в 3-4 раза; через 2 часа после воздействия на МСК радиации и фрагментов вкДНКокс и вкДНКокс_обл экспрессия гена NRF2 возрастает в 4-8 раз по сравнению с контрольными клетками; через 3 часа уровень экспрессии NRF2 начинает снижаться, но все же остается в 3-5 раз выше контрольных значений. Через 3-6 часов уровень экспрессии генов-мишеней NRF2-сигнального пути – HMOX1 и NQO1 также возрастает в 2-3 раза как после действия радиации в дозе 10 сГр, так и при добавлении к МСК вкДНКокс и вкДНКокс_обл. Через 1-3 часа после действия малых доз радиации и фрагментов окисленной вкДНК уровень экспрессии гена SOD1 возрастает в 3-4 раза и остается повышенным в 2-2,4 раза в течение 6 часов. Облучение в дозе 10 сГр и добавление к среде культивирования окисленных фрагментов вкДНК не оказывает влияния на экспрессию гена KEAP1, кодирующего фактор, инактивирующий NRF2. Исследование влияния малых доз радиации и окисленной вкДНК на экспрессию транскрипционного фактора PPARG2, на его перемещение в ядро МСК Помимо NRF2-сигнального пути в антиокислительном ответе также участвует транскрипционный фактор PPARG2. Окисленные образцы вкДНК (вкДНКокс и вкДНКокс_обл) и малые дозы радиации (10 сГр) стимулировали увеличение экспрессии гена PPARG2 через 1 час после воздействия в 1,5-2,5 раза; уровень экспрессии белка PPARG2 через 3-24 часа после воздействия вкДНКокс и вкДНКокс_обл, и малых доз радиации (10 сГр) повышается на 35 – 40 % согласно данным проточной цитофлуориметрии. Данные, полученные методом проточной цитофлуориметрии, подтверждены методом флуоресцентной микроскопии: PPARG2 в контроле локализован в ядре, но уровень флуоресценции антител к PPARG2 незначителен, через 3 часа, как после действия окисленных образцов вкДНК, так и радиации в дозе 10 сГр, наблюдали повышение уровня флуоресценции антител к PPARG2 в ядрах МСК. Фрагменты окисленной вкДНК так же, как и малые дозы радиации, вызывают антиапоптотический ответ в МСК BCL2 представляет собой семейство белков, которые имеют решающее значение для выживания клеток и регуляции апоптоза. Антиапоптотические процессы активируются через 20 минут после облучения или добавления фрагментов вкДНКокс и вкДНКокс_обл в среду - уровни антиапоптотических генов BCL2, BCL2A1 (BFL-1/A1), BCL2L1 (BCL-X), BIRC2 (C-IAP1), и BIRC3 (C-IAP2) увеличиваются в 1,5-2,5 раза. Уровень экспрессии проапоптотического гена ВАХ незначительно увеличивается только через 20 минут после облучения или после добавления фрагментов вкДНКокс и вкДНКокс_обл. Гены семейства BCL2 увеличивают экспрессию через 2-24 часов после облучения или добавления фрагментов вкДНКокс и вкДНКокс_обл. Методами проточной цитофлуориметрии и флуоресцентной микроскопии показано, что экспрессия белка BCL2 увеличивается через 30 минут после облучения или добавления фрагментов вкДНКокс и вкДНКокс_обл; экспрессия белка BCL2 остается увеличенной через 2-42 часа после экспозиции. Уровень апоптоза клеток оценен с использованием стандартного метода – окраски клеток с использованием аннексина V (FITC). Через 15 минут после воздействия ИИ в дозе 10 сГр, вкДНКокс и вкДНКокс_обл количество клеток, взаимодействующих с аннексином V, возрастает в 2 раза, но через 2 часа падает по сравнению с контрольным уровнем. Таким образом, показано, что действие радиации в дозе 10 сГр и добавление к среде культивирования МСК окисленной вкДНК стимулируют сильный антиапоптотический ответ. Исследование экспрессии генов сигнальных путей, активирующихся в МСК при повреждении ДНК, после действия малых доз радиации (10 сГр) и фрагментов окисленной ДНК Наиболее значимым событием, сопровождающим действие малых доз радиации, является ингибирование апоптоза, которое наблюдается на протяжении 72 часов после облучения МСК радиацией в малых дозах и добавления к среде культивирования фрагментов окисленной вкДНК (50 нг/мл). В ответ на повреждение ДНК запускается сигнальный каскад, состоящий из последовательного включения генов ING2, HUVEL1, TP53, активирующих гены BBC3. NOXA, P53AIP1, что приводит к ингибированию гена BCL2, активации BAX, BAK, MMP, ENDOG и, в результате, к апоптозу клеток. Показано, что через 30-40 минут после облучения или добавления фрагментов вкДНКокс и вкДНКокс_обл к МСК наблюдается снижение уровня экспрессии генов HUVEL1, ING2, NOXA, TP53, BBC3, P53AIP1 ниже контрольных значений, а через 3 часа уровень экспрессии генов HUVEL1, ING2, NOXA, TP53, BBC3, P53AIP1, BAX, BAK, MMP, ENDOG снижался в 2-3 раза (p<0,001), что сопровождалось наблюдаемым ранее повышением уровня экспрессии гена BCL2, и, как следствие, снижением уровня апоптоза. Окисленные фрагменты вкДНК, а также малые дозы радиации вызывают адаптивный ответ в МСК Исследовано влияние окисленной вкДНК и малых доз радиации на выживание МСК, которые подвергались повторному облучению ИИ в дозе 2 Гр. МСК инкубировались в течение 3 часов в присутствии вкДНКокс и вкДНКокс_обл, а затем облучались 2 Гр. В другом эксперименте клетки сначала подвергались облучению дозой 10 сГр, культивировались в течение 3 часов, а затем снова облучались дозой 2 Гр и культивировали на свежих средах в течение 48 часов. С использованием теста МТТ продемонстрировано статистически значимое снижение гибели клеток, вызванного облучением в дозе 2 Гр в клетках, которые предварительно культивировались в присутствии окисленной вкДНК или предварительно облучались дозой 10 сГр (p <0,01, Рисунок ). Кроме того, инкубирование МСК в присутствии окисленной вкДНК в концентрации 50 нг/мл, так же, как и предварительное облучение дозой 10 сГр за 3 часа до облучения дозой 2 Гр, уменьшают долю клеток, содержащих гамма-H2AX-фокусы (Рисунок ). Рисунок 8. Влияние вкДНКокс на выживаемость клеток и образование γH2AX фокусов после воздействия излучения (2 Гр). А. МТТ-тест: Б: (1) Анализ методом проточной цитометрии количества клеток с γH2AX фокусами. Показаны данные для трех экспериментов и SD. (*) p <0,05. Рецепторы, через которые окисленные фрагменты вкДНК реализуют действие малых доз радиации Получив убедительные доказательства вовлеченности окисленных фрагментов вкДНК в реализацию воздействия малых доз радиации на МСК, возник вопрос, через какие рецепторы может вкДНК действовать на МСК. Проведен анализ экспрессии ДНК- сенсоров, которые могли бы быть потенциальными рецепторами, активирующимися под действием окисленной вкДНК: TLR9 и AIM2. Показано, что радиация в дозе 10 сГр, так же, как и вкДНКокс, и внеклеточная ДНК из среды культивирования радиационно-индуцированных МСК вызывает повышение экспрессии гена TLR9 в МСК в 2-3,3 раза (р <0,01) в раннее время после воздействия на клетки (через 20-60 минут), но уже через 3 часа наблюдается снижение уровня экспрессии TLR9, повышение уровня окисления вкДНК уменьшает ее активирующее действие. Полученные данные подтверждены методом проточной цитофлуориметрии. Добавление хлорохина как самостоятельно, так и совместно с облучением малыми дозами радиации, и добавлением окисленной вкДНК не приводило к активации экспрессии гена TLR9, гена MyD88 TLT9 сигнального пути, а также генов NF–kB сигнального пути. Показано, что радиация в дозе 10 сГр, так же, как и вкДНКокс1, и внеклеточная ДНК из среды культивирования радиационно-индуцированных МСК вызывает повышение экспрессии гена AIM2 в МСК в 2-2,5 раза (р <0,01) через 1-2 часа. Но уже через 24 часа наблюдается снижение уровня экспрессии AIM2, к 48 часам уровень экспрессии AIM2 снижается до контрольных значений. Таким образом, выявлено, что как при действии малых доз радиации, так и при действии окисленной вкДНК в ранние сроки кратковременно активируются ДНК- связывающие рецепторы TLR9 и AIM2, которые могут принимать участие в активации ряда сигнальных каскадов в МСК, что также подтверждает роль окисленной вкДНК как фактора стресс-сигнализации при действии малых доз радиации. Заключение В результате выполнения работы получено подтверждение нашей гипотезы о важной роли фрагментов внеклеточной ДНК в инициации ответа стволовых клеток на облучение в малых дозах. Радиация в дозах 3, 10 и 50 сГр в течение 30 минут вызывает сильный окислительный стресс в МСК, который сопровождается усиленным синтезом АФК и, соответственно, повышенной экспрессией гена NOX4. Окислительный стресс, индуцированный малыми дозами радиации, вызывает окислительные модификации ДНК и ее многочисленные разрывы, однако, происходит и активация антиокислительных сигнальных путей в МСК, систем репарации, что приводит к снижению апоптоза. На основании полученных результатов для продолжения работы выбрана доза радиации 10 сГр, так как она вызывает наиболее быстрый и сильный адаптивный ответ на образование разрывов ДНК. Радиация в дозе 3 сГр также способствует развитию адаптивной реакции, но менее заметной по сравнению с радиацией в дозе 10 сГр. Доза радиации 50 сГр приводит к сильным повреждениям в МСК, не влияя на адаптивный ответ МСК (рисунок 5). Продемонстрировано, что облучение приводит к увеличению окисленной вкДНК в среде культивирования. Окислительная модификация вкДНК способствует проникновению вкДНК в МСК. При сравнении действия на МСК радиации (10 сГр), а также модельных окисленных фрагментов ДНК (вкДНКокс) и вкДНК из среды облученных клеток, убедительно доказано, что реакция МСК на облучение в малых дозах может быть опосредована окисленными фрагментами вкДНК: ответы клеток на окисленную вкДНК идентичны ответам на воздействие излучения в дозе 10 сГр. Каскад событий при воздействии радиации в малых дозах может быть следующим: облучение → первичный окислительный стресс → окисление геномной ДНК → апоптоз некоторых облученных клеток → выделение окисленной вкДНК → синтез АФК → АФК индуцируют окислительные модификации геномной ДНК, происходит репарация ДНК-повреждений и кратковременная остановка клеточного цикла → активация систем репарации ДНК и антиоксидантного ответа → ингибирование апоптоза → радиоадаптивный ответ. Полученные данные свидетельствуют о том, что вкДНКокс_обл, возникающая после облучения МСК, является фактором стресс-сигнализации, опосредующим радиационно- индуцированный эффект свидетеля и, кроме того, является важным компонентом развития радиоадаптивного ответа при облучении в малых дозах. ВЫВОДЫ 1. Радиация в дозе 3 сГр, 10 сГр и 50 сГр в течение первых 20 минут после воздействия активирует синтез АФК, что коррелирует с повышенной экспрессией гена NOX4 и приводит к образованию окислительных модификаций и множественных разрывов ДНК, число которых снижается через 2 часа после действия радиации в дозе 3 сГр и 10 сГр; радиация в дозе 50 сГр не активирует репарацию ДНК и антиокислительный ответ, что приводит к гибели части клеток с множественными повреждениями. 2. В результате действия малых доз радиации (10 сГр) часть клеток погибает, в среде культивирования МСК в 2 раза возрастает концентрация окисленной вкДНК; окисленная вкДНК проникает в цитоплазму МСК; эффективность проникновения вкДНК возрастает с увеличением уровня 8-oxodG в ее составе. 3. Наблюдается идентичный ранний ответ МСК, как на радиацию в дозе 10 сГр, так и на окисленные фрагменты вкДНК (50 нг/мл), действующий до 3 часов: происходит значительное, но кратковременное увеличение уровня АФК в МСК, коррелирующее с повышенной экспрессией гена NOX4 и семейства генов, регулирующих комплексы дыхательной цепи митохондрий; наблюдается образование окислительных модификаций и быстрорепарируемых одно- и двунитевых разрывов ДНК в первые 15 минут после воздействия. 4. Выявлено, что и радиация в дозе 10 сГр, и окисленные фрагменты вкДНК (50 нг/мл) активируют в МСК транскрипцию генов репарации BRCA1, BRCA2 в течение 24 часов, генов антиокислительного NRF2-сигнального пути (NRF2, KEAP1, SOD1) в течение 6 часов; активацию транскрипционных факторов NRF2 и PPARG и их перемещение в ядро; через 30 минут после воздействия наблюдается кратковременный (в течении 3 часов) G1- арест клеточного цикла в МСК. 5. Определено, что сниженный уровень апоптоза в МСК через 3 часа после действия малых доз радиации и окисленной вкДНК запускает механизм ингибирования экспрессии генов ING2, HUVEL1, TP53, BBC3. NOXA, P53AIP1, BAX, BAK, MMP, ENDOG; в реализации антиапоптотического эффекта, вызванного малыми дозами радиации, задействован ВCL2-сигнальный путь. 6. Показано, что окисленная вкДНК является медиатором развития радиоадаптивного ответа при действии малых доз радиации на МСК: инкубирование МСК в присутствии окисленной вкДНК в концентрации 50 нг/мл, так же, как и предварительное облучение дозой 10 сГр за 3 часа до облучения дозой 2 Гр уменьшают долю клеток, содержащих двунитевые разрывы и снижает уровень гибели клеток в популяции. При действии окисленной вкДНК в ранние сроки и кратковременно активируются ДНК-связывающие рецепторы TLR9 и AIM2, которые могут принимать участие в активации ряда сигнальных каскадов в МСК. 7. Выявлено, что окисленные в результате действия радиации фрагменты вкДНК играют роль сигнальных молекул стресс-сигнализации в радиационно-индуцированном эффекте свидетеля – передают сигнал от облученных клеток к необлученным и запускают вкДНК-сигнальный путь, включающий следующую последовательность событий в МСК: действие ионизирующего излучения на МСК→ первичный окислительный стресс → окисление геномной ДНК (гДНК) МСК→ апоптоз некоторого количества облученных клеток → освобождение окисленной вкДНК → синтез активных форм кислорода → активные формы кислорода вызывают окислительные модификации ДНК ядер клеток, образование быстрорепарируемых разрывов ДНК ядер, кратковременный арест клеточного цикла → активируется репарация ДНК, активируется антиокислительный ответ в МСК→ ингибируется апоптоз.