Морфофункциональная характеристика мужских половых желез потомства самок крыс с экспериментальным сахарным диабетом 1 типа

Исследования проведены на базе кафедры Гистологии, эмбриологии и цитологии ФГБОУ ВО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, ГБУЗ «Челябинское областное патологоанатомическое бюро», лабораторной службы «Хеликс» (МС «Ваш доктор»), ДНК клиники (ООО «Личный доктор») в период с 2018 по 2020 г.
Работа с лабораторными животными осуществлялась в соответствии с «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18.03.1986 г. Проведение исследования одобрено на заседании этического комитета ФГБОУ ВО ЮУГМУ Минздрава No8 от 12.11.2018., а так же одобрено изменение темы диссертационного исследования на заседании этического комитета ФГБОУ ВО ЮУГМУ Минздрава No3 от 24.04.2020.
Исследования проведены на белых лабораторных крысах (самках) линии Wistar и их потомстве в различные сроки постнатального развития. Мужское потомство от самок крыс с экспериментальным сахарным диабетом 1 типа составило группу «опыт», а интактные крысята соответствующего возраста были рождены от здоровых самок и составили группу «контроль». В общей сложности в работе использовано 93 контрольных крысёнка и 99 крысят опытной группы. Из них 10 крысят контрольной группы и 12 крысят опытной группы в возрасте 70 суток подвергались иммобилизационному стрессу, в результате чего из них были дополнительно сформированы группы «контроль-стресс» и «опыт-стресс» соответственно. Животных групп «контроль» и «опыт» изучали в различные сроки постнатального развития, в том числе на 1-ый, 15-ый, 30-ый, 45-ый, 70-ый и 90-ый дни. Таким образом, в контрольной группе мы использовали 11 новорождённых, по 8 крысят в возрасте 15, 30 и 45 суток, 26 семидесятидневных крысят и 22 – в возрасте 90 суток. Группа «опыт» состояла из 13 новорождённых крысят, по 9 крысят 15-, 30- и 45-дневных, 24 крысёнка в возрасте 70 суток, 23 – в возрасте 90 суток.
Для достижения поставленной цели у половозрелых крыс (самок) до беременности моделировали сахарный диабет 1 типа с использованием стрептозотоцина (Streptozotocin, «MP Biomedicals, LLC», Франция) (Закирьянов А.Р. и др., 2007; Гвазава И. Г. и др., 2018; Akbarzadeh A. et al., 2007). Для получения адекватной устойчивой аутоиммунной модели сахарного диабета 1 типа нами использовалась общепринятая методика (Патент No2400822
Российская Федерация. Способ моделирования сахарного диабета I типа у крыс). Животным внутрибрюшинно трижды с интервалом 7 дней вводили раствор стрептозотоцина. При этом во время первого и третьего введения количество препарата определяли из расчёта 25 мг на 1 кг массы тела животного, а во время второго введения – 20 мг на 1 кг массы тела самки. В результате развивалась выраженная и стойкая гипергликемия. Подсадка самок с экспериментальным сахарным диабетом 1 типа к интактным самцам для спаривания проводилась через 1 неделю после третьего введения стрептозотоцина. В результате рождались подопытные крысята.
Исследования проводились с учетом суточных и сезонных колебаний. Все лабораторные животные содержались в одинаковых условиях вивария ФГБОУ ВО ЮУГМУ Минздрава России и с одинаковым пищевым рационом.
Морфофункциональное состояние мужской репродуктивной системы экспериментальных животных оценивали комплексно с использованием биологических, морфологических, морфометрических, иммуноморфологических, биохимических, физиологических и статистических методов исследования.
При исследовании степени физиологической зрелости потомства экспериментальных животных использовали общепринятые критерии: численность пометов, в том числе число живых и мертвых родившихся плодов. Кроме того проводилась оценка жизнеспособности животных по числу крысят, доживших до 2 суток и до 15 суток.
Для оценки степени физиологической незрелости регистрировали время исчезновения признаков имматурантности. На всех основных сроках внеутробного развития определяли массу тела крыс и вычисляли показатель ежедневного прироста массы экспериментальных животных (Брюхин Г.В., 1995).
Отпрепарированные яички взвешивали и определяли весовой индекс, который представляет собой отношение массы органа к массе тела животного, выраженное в процентах. Затем левые семенники фиксировали в стандартном растворе фиксатора Буэна с последующей проводкой материала по общепринятой методике. Далее материал заливали в парафиновые блоки, ориентируя фрагменты параллельно плоскости среза. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином, галлоцианином и хромовыми квасцами по Эйнарсону, железным гематоксилином по Гейденгайну (Лилли Р.,1980; Микроскопическая техника, 1996).
Оценку генеративной функции семенников производили с использованием ряда гистоморфометрических критериев, а именно проводили измерения стромального компонента и паренхимы мужской половой железы (Брюхин Г.В., Сизоненко М.Л., 2015; Мамина В.П., 2016). В частности, измеряли толщину соединительнотканной капсулы, площадь межканальцевой соединительной ткани семенников. При изучении паренхимы органа в первую очередь оценивали её площадь, а также производили подсчёт в единице условной площади количества канальцев, площадь поперечного сечения семенных извитых канальцев и толщины сперматогенного эпителия (Ухов Ю.И., Астраханцев А.Ф., 1983). Оценку гистоморфометрических параметров производили с использованием автоматизированной системы захвата и обработки изображения с программным обеспечением «ВидеоТест-Морфология» 5.0.
Цитологический анализ клеток сперматогенного эпителия (сустентоцитов и сперматогенных клеток) производили из расчёта на один извитой семенной каналец. Для
анализа цитологического профиля сперматогенеза проводили подсчет суммарного количества сперматогенных клеток канальцев, а также анализ их субпопуляционного состава. В частности, производился подсчёт сперматогоний различной степени зрелости (сперматогоний типа А, промежуточного типа, типа В), а также их суммарного количества, первичных и вторичных сперматоцитов, ранних и поздних сперматид и сперматозоидов (Современные проблемы сперматогенеза, 1982; Ухов Ю.И., Астраханцев А.Ф., 1983).
Для оценки патоморфологических изменений яичек производили подсчёт аномально изменённых извитых семенных канальцев, в том числе канальцев со слущенным эпителием и канальцев, содержащих гигантские многоядерные клетки из расчёта на 100 случайных канальцев (Саноцкий И.В., Фоменко В.Н., 1979; Иванов Ю.В., 1986; Логинова А.К. и др., 2014).
Кроме того, производили подсчет ряда функциональных индексов, являющихся, по мнению многочисленных исследователей (Ухов Ю.И., Астраханцев А.Ф., 1983; Саноцкий И.В., Фоменко В.Н., 1979; Иванов Ю.В., 1986), чувствительным индикатором состояния сперматогенеза. Определяли индекс сперматогенеза, который представляет собой отношение числа слоев сперматогенного эпителия к числу подсчитанных канальцев (из расчёта на 100 случайных канальцев). Герминативный индекс высчитывали по отношению числа сперматогоний к числу сустентоцитов. Клеточный индекс Сертоли (индекс напряженности сперматогенеза) равен отношению суммарного содержания зародышевых клеток различных типов, в том числе сперматогоний, сперматоцитов, сперматид и сперматозоидов, к числу сустентоцитов. Индекс зрелости (созревания) сперматогенеза – отношение числа суммарного содержания сперматогоний и сперматоцитов (менее зрелых форм сперматогенных клеток) к суммарному содержанию сперматид и сперматозоидов (более зрелых форм). Для последних трёх показателей в расчет брались не менее 30 извитых семенных канальцев.
О состоянии эндокринного компартмента семенников экспериментальных животных мы судили на основании анализа интерстициальных эндокриноцитов. При этом производили подсчёт суммарного содержания клеток Лейдига (в 30 полях зрения), а также абсолютного и относительного количества интерстициальных эндокриноцитов в зависимости от их морфофункциональных типов, в том числе фракции активных и неактивных эндокриноцитов (Сизоненко М.Л., Брюхин Г.В., 2012). Индекс активности интерстициальных эндокриноцитов подсчитывали как отношение абсолютного числа активных клеток к содержанию неактивных клеток (Брюхин Г.В., Сизоненко М.Л., 2015b). Наконец, высчитывали коэффициент, отражающий отношение числа клеток Лейдига к количеству клеток Сертоли, и коэффициент, равный числу клеток Лейдига, делённому на количество сперматогенных клеток (Брюхин Г.В., Сизоненко М.Л., 2015b).
Для оценки пролиферативной активности сперматогенных клеток на серийных гистологических препаратах правых семенников экспериментальных животных иммуногистохимически определяли Ki-67-позитивные клетки в 20 полях зрения. Окраску проводили с использованием первичных поликлональных антител Ki-67 с докраской ядер гематоксилином по общепринятой методике (Шарафутдинова Л.А. и др., 2018).
Для определения уровня апоптотической активности выявляли экспрессию проапоптотического белка Caspase-3. Идентификацию Caspase-3-позитивных клеток так же проводили в 20 полях зрения (Логинова А.К. и др., 2014).
С целью подсчёта мужских половых клеток зрелые сперматозоиды получали из отпрепарованного левого придатка семенника по общепринятой методике (Саноцкий И.В., Фоменко В.Н., 1979; Луцкий Д.Л., Николаев А.А., 1999). В камере Горяева производили подсчёт сперматозоидов с последующим пересчётом для определения содержания сперматозоидов в единице объема (1мл) эпидидимальной суспензии (Муравлёва Л.Е. и др., 2007; Тиктинский О.Л. и др., 2010).
Кроме того подсчитывали абсолютное и относительное количество сперматозоидов в единице объема (1 мл) эпидидимальной суспензии с учетом характера их подвижности. Подвижность оценивали по общепринятой системе, а именно выделяли прогрессивно- подвижные, слабоподвижные, «дергающиеся» и неподвижные сперматозоиды. При этом, прогрессивно-подвижные и слабоподвижные относили к фертильной фракции, а «дёргающиеся» и неподвижные – к нефертильной фракции эпидидимальных сперматозоидов (Луцкий Д.Л., Николаев А.А., 1999; Ласьков Д.С. и др., 2014). Далее вычисляли индекс фертильности (отношение числа фертильных форм к нефертильным). Для определения жизнеспособности сперматозоидов их подсчёт с учётом подвижности проводился в течение 1 часа через каждые 15 минут, а в дальнейшем через каждые 30 мин до полной остановки всех сперматозоидов (Молнар Е.Ю., 1969; Луцкий Д.Л., Николаев А.А., 1999).
Для оценки патологических форм сперматозоидов подсчитывали абсолютное и процентное содержание сперматозоидов в единице объема (1мл) эпидидимальной суспензии с дефектами головки, шейки, средней части и хвостика (Молнар Е.Ю., 1969; Wyrobek A.J., Bruce W.R.,1975; Kuriyama K. et al., 2005).
Для определения кислотной резистентности сперматозоидов 1,5 мл эпидидимальной суспензии помещали в чашку Петри и добавляли по каплям 0,1 N раствор соляной кислоты до полной остановки движения половых клеток. При этом с помощью pH-метра ИТ-1101 с электродом регистрировали реакцию pH, при которой все сперматозоиды останавливались (Саноцкий И.В., Фоменко В.Н., 1979).
При оценке осмотической резистентности сперматозоидов изготавливали шкалу растворов хлорида натрия от 1,5 до 4 % (с интервалом 0,25%). На предметные стекла с лунками помещали по 0,05 мл суспензии и вносили поочередно из каждой пробирки равное количество раствора (от меньшей концентрации к большей), устанавливая ту концентрацию, при которой под микроскопом наблюдается полная остановка половых клеток (Саноцкий И.В., Фоменко В.Н., 1979).
Для оценки повреждения генетического материала сперматозоидов проводили определение их фрагментации ДНК, используя метод дисперсии хроматина спермы (sperm chromatin dispersion, SCD) c помощью набора GoldCyto DNA Assist Kit («mtm laboratories AG», Германия) с окраской по Романовскому-Гимзе (Fernández J.L. et al., 2003).
Концентрацию тестостерона крови у экспериментальных животных определяли методом электрохемилюминесцентного иммуноанализа. Забор крови осуществляли из сердца под эфирным наркозом по общепринятой методике в определённое время суток (10.00), после чего животных выводили из эксперимента (Лабораторные животные…, 1983). Уровень тестостерона (нмоль/л) определяли в сыворотке крови.
Проведено исследование особенностей полового поведения экспериментальных животных. Половое поведение оценивали у трёхмесячных экспериментальных животных контрольной и опытной групп по общепринятой методике в тёмное время суток с 22.00 до
05.00 (Амстиславская Т.Г., Осипов К.В., 2003; Байрамов А.А., 2009). Использовали испытательную камеру размером 40х40х30 см при тусклом красном освещении. Камеру разделяли прозрачной перфорированной перегородкой и помещали в нее исследуемого самца. Через 5 минут после этого самцу предъявляли интактную самку в состоянии эструса, что определяли с помощью влагалищных мазков (Котельников А.В., Котельников С.В., 2005). Регистрировали и оценивали элементы поведенческой и репродуктивной активности в течение 15 минут в тестах: 1) с перегородкой и без самки, 2) с перегородкой и самкой и 3) без перегородки и с самкой. За время наблюдения учитывали такие компоненты полового поведения, как количество подходов к перегородке, время у перегородки (в минутах), количество подходов к самке, время нахождения с самкой (в минутах) и количество садок (Тихонова М.А., Амстиславская Т.Г., 2015).
Для оценки фертильности мужского потомства самок крыс с экспериментальным сахарным диабетом исследуемых самцов (12 самцов из 10 помётов в опытной группе и 12 самцов из 12 помётов в контрольной группе) в возрасте 3-х месяцев для спаривания подсаживали к интактным самкам в состоянии эструса и в соотношении один самец к двум самкам. Факт спаривания с самкой подтверждался наличием сперматозоидов во влагалищных мазках у самки, и этих самок считали условно оплодотворёнными. Определяли абсолютное и относительное число условно оплодотворённых и неоплодотворённых самок. Оценивали индекс фертильности, представляющий собой соотношение числа самок, спаренных с самцами, к общему числу самок, подсаженным к самцам, выраженное в процентах. (Егорова Е.А. и др., 2014). Далее подсчитывали доли забеременевших и незабеременевших самок как от условно оплодотворённых, так и от всех самок, подсаженных к самцам. Так же определяли индекс оплодотворения, который равен отношению количества беременных самок к количеству условно оплодотворённых самок, выраженное в процентах (Егорова Е.А. и др., 2014; Motrich R. D. еt al, 2009).
С целью изучения особенностей антистрессорной резистентности мужских половых желёз у подопытных животных моделировали иммобилизационный стресс. Для этой серии исследования стрессовое воздействие вызывали у десяти 70-дневных интактных животных из 8 помётов. Из крысят опытной группы того же возраста для моделирования стресса использовали 12 животных из 11 помётов. Иммобилизацию вызывали путем жёсткой фиксации животных на спине в камере Когана. Первоначально иммобилизация продолжалась с 10.00 до 15.00 час. Затем после 2 часов отдыха животных вновь помещали в камеру на ночь. На следующее утро в 10.00 иммобилизацию прекращали, а 17.00 того же дня животных вновь подвергали иммобилизации до 10.00 утра (Лобанова Н.Н. и др., 1986; Брюхин Г.В. и др., 2014). С целью изучения репродуктивной функции подопытных животных оценивали толщину сперматогенного эпителия, цитологический анализ эпителиосперматогенного слоя с определением общепринятых индексов, содержание патологических извитых семенных канальцев, интерстициальных эндокриноцитов, количество сперматозоидов, их подвижность и жизнеспо собность, содержание их аномальных форм.
Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием программы «IBM SPSS Statistics 22». Учитывая небольшой размер выборок, использовали непараметрические критерии. Для количественных признаков рассчитывали следующие показатели описательной статистики: медиану (Me) и квартили (Q1; Q3). В тех случаях,
когда переменная содержала большое количество одинаковых значений, медиана и квартили были дополнены средней арифметической (M) и стандартной ошибкой (m). Для сравнения двух независимых групп по количественному признаку использовали непараметрический критерий Манна–Уитни. Для сравнения двух независимых групп по качественному признаку использовали непараметрический критерий хи-квадрат Пирсона, при малом количестве наблюдений использовали точный критерий Фишера. При сравнении четырёх групп на первом этапе использовали критерий для сравнения множественных несвязанных выборок Краскелла-Уоллиса. При выявлении неоднородности полученных групп характер межгрупповых различий уточняли с помощью U-критерия Манна–Уитни с поправкой Бонферрони. Для четырёх групп использовали три попарных множественных сравнения и в качестве критического уровня значимости для множественных сравнения использовали р = 0,0167. Для оценки силы и направления связи между признаками использовали корреляционный анализ с расчётом коэффициента корреляции Спирмена.
СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Биологическая характеристика потомства экспериментальных животных
Прежде всего, нами проведён анализ особенностей биологических показателей потомства экспериментальных животных, в том числе численности потомства самок крыс с экспериментальным сахарным диабетом, их мёртворождаемости и жизнеспособности. У животных опытной группы рождалось меньшее количество крысят, чем у интактных самок. Так установлено, что у потомства самок крыс с экспериментальным сахарным диабетом 1 типа общее число крысят в помёте составило 8,1 ± 0,6, в то время как контрольных животных этот показатель оказался значительно выше и равен 10,4 ± 0,6. При этом внутриутробная и внеутробная смертность оказались существенно выше, чем в контроле. Число мертворождённых крысят в опытной группе составило 1,1 ± 0,2, в то время как в контрольной – 0,4 ± 0,1. Кроме того, у животных опытной группы имеет место более длительное сохранение признаков имматурантности относительно контрольной группы.
Далее мы выявили изменения показателей массы животных. Как видно из рисунка 1, в первый день после рождения масса подопытных животных оказалась на 10 % больше, чем в контроле, то есть имела место макросомия. Однако во все остальные сроки масса тела крыс опытной группы была ниже относительно контрольной.
Таким образом, анализ полученных результатов первой серии исследований позволяет сделать заключение, что у самок крыс с экспериментальным сахарным диабетом рождается физиологически незрелое потомство.
Характеристика генеративного компартмента мужских половых желёз экспериментальных животных
В следующей серии исследований нами проведена оценка морфофункционального становления генеративной функции яичек экспериментальных животных.
При исследовании массы семенников животных было выявлено, что практически на всех сроках исследования у подопытных животных она была снижена по сравнению с группой контроля.
250.0 200.0 150.0 100.0
50.0 0.0
205.0 165.3
132.4
60.8 43.932.0
Контроль Опыт
7.07.7
26.4 20.1
1 15 30 45 70
Возраст, сутки
Рисунок 1. Масса экспериментальных животных в различные сроки постнатального периода, Me (Q1; Q3)
П р и м е ч а н и е : вертикальные отрезки соответствуют первому (Q1) и третьему (Q3) квартилям; результаты статистически значимы по сравнению с контролем (p < 0,05) Для оценки морфофункционального становления мужских половых желез мы использовали гистоморфометрические методы. Установлено, что на большинстве сроков наблюдения в семенниках подопытных животных имеет место повышение площади стромы и снижение площади паренхимы (рисунок 2), а также снижение площади извитых семенных канальцев и повышение числа канальцев на единицу условной площади по сравнению с контролем (рисунок 3). Почти на всех сроках наблюдения отмечается значимое снижение толщины сперматогенного эпителия у подопытных животных. АБ Рисунок 2. Яичко новорождённого крысёнка контрольной (А) и опытной (Б) групп. В семенниках животных опытной группы повышено содержание соединительнотканного компонента. Окраска: гематоксилин и эозин. Микрофото. Ув. ×100 (об. ×10; ок. ×10). Наибольший интерес представляют данные цитологического анализа сперматогенного эпителия, представленного двумя генерациями клеток: сустентоцитами и сперматогенными клетками. Установлено, что у потомства самок крыс с экспериментальным сахарным диабетом на всех сроках исследования суммарное число сперматогенных клеток значительно снижено по сравнению с контролем (таблица 1). Масса тела, г АБ Рисунок 3. Яичко крысёнка в возрасте 45 суток контрольной (А) и опытной (Б) групп. В семенниках животных опытной группы снижена площадь канальцев и повышено количество канальцев на единицу условной площади. Окраска: гематоксилин и эозин. Микрофото. Ув. ×100 (об. × 10; ок. × 10). Таблица 1. Суммарное число сперматогенных клеток семенников потомства самок крыс с экспериментальным диабетом, Me (Q1; Q3) Срок 1 сутки 15 дней 30 дней 45 дней 70 дней Контроль n = 45 10,1 (9,9; 11,8) 52,2 (51,7; 57,4) 139,1 (129,0; 152,1) 268,5 (263,6; 276,7) 493,5 (481,4; 517,9) Опыт n = 52 7,8 (7,2; 8,4) 36,2 (34,9; 36,6) 93,6 (86,4; 98,8) 176,5 (170,3; 182,1) 338,0 (322,0; 349,4) Примечание: результаты статистически значимы по сравнению с контролем (р < 0,001) Более углублённые представления о нарушении становления генеративной функции семенников показывают данные субпопуляционного состава сперматогенных клеток с учетом их зрелости. Так, общее содержание сперматогоний у подопытных животных снижено по сравнению с контролем за счёт их зрелых форм – сперматогоний типа В. В то же время какой-либо закономерности в изменении содержания незрелых сперматогоний типа А и сперматогоний промежуточного типа у животных контрольной и опытной групп мы не наблюдали. Следует отметить, что на всех сроках наблюдения число сперматоцитов, ранних и поздних сперматид и сперматозоидов в извитых семенных канальцах подопытных крысят оказалось снижено по сравнению с контролем. На большинстве сроков наблюдения у потомства самок крыс с экспериментальным сахарным диабетом количество сустентоцитов в семенниках снижено по сравнению с контрольными животными. Так, например, у подопытных животных в начале и в конце периода полового созревания число клеток Сертоли составило 6,4 (5,9; 6,7) и 12,2 (11,7; 13,6) соответственно, при этом у интактных крысят данный показатель составил 7,2 (7,0; 7,6) и 15,5 (15,6; 16,5) соответственно. Вместе с тем на всех сроках имеет место снижение клеточного индекса Сертоли. При этом индекс зрелости сперматогенеза у 45- и 70-дневных подопытных крысят превышает таковой в контроле, что обусловлено преобладанием в сперматогенном эпителии ранних (незрелых) форм зародышевых клеток, что может свидетельствовать либо о повышенной гибели клеток на стадии сперматид и сперматозоидов, либо о нарушении процесса дифференцировки половых клеток. В связи с этим определяли уровень пролиферативной и апоптотической активности сперматогенных клеток путём подсчёта Ki67-позитивных и Caspase-3-позитивных клеток сперматогенного эпителия. Так, почти на всех сроках наблюдения у подопытных животных уровень пролиферативной активности оказался выше, чем контроле (рисунок 4). АБ Рисунок 4. Яичко новорождённого крысёнка контрольной (А) и опытной (Б) групп. У подопытных животных повышено число Ki-67-позитивных клеток эпителиосперматогенного слоя по сравнению с контролем. Окраска с использованием первичных поликлональных антител Ki-67 с докраской ядер гематоксилином. Микрофото. Ув. × 400 (об. × 40; ок. × 10) При этом у подопытных животных имеет место повышенное число Caspase-3- позитивных сперматогенных клеток по сравнению с контролем на большинстве сроков наблюдения (рисунок 5). АБ Рисунок 5. Яичко крысёнка в возрасте 30 суток контрольной (А) и опытной (Б) групп. У подопытных животных повышено количество Caspase-3-позитивных клеток эпителиосперматогенного слоя. Идентификация синтеза проапоптотического белка Caspase- 3-позитивных клеток эпителиосперматогенного слоя с докраской ядер гематоксилином. Микрофото. Ув. × 400 (об. 40; ок. 10) При исследовании физиологических параметров эпидидимальных сперматозоидов экспериментальных животных нами выявлено, что у половозрелого потомства самок крыс с экспериментальным сахарным диабетом выявлено снижение концентрации эпидидимальных сперматозоидов по сравнению с контролем (рисунок 6), что сопровождалось значительным увеличением числа их аномальных форм, снижением их двигательной активности и жизнеспособности. АБ Рисунок 6. Эпидидимальные сперматозоиды половозрелого крысёнка в возрасте 70 суток контрольной (А) и опытной (Б) групп. Снижено количество сперматозоидов. Микрофото. Ув. × 100 (об. × 10; ок. × 10) Как видно из рисунка 7, у подопытных животных содержание фертильных форм сперматозоидов сохранялось только до 60-й минуты, а начиная с 90-й минуты все сперматозоиды эпидидимальной суспензии оказывались уже нефертильными. В то время как у животных группы сравнения единичные фертильные сперматозоиды регистрировались даже на 120-й минуте, а нефертильными сперматозоиды стали только на 150-й минуте наблюдения. Вместе с тем, нами установлено снижение кислотной и осмотической резистентности эпидидимальных сперматозоидов в группе «опыт» по сравнению с контролем. Так у подопытных животных показатель рН, при котором возникло полное обездвиживание сперматозоидов, составил 3,9 (3,7; 4,3). В то же время у контрольных животных данный показатель составил 3,1 (2,9; 3,2). При исследовании осмотической резистентности у потомства самок крыс с экспериментальным сахарным диабетом полная остановка движения сперматозоидов оказалась при добавлении к эпидидимальной суспензии 2,6 (2,5; 3,3) % р-ра натрия хлорида. В контрольной группе данный показатель составил 3,5 (3,0; 3,8)%. С целью оценки нарушения упаковки генетического материала оценивали фрагментацию ДНК сперматозоидов. Фрагментация ДНК, т.е. накопление разрывов нуклеотидной цепи, возникает в результате нарушения упаковки ДНК при созревании сперматид и является одним из маркеров апоптоза. Так, отечественными и зарубежными исследователями показано, что повышение уровня фрагментации ДНК негативно влияет на фертильность. Нами установлено, что данный показатель у животных опытной группы оказался в 2,5 раза выше, чем в группе сравнения (рисунок 8). А 0 15 30 45 60 75 90 105120135150165180 Время, минуты 100.0 90.0 83.477.5 80.0 70.0 71.5 59.7 45.4 27.0 35.4 28.9 60.0 62.4 50.0 Контроль Опыт 40.0 30.0 20.0 10.0 0.0 3.1 0.0 3.2 1.5 0.0 Б 0.0 0 15 30 45 60 75 90 105120135150165180 Время, минуты 100.0 90.0 80.0 70.0 60.0 96.9 64.6 71.1 73.0 100.0 96.8 98.5 100.0 50.0 37.6 54.6 Контроль Опыт 40.0 28.5 40.3 30.0 20.0 22.5 10.0 16.6 Рисунок 7. Динамика содержания фертильных (А) и нефертильных (Б) сперматозоидов в эпидидимальной суспензии П р и м е ч а н и е : вертикальные отрезки соответствуют первому (Q1) и третьему (Q3) квартилям; результаты статистически значимы по сравнению с контролем (р < 0,001) АБ Рисунок 8. Эпидидимальные сперматозоиды половозрелого крысёнка в возрасте 70 суток контрольной (А) и опытной (Б) групп. У подопытных животных повышенное содержание сперматозоидов с фрагментацией ДНК (указаны стрелками). Окраска по Романовскому-Гимзе. Микрофото. Ув. × 400 (об. × 40; ок. × 10) Количество нефертильных Количество фертильных сперматозоидов, % сперматозоидов, % Характеристика эндокринного компартмента мужских половых желёз экспериментальных животных В следующей серии исследований мы изучали эндокринный компартмент семенников экспериментальных животных. Установлено, что у животных опытной группы на большинстве сроков исследования снижено суммарное содержание клеток Лейдига. При этом процентное содержание активных клеток Лейдига семенников животных опытной группы в более поздние сроки постнатального развития превышало данный показатель в группе «контроль» (рисунок 9). Так, например, у потомства самок крыс с экспериментальным сахарным диабетом в период половой зрелости суммарное число клеток Лейдига составило 20,7 (17,8; 25,0), из них 76,3 (68,7; 79,0) % представлены активными эндокриноцитами. Вместе с тем, в контрольной группе из общего числа клеток Лейдига – 32,9 (28,0; 34,9) – активные составили только 64,7 (64,2; 69,8) %. Данные изменения, на наш взгляд, могут быть связаны с развитием компенсаторно-приспособительных реакций, направленных на поддержание продукции тестостерона. Однако, несмотря на это, при исследовании уровня тестостерона в крови животных в группе «опыт» данный показатель всё равно оказался ниже, чем в группе «контроль». Увеличение у потомства самок крыс с экспериментальным сахарным диабетом общего содержания активных клеток Лейдига до уровня более высокого, чем в контроле, обусловило на большинстве сроков наблюдения рост индекса активности интерстициальных эндокриноцитов. АБ Рисунок 9. Яичко крысёнка в возрасте 70 суток контрольной (А) и опытной (Б) групп. В семенниках животных опытной группы преобладают активные эндокриноциты над неактивными. Окраска: гематоксилин и эозин. Микрофото. Ув. ×1000 (об. × 100; ок. × 10). Оценка полового поведения и фертильности экспериментальных животных У половозрелых трёхмесячных крыс мы проводили оценку элементов поведенческой и репродуктивной активности. При этом выявлено нарушение полового поведения подопытных животных, а также установлено снижение их фертильности. Так, из 24 самок, подсаженных к самцам группы «опыт», условно оплодотворёнными (т.е. с наличием сперматозоидов во влагалищных мазках) оказалась только 21 самка. Из них, только 17 оказались беременными. Таким образом, только 71 % самок, которые были подсажены к подопытным самцам, смогли забеременеть. Обращает на себя внимание, что все самки, подсаженные к самцам контрольной группы были, оплодотворены и забеременели. Исходя из того, что у потомства самок крыс с экспериментальным сахарным диабетом наблюдается уменьшение концентрации эпидидимальных сперматозоидов, снижение их двигательной активности, жизнеспособности, повышенное содержание их аномальных форм, подавление половой активности и нарушение наступления беременности у интактных самок, можно констатировать, что экспериментальный сахарный диабет 1 типа матери обусловливает снижение половой активности и показателей фертильности потомства. Оценка антистрессорной резистентности яичек экспериментальных животных Согласно данным литературы, сперматогенез является чрезвычайно чувствительным к действию стрессового фактора. В частности известно, что иммобилизационный стресс приводит к значительным нарушениям морфологии семенников и, как следствие, к нарушению сперматогенеза, что реализуется через изменение нейрогуморальных механизмов регуляции мужской репродуктивной функции. С целью определения антистрессорной резистентности семенников экспериментальных животных в возрасте 70 суток подвергали иммобилизационному стрессу. При этом было установлено, что стресс у потомства самок крыс с экспериментальным сахарным диабетом в большей степени, чем в контроле, обусловливает нарушение генеративной и эндокринной функций семенников у экспериментальных животных. Так, под действием стрессового фактора в группе «опыт- стресс» происходит более выраженное (на 36,0 %) уменьшение суммарного содержания сперматогенных клеток, чем в контроле (на 14,2 %) (рисунок 10) и их субпопуляций. Концентрация эпидидимальных сперматозоидов, их двигательная активность и жизнеспособность, в группе «опыт-стресс» показали более выраженное снижение, чем в группе «контроль-стресс». Так, у потомства самок крыс со стрептозотоцининдуцированным сахарным диабетом иммобилизационный стресс привёл к тому, что количество сперматозоидов снизилось на 24,9 %, а в группе контроля – на 15,5 %. При этом, фертильные формы сперматозоидов обнаруживались в небольшом количестве максимум на 30-й минуте наблюдения, в то время как в группе «контроль-стресс» все сперматозоиды оказались нефертильными только на 60-й минуте. АБ Рисунок 10. Яичко крысёнка в возрасте 70 суток группы «контроль-стресс» (А) и «опыт-стресс» (Б). В группе «опыт-стресс» более выраженное снижение количества сперматогенных клеток, чем в группе «контроль-стресс». Окраска: гематоксилин и эозин. Микрофото. Ув. × 100 (об. ×10; ок. ×10) Кроме того, иммобилизационный стресс у подопытных животных обусловливает более выраженное, чем в контроле, снижение суммарного содержания эндокриноцитов. Анализ относительного содержания различных морфофункциональных типов клеток Лейдига позволил выявить следующую закономерность. У животных группы «опыт-стресс» относительное содержание активных эндокриноцитов снизилось на целых 60,8%, а неактивных – повысилось почти в 3 раза. В то время как у животных группы «контроль- стресс» процентное содержание активных клеток Лейдига снизилось всего на 3,8%, а неактивных – повысилось всего на 7 %. Полученные результаты позволяют констатировать, что семенники подопытных животных обладают значительно меньшей стрессрезистентностью, чем в контрольной группе. Заключение Таким образом, в результате комплексного исследования установлено, что сахарный диабет матери в условиях эксперимента оказывает негативное влияние на антенатальное развитие потомства, что приводит к рождению физиологически незрелых крысят. Кроме того, на всех сроках исследования у подопытных животных имеет место нарушение генеративного компартмента яичек: изменения параметров, отражающих соотношение паренхимы и стромы семенника, снижение толщины сперматогенного эпителия, уменьшение суммарного числа сперматогенных клеток и изменение их субпопуляционного состава, в результате чего возникает снижение концентрации сперматозоидов в эпидидимальной взвеси, а также их подвижности, жизнеспособности, кислотной и осмотической резистентности, а так же повышенный уровень фрагментации ДНК. Вместе с тем нами выявлены изменения морфофункционального становления эндокринного компартмента мужских половых желез, в том числе снижение суммарного числа интерстициальных эндокриноцитов и изменение соотношения их морфофункциональных типов, что привело к снижению уровня концентрации тестостерона крови и, как следствие, уменьшению уровня половой активности и фертильности. Таким образом, анализ полученных результатов в целом позволяет сделать заключение о том, что экспериментальный сахарный диабет является фактором риска рождения физиологически незрелого потомства с нарушенным «стартом здоровья», в том числе репродуктивного, что проявляется в нарушении морфофункционального становления генеративного и эндокринного компартментов семенников и, в конечном итоге, приводит к нарушению фертильности. Выводы 1.Экстрагенитальная патология матери в виде экспериментального сахарного диабета 1 типа приводит к нарушению морфофункционального становления мужских половых желёз потомства. 2. Экспериментальный сахарный диабет первого типа матери приводит к рождению физиологически незрелого потомства, что находит свое проявление в изменении численности помета, весовых параметров новорожденных крысят, увеличении числа мертворожденных и задержке времени исчезновения признаков имматурантности. 3. Сахарный диабет 1 типа матери в условиях эксперимента обусловливает неспецифические морфологические изменения со стороны генеративного компартмента мужской половой железы потомства, что проявляется в изменении весовых параметров яичек, диаметра извитых семенных канальцев, толщины сперматогенного эпителия, численности сперматогенных клеток и их субпопуляционного состава, а также ряда функциональных индексов, отражающих активность сперматогенеза (индекса сперматогенеза, герминативного индекса, клеточного индекса Сертоли и индекса зрелости сперматогенеза). 4. Экспериментальный сахарный диабет 1 типа матери обусловливает у потомства нарушение фертильности, о чём свидетельствует уменьшение концентрации эпидидимальных сперматозоидов, снижение их кислотной и осмотической резистентности, снижение их фертильной фракции за счёт увеличения нефертильной, а так же более высокий уровень концентрации патологических форм мужских гамет, в том числе клеток с ДНК- фрагментацией, подавление половой активности и, как следствие, нарушение наступления беременности у интактных самок. 5. Сахарный диабет матери в условиях эксперимента сопровождается неспецифическими изменениями в морфофункциональной организации интерстициального отдела яичек потомства, что проявляется в увеличении соединительнотканного компонента, изменении суммарного содержания эндокриноцитов и их субпопуляционного состава, индекса активности клеток Лейдига, а так же снижении уровня концентрации тестостерона в крови. 6. Мужские половые железы половозрелого потомства самок крыс с экспериментальным сахарным диабетом первого типа обладают сниженной стрессрезистентностью со стороны структур генеративного и эндокринного компартментов, о чем свидетельствуют более выраженные, чем в контроле, изменения суммарного содержания сперматогенных клеток, эпидидимальных сперматозоидов и их субпопуляционного состава, угнетение их двигательной активности, нарушение соотношения активных и неактивных клеток Лейдига.