![](https://expert-mik.ru/wp-content/themes/24author/assets/img/work/work-img.png)
Развитие физико-химических подходов для рационального дизайна новых производных нуклеиновых кислот
ВВЕДЕНИЕ ………………………………………………………………………………………………………. 5
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ………………………………………………………………………. 17
1.1. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ И ИХ ПРОИЗВОДНЫЕ ………………………………… 17
1.1.1. Нуклеиновые кислоты ……………………………………………………………. 17
1.1.2. Производные нуклеиновых кислот …………………………………………. 18
1.1.3. Термодинамические свойства НК и их производных……………….. 23
1.2. МОЛЕКУЛЯРНО-ДИНАМИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ БИОМОЛЕКУЛЯРНЫХ
СИСТЕМ ………………………………………………………………………………………………….. 28
1.2.1. Силовые поля в методе молекулярной динамики …………………….. 29
1.2.2. Изучение гибридизационных свойств биополимеров при помощи
метода молекулярной динамики ……………………………………………………………….. 31
1.3. РАСЧЕТ КОНЦЕНТРАЦИИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ …………………………………. 34
1.4. МЕТОД ТЕРМИЧЕСКОЙ ДЕНАТУРАЦИИ С ОПТИЧЕСКОЙ РЕГИСТРАЦИЕЙ
СИГНАЛА ………………………………………………………………………………………………….. 37
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ………………………………………………………………. 41
2.1. МАТЕРИАЛЫ ……………………………………………………………………………….. 41
2.1.1. Олигонуклеотиды …………………………………………………………………… 41
2.2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ……………………………………………………. 42
2.2.1. Определение концентрации ……………………………………………………. 42
2.2.2. Метод термической денатурации с оптической регистрацией
сигнала ………………………………………………………………………………………………. 42
2.2.3. Спектроскопия кругового дихроизма ………………………………………. 43
2.2.4. Метод остановленной струи …………………………………………………………….. 43
2.3. КОМПЬЮТЕРНЫЕ РАСЧЕТЫ ……………………………………………………………. 44
2.3.1. Библиотеки для глицин-морфолиновых пентааденилатов ……….. 44
2.3.2. Создание МД библиотек для фосфорилгуанидиновых
олигонуклеотидов …………………………………………………………………………………….. 44
2.3.3. Подготовка структур для МД моделирования ………………………….. 45
2.3.4. Процедура МД моделирования ……………………………………………….. 45
2.3.5. Анализ МД траекторий …………………………………………………………… 47
2.3.6. База данных ДНК/РНК и РНК/РНК дуплексов ………………………… 48
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ………………………………………………………. 49
3.1. ПОДХОД ДЛЯ РАСЧЕТА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КОРОТКИХ ПРОИЗВОДНЫХ
НК……………………………………………………………………………………………………………….. 49
3.2. СТРУКТУРА И ТЕРМОДИНАМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КОМПЛЕКСОВ ГЛИЦИН-
МОРФОЛИНОВЫХ ПЕНТААДЕНИЛАТОВ С ДНК И РНК …………………………………………. 57
3.2.1. Характеризация вторичной структуры комплексов методом
спектроскопии кругового дихроизма ………………………………………………………… 57
3.2.2. Влияние буферных условий на гибридизационные свойства глицин-
морфолиновых олигомеров ………………………………………………………………………. 59
3.2.3. Анализ термодинамических параметров комплексообразования и
кооперативного контакта глицин-морфолиновых олигомеров ……………………. 64
3.2.4. Компьютерное изучение физико-химических свойств модельных
комплексов глицин-морфолиновых пентааденилатов ……………………………….. 71
3.2.4.1. Структурные особенности тандемных комплексов глицин-
морфолиновых пентааденилатов с ДНК и РНК ……………………………………… 71
3.2.4.2. Сольватационные особенности тандемных комплексов глицин-
морфолиновых пентааденилатов с ДНК и РНК ……………………………………… 78
3.2.5. Изучение физико-химических свойств комплексов гетеронуклеотидных
глицин-морфолиновых олигомеров с ДНК и РНК ……………………………………… 79
3.3. ИЗУЧЕНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ФОСФОРИЛГУАНИДИНОВЫХ
ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ С ДНК …………………………………………………………………………… 83
3.3.1. Модельные системы ФГО………………………………………………………………… 83
3.3.2. Определение влияния ФГ групп на спектры поглощения в УФ …………. 86
3.3.3. Изучение модельной системы окта-, дека- и додекамерных дуплексов 89
3.3.3.1. Исследование структуры ФГО и их комплексов методом кругового
дихроизма …………………………………………………………………………………………….. 89
3.3.3.2. Исследование гибридизационных свойств ФГО на примере
модельных окта-, дека- и додекамерных дуплексов ……………………………….. 92
3.3.3.3. Исследование гибридизационных свойств ФГО с РНК ………………. 98
3.3.4. Исследование кинетики формирования ФГО/ДНК дуплексов…………. 100
3.3.5. Исследование ФГО и их дуплексов методами компьютерного
моделирования ……………………………………………………………………………………….. 103
3.3.6. Влияние сорастворителей на термостабильно ФГО дуплексов с ДНК 109
3.3.7. Исследование гибридизационных свойств набора ФГО дуплексов …. 115
3.3.7.1. Анализ полученных результатов термодинамических параметров
комплексообразования ………………………………………………………………………… 116
3.3.7.2. Предсказательные модели для расчетов термодинамических
параметров комплексообразования ФГО/ДНК дуплексов …………………….. 118
3.4. РАСЧЕТ ГИБРИДИЗАЦИОННЫХ ПАРАМЕТРОВ НА ОСНОВЕ МД МОДЕЛИРОВАНИЯ 123
3.4.1. МД моделирование ДНК/РНК и РНК/РНК комплексов…………………… 123
3.4.1.1. Энергия формирования РНК/РНК комплексов …………………………. 125
3.4.1.2. Энергия формирования ДНК/РНК комплексов …………………………. 130
3.4.2. Расчёт энергий формирования для комплексов с ФГО при помощи
компьютерного моделирования ………………………………………………………………. 136
3.4.3. Расчёт энергий формирования комплексов глицин-морфолиновых
пентааденилатов с ДНК и РНК при помощи компьютерного моделирования
………………………………………………………………………………………………………………. 138
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ ………………………………………………………………………………. 143
5. РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ ……………………………………………………………… 145
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ …………………………………………………………………………….. 147
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ………………………………………………………………………………. 148
Во введении описана актуальность и разработанность темы,
сформулированы цели и задачи исследования, описаны научная но-
визна, практическая и теоретическая значимость работы, методы
исследования, формулируются положения, выносимые на защиту,
степень достоверности результатов исследования, личный вклад
автора и сведения об апробации результатов.
Первая глава посвящена обзору литературы. В разделе 1.1.1
описаны нуклеиновые кислоты (НК) как объект исследования, вве-
дены понятия структурных особенностей НК. В разделе 1.1.2 об-
суждаются производные и аналоги НК, их биологические и физико-
химические свойства, а также области применения. Кроме того, об-
суждаются объекты исследования – глицин-морфолиновые аналоги
(являющиеся морфолиновыми карбоксамидными миметиками) НК
и фосфорилгуанидиновые олигонуклеотиды, несущие N, N’-
замещенные остатки гуанидина. В разделе 1.1.3 кратко описаны
термодинамические свойства дуплексов НК и их производных и
более подробно модели расчета термодинамических параметров
комплексообразования, в частности – модель ближайших соседей.
Вторая часть обзора литературы посвящена моделированию био-
молекулярных систем методами молекулярной динамики. В разделе
1.2.1. описаны поля сил для моделирования биомолекул. В разделе
1.2.2 рассмотрены подходы для расчѐта гибридизационных свойств
биополимеров при помощи методов МД. Основной упор делается
на рассмотренных в данной работе методах MMPBSA и MMGBSA.
В разделе 1.3 описаны подходы к определению концентрации оли-
гонуклеотидов. Раздел 1.4 посвящен основному экспериментально-
му методу, используемому в данной работе – методу термической
денатурации с оптической регистрацией сигнала. Он позволяет
определять термодинамические параметры комплексообразования
путем подгонки теоретической кривой изменения оптической плот-
ности при изменении температуры к экспериментальной кривой.
Вторая глава посвящена описанию используемых материалов,
экспериментальных методов и методов компьютерного моделиро-
вания и анализа. В разделе 2.1 представлены использованные в ра-
боте олигонуклеотиды. В разделе 2.2 описаны методики измерения
концентрации олигомеров, определения термодинамических и ки-
нетических параметров комплексообразования при помощи мето-
дов термической денатурации и остановленной струи с оптической
регистрацией сигнала, изучения вторичной структуры НК методом
спектроскопии кругового дихроизма. В разделе 2.3 обсуждаются
методы компьютерного моделирования НК, их производных и их
комплексов. Подробно описана методика создание МД библиотек
мономеров глицин-морфолиновых пентааденилатов и ФГО, проце-
дуры МД моделирования и анализа полученных траекторий. Опи-
сана база данных термодинамических параметров (энтальпия и эн-
тропия комплексообразования) для ДНК/РНК и РНК/РНК дуплек-
сов, взятая из литературных источников.
Третья глава посвящена
описанию и обсуждению полу-
ченных результатов. В разделе
3.1 описан разработанный под-
ход для определения физико-
химических свойств коротких
производных НК. Он рассматри-
вает тандемные комплексы, об-
ладающие большей термической Рисунок 1. Схематичное изображение ис-
стабильностью по сравнению с следованной системы.
комплексами коротких олигонуклеотидов. В данной схеме для
определения величин термодинамических параметров одновремен-
но анализируют несколько кривых термической денатурации ком-
плексов различной длины (Рисунок 1). За счет различного вклада от
связывания цепей и вклада кооперативного контакта на стыке дуп-
лексных структур в константу равновесия формирования комплек-
сов разной молекулярности удается разделить и достоверно опреде-
лить два этих вклада. В предложенном нами подходе использована
упрощенная модель, предполагающая одновременное взаимодей-
ствие n коротких олигонуклеотидов А с протяженной матрицей В
без промежуточных и дополнительных состояний, то есть исполь-
зование приближения “все-или-ничего”:
(1).
Взаимодействие n олигонуклеотидов А с цепью В можно описать
эффективной константой равновесия, которая характеризуется
энергией связывания n олигомеров и формирования n-1 коопера-
тивного контакта на стыке дуплексных структур (Рисунок 1):
(2)
(3)
(4),
где Ki – это константа равновесия: эффективная (i=”eff”), связыва-
ния (i=”b“) или кооперативного взаимодействия (i=”c”); ΔG°i(T) и
ΔH°i, ΔS°i – изменение свободной энергия Гиббса, энтальпии и эн-
тропии при формировании соответствующего структурного элемен-
та тандемного комплекса. Таким образом, эффективные термоди-
намические параметры есть комбинация вкладов от формирования
двойной спирали и взаимодействия на стыке дуплексных структур.
При соблюдении равенства концентраций олигонуклеотидов А и В,
приведенных на один нуклеотид ([A]0=n·[B]0), нахождение концен-
трации свободного олигомера А сводится к решению алгебраиче-
ского уравнения степени n+1 на концентрацию олигонуклеотида А
в свободном состоянии ([A]):
[ ][ ] [ ](5).
Используя одновременную подгонку нескольких кривых тер-
мической денатурации, полученных для комплексов с разным чис-
лом коротких олигонуклеотидов (n), можно определить отдельные
энергетические вклады (связывание и кооперативный контакт) в
эффективную константу равновесия.
Применимость разработанной схемы получения термодина-
мических параметров комплексообразования была проверена на
примере комплекса нативного короткого олигонуклеотида (dA5) с
различными протяженными ДНК и РНК-матрицами ((dT5)n и (U5)n
где n = 3, 4, 5).
Раздел 3.2 посвящен исследованию структуры и термодина-
мических свойств тандемных комплексов глицин-морфолиновых
(gM) пентааденилатов (gMA5) (Рисунок 2) с ДНК и РНК цепями
длинной 15, 20, 25 нт (n=3, 4, 5) и полимерными цепями. В качестве
референсных последовательностей к gM олигомерам были выбраны
пентааденилаты ДНК (dA5).
Первый подраздел содержит информацию о вторичной струк-
туре тандемных комплексов пентааде-
нилатов, охарактеризованной методом
спектроскопии кругового дихроизма в 1 M
NaCl в нейтральных значениях pH (10 мМ
какодилат натрия, pH 7.2). Изучен пре-
дельный случай – комплексы полимерных
цепей ДНК (poly(dT)) или РНК (poly(U)) с
короткими олигомерами. В этом случае
краевые эффекты в коротких олигомерах
не будут вносить определяющего вклада.
Было показано, что во всех случаях фор-
мируются комплексы с НК. Это видно по
совпадению спектров кругового дихроиз-
ма (КД) смеси и суммы спектров при вы- Рисунок 2. Структура пентааде-
сокой температуре и значимому различию нилата глицин-морфолинового
производного (gMA5)при
при низкой. При 20 °С форма КД- нейтральном значении pH.
Рисунок 3. Спектры кругового дихроизма для смеси (толстые линии) и суммы спектров
(тонкие линии) отдельных компонентов при высокой (красным) и низкой (синим) темпера-
туре для (gMA5)/poly(U) и dA5/poly(U), dA5/poly(dT) и (gMA5)/poly(dT).
спектров комплекса (dA5)/poly(dT) близка к спектру B-формы двой-
ной спирали; КД спектры (dA5)/poly(U) и (gMA5)/poly(U), типичные
для А-формы двойной спирали, а нетипичный вид спектра
(gMA5)/poly(dT) не позволяет сделать вывод о его вторичной струк-
туре (Рисунок 3). Для всех исследованных модельных систем
наблюдаются точки изоэллиптичности, что косвенно служит свиде-
тельством применимости модели двух состояний к описанию про-
цесса денатурации таких комплексов.
Во втором подразделе рассмотрено влияние буферных
условий на гибридизационные свойства тандемных комплексов
gMA5 с комплементарной ДНК. Для изучения влияния ионной силы
раствора и значения рН на эффективность комплексообразования
проведены эксперименты по исследованию термической денатура-
ции для нативных и модифицированных комплексов при различных
ионных силах раствора (10 мM, 100 мM, 1 M NaCl) и при различных
значениях pH (5.5, 7.2, 8.0) буфера.
Уменьшение ионной силы раствора при исследованных зна-
чениях pH приводит к существенному снижению термостабильно-
сти нативной системы. Совершенно другое поведение наблюдали
для модифицированного комплекса (gMA5)5/(dT25). При нейтраль-
ном значении рН (7.2) происходит незначительное увеличение тем-
пературы плавления комплекса (на ~3.5 градуса) при снижении
Рисунок 4. Экспериментальные (цветные толстые линии) и расчетные (тонкие черные ли-
нии, одновременная подгонка кривых при n = 3, 4 и 5) кривые термической денатурации для
разного количества (n =3, 4, 5 и (poly(U/dT))) тандемных олигонуклеотидов gMA5 (A) и dA5.
концентрации Na+ с 1М до 10mM. Несколько меньшая стабилизация
(на ~1.5 градуса) наблюдается при рН 8.0. Однако при понижении
pH до значения 5.5 наблюдается значимая термостабилизация ком-
плекса (на ~6.5 градусов) при низких концентрациях Na+. В сово-
купности, определенные термодинамические параметры комплек-
сообразования, величина гипохромного эффекта и литературные
данные о зарядовом состоянии вторичных и третичных аминов сви-
детельствуют о том, что при pH 7.2 и 8.0 в глицин-морфолиновом
олигомере положительно-заряжены только концевые аминогруппы
(Рисунок 2), а при pH 5.5 дополнительно протонируются амины
морфолиновых колец.
В третьем подразделе проведен анализ термодинамических
параметров комплексообразования и кооперативного контакта при
формировании тандемных комплексов. Использовано три подхода
для определения термодинамических параметров. Первый – это од-
новременная подгонка трех кривых термической денатурации
(n = 3, 4 и 5) для определения энтальпии и энтропии связывания
(ΔH°b, ΔS°b) и кооперативного контакта (ΔH°c, ΔS°c) на стыке дуп-
лексных структур (Рисунок 4). Второй – обработка одиночных кри-
вых и получение эффективных термодинамических параметров
(ΔH°eff, ΔS°eff и ΔG°eff). Третий – это использование концентрацион-
ной зависимости температуры плавления комплексов для определе-
ния эффективных термодинамических параметров.
Все три способа показали близкие значения эффективных
термодинамических параметров комплексообразования, а термоди-
намические параметры связывания и кооперативного контакта, по-
лученные подгонкой для комплексов с n=3, 4 и 5, позволили опи-
сать и кривые термической денатурации с полимерными матрицами
ДНК и РНК.
Было показано, что термическая стабильность тандемных
комплексов (dA5)n/(dT5*n) оказывается незначительно выше, чем для
(gMA5)n/(rU5*n), тогда как (dA5)n/(rU5*n) обладает наименьшей темпе-
ратурой плавления (где n = 3, 4, 5) при 1M NaCl при физиологиче-
ском значении pH (Таблица 1).
Четвертыйподразделпосвященмолекулярно-
динамическому моделирования тандемных комплексов нативных и
глицин-морфолиновых пентааденилатов с 20-звенными РНК и
ДНК. Был решен вопрос о конформации мономерных звеньев мо-
дифицированных олигомеров.
Таблица 1. Термодинамические параметры связывания и кооперативного взаимодействия,
полученных одновременной подгонкой кривых термической денатурации (n=3, 4, 5) при pH
равном 7.2, 1M NaCl, 10 мM какодилате Na. В таблице приведены значения, усредненные по
всем концентрациям ([d(gM)A5] = 4×10-6, 1×10-5, 2×10-5 и 4×10-5 M).
РНКДНК
dA5gMA5dA5gMA5
ΔH°b, ккал/моль-39.5-45.3−43.9−30.2
ΔS°b, кал/моль/К-134-168−156−104
ΔG°b, ккал/моль2.26.94.61.9
ΔH°c, ккал/моль-10.8-19.1−16.2−11.2
ΔS°c,кал/моль/К0.00.00.00.0
ΔH°eff, ккал/мольb-47.6-59.7-60.4-40.0
ΔS°eff, кал/моль/Кb-134.5-168.5-170-108
ΔG°eff, ккал/мольb
-5.9-7.4-7.6-6.5
Tпл, °Cb,c26.836.537.329.0
b
Эффективные термодинамические параметры рассчитаны для n = 4.
c
Tпл рассчитаны для концентрации пентануклеотида 10 мкM.
ДНКРНК
Рисунок 5. Наиболее представленные структуры в МД траекториях.
Так было установлено, что положение гетероциклического
основания относительно плоскости кольца остова сохраняется в мо-
дифицированном мономере таким же, как и для нативного аденози-
на в -положении [1], энергетически более выгодной конформацией
морфолинового кольца является конформация “кресло”, а относи-
тельно положения С-N связи для азота морфолинового кольца су-
ществует два конформера: gMA1 – экваториальное, gMA2 – акси-
альное расположение связи.
МД моделирование показало, что форма ДНК/РНК тандемно-
го комплекса близка к А-форме двойной спирали. В случае тандем-
ного ДНК/ДНК комплекса наблюдается структура, являющейся
промежуточной между B-формой и oligo(А) трактом ДНК. В сред-
нем, тандемные комплексы gM олигомеров являются более по-
движными, чем нативные аналоги.
Структура модифицированных комплексов отличаются не-
значительно от нативных для внутренних пар оснований, а в случае
концевых и расположенных на стыке дуплексных структур откло-
нения более значимы (Рисунок 5). Геометрия нативных ДНК или
РНК цепей практически идентична у разных типов комплексов. В
то же самое время наличие дополнительной связи в остове gM от-
носительно нативных НК приводит к возникновению напряжений
остова и нарушениям регулярной структуры. Это сильнее проявля-
ется в комплексах с ДНК, чем с РНК, что связано с большей кон-
турной длиной остова последних. Таким образом, можно ожидать,
что химическое строение остова не позволит полностью модифици-
рованным gM олигомерам формировать дуплексы с протяженными
комплементарными цепями НК.
Пятый подраздел посвящен изучению физико-химических
свойств комплексов гетеронуклеотидных последовательностей гли-
цин-морфолиновых олигомеров с ДНК и РНК. На первом этапе
изучена термостабильность тандемного комплекса олигомера
gM(AAACA) с 20-звенной ДНК. Температура плавления такого
тандемного комплекса при нейтральном значении pH 7.2 в 1М NaCl
была на 13 °С ниже температуры плавления комплекса
(gMA5)4/(dT20). Семизвенный олигомер в дуплексе с ДНК
gM(ССAAACA)/d(GCGTTTGG), РНК gM(CСААAСА)/r(UGUUUGG)
итандемныйкомплекссолигонуклеотидом
gM(CСААAСА)2/r(UGUUUGGUGUUUGG) обладают термостабиль-
ностью значительно более низкой, чем нативные аналоги.
При помощи методов термической денатурации и спектро-
скопии кругового дихроизма было показано, что десятизвенный
глицин-морфолиновый олигомер gM(CAGCGGCGTG) не образует
ни параллельных, ни антипараллельных комплексов с комплемен-
тарными ДНК и РНК.
Было установлено, что замена какодилатного буфера на фос-
фатный приводит к выпадению в осадок глицин-морфолинового
олигомера, как и высокая концентрация их комплексов с НК (~10-3
М). Таким образом, дальнейшее исследование данных глицин-
морфолиновых олигомеров представляется затруднительным в при-
ложениях, предполагающих комплементарные взаимодействия мо-
дифицированных олигомеров с НК.
В разделе 3.3 диссертации представлены результаты исследо-
вания физико-химических свойств дуплексов фосфорилгуанидино-
вых олигонуклеотидов (ФГО) с ДНК. ФГО – незаряженные произ-
водные нуклеиновых кислот, где один из немостиковых атомов
кислорода в остатке фосфорной кислоты нуклеотида замещен на
гуанидиновоепроизводное,вданнойработе-1,3-
диметилимидазолидин-2-имин. В подразделе 3.3.1. ставится задача,
описан набор выбранных для исследования модельных олигомеров
размером 8, 10 и 12 нт. Нативные олигомеры способны сформиро-
вать 21 полностью комплементарных ДНК/ДНК дуплекса. Полно-
стью ФГ-модифицированные ДНК цепи образуют 21 ФГО/ДНК и
21 ДНК/ФГО частично модифицированных дуплекса, либо полно-
стью модифицированные ФГО/ФГО комплексы.
Во втором подразделе исследовано влияние ФГ групп (обо-
значено символами PG в кодировке) на спектры поглощения в уль-
Рисунок 6. (A)Спектры КД додекамерных комплексов различных типов (ДНК/ДНК,
ФГО/ДНК, ДНК/ФГО и ФГО/ФГО) при низкой (5 °C) и высокой (90 °C) температурах. Кон-
центрация олигонуклеотидов 10 мкМ, буфер – 1 М NaCl, 10 мМ какодилат натрия pH 7.2.
(B) Сравнение зависимостей температуры плавления от буферных условий для додекамер-
ных комплексов различных типов (ДНК/ДНК: зеленый, ФГО/ДНК: темно-синий,
ДНК/ФГО: голубой и ФГО/ФГО: красный).
трафиолетовой области спектра. Показано, что спектры нативных и
полностью модифицированных олигонуклеотидов практически
совпадают в области от 250 до 330 нм при высоких температурах, а
в более коротковолновой области наблюдаются отличия из-за по-
глощения ФГ групп. Установлено, что для наиболее достоверного
определения концентрации ФГО необходимо использовать оптиче-
ское поглощение олигомеров при 90 °С на длине волны 260 нм и
коэффициенты экстинкции, рассчитанные в приближении суммы
независимых вкладов мономерных звеньев для ДНК при высокой
температуре.
Подраздел 3.3.3 посвящен исследованию структуры и гибри-
дизационных свойств модельных комплексов окта- (M8/N8), дека-
(M10/N10) и додекануклеотидов (M12/N12) с одной или обеими
полностью модифицированными ФГ-цепями. Исследование мето-
дом спектроскопии кругового дихроизма при низких температурах
показало большую разупорядоченность ФГО цепей по сравнению с
ДНК. Сопоставление спектров смеси олигонуклеотидов (Рисунок 6)
показывает, что вторичные структуры всех типов комплексов
(ДНК/ДНК, ФГО/ДНК, ДНК/ФГО и ФГО/ФГО) близки между со-
бой для каждого из дуплексов окта-, дека- и додекамеров. Они ти-
пичны для В-формы двойной спирали ДНК [2]. Кроме того, было
показано наличие точек изоэллиптичности для всех комплексов, что
свидетельствует о формировании комплексов в приближении моде-
ли двух состояний («все-или-ничего»), предполагающей наличие
только дуплекса и одноцепочечного состояния олигонуклеотидов.
Изучены гибридизационные свойства ФГО в модельных ок-
та- , дека- и додекамерных дуплексах методом термической денату-
рации в различных буферных условиях (деионизованная вода, 10,
100 и 1000 мМ NaCl, а так же 100 мМ NaCl с 5 мМ MgCl2) (Рису-
нок 6). По совокупности набора критериев показано, что процесс
образования ДНК/ДНК и ФГО/ДНК дуплексов может быть описан в
приближении модели двух состояний. Термостабильность ФГО
дуплексов с ДНК слабо зависит от ионной силы раствора, незначи-
тельно увеличиваясь при уменьшении ионной силы раствора и со-
поставима с термической стабильностью немодифицированных
ДНК/ДНК дуплексов при 100 мМ NaCl. Термическая стабильность
ФГО/ФГО комплексов существенно снижена относительно частич-
но модифицированных ФГО/ДНК дуплексов. Наблюдаемое сниже-
ние термической стабильности модифицированных комплексов при
высокой ионной силе раствора может быть связано с изменением
активности воды (см. ниже).
В подразделе 3.3.4 методом остановленной струи исследовано
влияние полной модификации одной из цепей на кинетику форми-
рования дека- и додекамерных дуплексов. Константы скорости ас-
социации нативных и модифицированных олигомеров находятся в
диапазоне от 105 до 107 М-1 c-1 во всех исследованных случаях, уве-
личиваясь с ростом температуры. Температурные зависимости кон-
стант скоростей диссоциации ФГО и ДНК дуплексов в Аррениусов-
ских координатах линейны и параллельны друг другу. Установлено,
что дестабилизация ФГ-содержащих дуплексов происходит в ре-
зультате значимого увеличения константы скорости диссоциации
дуплекса, в то время, как константы скорости ассоциации отлича-
ются не более чем на порядок.
Пятый подраздел посвящен поиску причин наблюдаемых
структурных и термодинамических эффектов от введения ФГ мо-
дификаций при помощи методов молекулярного моделирования и
анализа. Проведено моделирование методом МД в явной водной
оболочке в течении 100 нс как для дуплексов, так и для одноцепо-
чечных олигомеров. Исследованы модельные окта, дека- и додека-
меры, изученные экспериментально. Структурные характеристики
двойной спирали для нативных и модифицированных комплексов
были типичны для В-формы ДНК и практически не различались
между собой, что совпадает с данными, полученными методом КД-
спектроскопии.
При сравнении молекулярных моделей с небольшим числом
ионов в моделируемой ячейке (нейтрализованы заряды остатков
фосфорной кислоты ионами натрия) и случаем с высокой ионной
силой раствора (~1 M NaCl) анализ взаимодействия комплексов с
ионами и водным окружением не выявил значимых различий как
для нативных, так и для модифицированных дуплексов. Установле-
но, что введение ФГ модификаций приводит к снижению структу-
рированности водного окружения и к уменьшению числа водород-
ных связей между модифицированными олигомерами и их дуплек-
сами с водой. В то же время, изменение числа водородных связей
при образовании дуплексов близко как для нативных, так и для мо-
дифицированных олигонуклеотидов. Это свидетельствует о том,
что влияние активности воды на гибридизационные свойства как
нативных, так и модифицированных дуплексов должно быть очень
похоже.
В подразделе 3.3.6 исследовано влияние сорастворителей на
термостабильности ФГО/ДНК дуплексов (Рисунок 7). В качестве
агентов, снижающих активность воды, выбраны этанол, этиленгли-
коль (EG) и два полиэтиленгликоля со средним молекулярным ве-
сом 200 и 1000 (PEG200 и PEG1000). Для исследований выбраны
модельные двенадцатизвенные дуплексы, так как они обладают до-
статочновысокойтермостабильностью.МетодомКД-
спектроскопии показано, что нали-
чие сорастворителей не приводит к
изменениям формы двойной спира-
ли при добавлении сорастворителей
до 20 %. Увеличение доли этанола
до 50 % приводит к линейному
снижению температуры плавления
всех исследованных комплексов.
Кроме того, уменьшение активно-
сти воды (увеличение массовой до-
ли сорастворителя) приводило к
Рисунок 7. Количество молекул воды,
линейному увеличению обратной присоединившихся в процессе образова-
температуры плавления. Это позво- ния нативного и модифицированных дуп-
лило определить количество моле- лексов,в присутствии различных сорас-
творителей (этанол, EG, PEG200 и
кул воды, дополнительно связав- PEG1000).
шихся с НК в процессе образования дуплекса (Рисунок 7), в соот-
ветствии с моделью Спинка и Чайреса [3]. Таким образом, было по-
казано, что термодинамические эффекты при образовании ФГО-
дуплексов в присутствии сорастворителей оказываются близки
между собой. Это коррелирует с данными, полученными при МД
анализе.
Подраздел 3.3.7 посвящен разработке подходов прогностиче-
ского расчета гибридизационных параметров для ФГО/ДНК дуп-
лексов на основании экспериментальных данных. В пункте 3.3.7.1.
обсуждаются закономерности термодинамических параметров ком-
плексообразования исследованного методом термической денату-
рации набора дуплексов при концентрации ионов Na+ в растворе 10,
110 и 1010 мМ. В случае ДНК/ДНК дуплексов снижение концен-
трации ионов Na+ приводит к значительному снижению их термо-
стабильности, для ФГО/ДНК дуплексов наблюдается незначитель-
ное повышение термической стабильности с уменьшение ионной
силы раствора (увеличением концентрации ионов Na+). Усреднен-
ные значения термодинамических параметров для всей выборки
ФГО/ДНК (84 комплекса) и ДНК/ДНК (42 комплекса) дуплексов
близки в буфере, содержащем 100 мМ NaCl, 10 мМ какодилат
натрия, pH 7.2.
В пункте 3.3.7.2. обсуждены модели прогностического расче-
та для ФГО/ДНК дуплексов. Полученные данные указывают на
возможность применение модели ближайших соседей (БС) для ФГ-
содержащих олигомеров. Предложено два подхода для построения
предсказательной модели термодинамических параметров форми-
рования дуплексов. Первый подход основан на определении инкре-
ментов модели БС для всех 16 ФГ-модифицированных динуклео-
тидных ФГО/ДНК пар. Второй рассматривает введение ФГ-
модификации в динуклеотидный шаг как дополнительной поправки
к параметрам модели БС для ДНК. Было показано, что наибольшим
дестабилизирующим эффектом обладает введение ФГ группы в шаг
5′-С*C-3’/5′-GG-3′ (ФГ-группа обозначена символом “*”), а
наименьшим – в 5′-G*C-3’/5′-GC-3′. Точность предложенных моде-
лей при различных ионных силах раствора сопоставима с точно-
стью модели БС для ДНК/ДНК дуплексов.
В разделе 3.4 изучена возможность расчета термодинамиче-
ских параметров комплексообразования с использованием МД мо-
делирования. В подразделе 3.4.1. показана принципиальная возмож-
ность расчета энтальпии и энтропии комплексообразования при по-
мощи методов обработки МД траекторий. Проведено МД модели-
рование (100 нс) для каждого дуплекса и отдельных олигомеров из
набора 65 ДНК/РНК [4] и 75 РНК/РНК [5] дуплексов, для которых
опубликованы экспериментально полученные величины термоди-
намических параметров комплексообразования. Полученные траек-
тории проанализированы методами MMPB(GB)SA и Q-harm/N-
mode для расчета энтальпии и энтропии связывания, соответствен-
но.
Использование метода ММGBSA дает наилучшую корреля-
цию экспериментальных и расчетных величин как для РНК/РНК,
так и для ДНК/РНК комплексов, причем использование однотра-
екторного подхода позволяет добиться величины ошибки ~10%, что
сопоставимо с точностью модели БС для таких видов дуплексов.
В подразделах 3.4.2. и 3.4.3. проведен анализ применимости
МД-подходов для расчета гибридизационных свойств глицин-
морфолиновых и фосфорилгуанидиновых олигомеров. Наблюдается
качественное согласие рассчитанных величин термодинамических
параметров с экспериментальными данными.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ
Детальноизученыфизико-химическиесвойстваглицин-
морфолиновых и фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов (ФГО)
и их комплексов, на основании чего созданы подходы для изучения
и прогностического расчета их свойств.
1. Разработан метод экспериментального определения достоверных
величин термодинамических параметров комплексообразования, а
также формирования отдельных структурных элементов тандемных
комплексов коротких низкостабильных комплексов НК и их произ-
водных.
2. Показано, что по данным КД-спектроскопии РНК в тандемных
комплексах с глицин-морфолиновыми пентааденилатами находится
в А-форме. Структуру с ДНК в аналогичных комплексах установить
не удалось. Определены гибридизационные свойства пентааденила-
тов глицин-морфолинов с ДНК и РНК. Комплексы глицин-
морфолиновых олигомеров с ДНК обладают сниженной, а с РНК –
повышенной термической стабильностью относительно аналогич-
ных немодифицированных тандемных ДНК/ДНК комплексов.
3. Изучены физико-химические свойства ФГО. Формирование ком-
плексов ФГО/ДНК и ФГО/ФГО может быть описано в рамках при-
ближения модели двух состояний. Термостабильность ФГО ком-
плексов незначительно увеличивается при уменьшении ионной си-
лы раствора и сопоставима с термической стабильностью немоди-
фицированных ДНК/ДНК дуплексов при 100 мМ NaCl. Термиче-
ская стабильность ФГО/ФГО комплексов существенно снижена от-
носительно ФГО/ДНК дуплексов. Изменение активности воды при-
водит к близким изменениям термостабильности ДНК/ФГО и ана-
логичным им ДНК/ДНК дуплексам. Установлено, что введение ФГ-
модификаций не изменяет форму двойной спирали, повышает по-
движность цепи, а изменение сольватации является наиболее веро-
ятной причиной изменения термостабильности комплексов.
4. На основании приближения ближайших соседей разработана мо-
дель прогностического расчета величин термодинамических пара-
метров формирования ФГО/ДНК дуплексов (ΔG°37, ΔH°, ΔS° и Тпл),
как для полностью, так и частично-модифицированных олигомеров
в различных солевых условиях (10 – 1010 мМ Na+). Прогностиче-
ская точность разработанного подхода при расчете свободной энер-
гии Гиббса составляет 0.3 ккал/моль, а температуры плавления –
1.4 °С.
5. Показана возможность достоверного расчета энтальпии комплек-
сообразования (ΔH°) для наборов РНК/ДНК (75 шт.) и РНК/РНК (65
шт.) дуплексов при анализе МД траекторий дуплексов методом
MMGBSA. Ошибка расчета сопоставима с величиной эксперимен-
тальной ошибки и составляет 8%. Оценку гибридизационных
свойств дуплексов ФГО с комплементарными ДНК и глицин-
морфолиновых пентааденилатов с ДНК и РНК можно проводить на
качественном уровне.
Актуальность проблемы
Короткие фрагменты нуклеиновых кислот (НК) – олигонуклеотиды, их
производные и аналоги, имеющие в своей структуре различные химические
модификации, широко используют в качестве молекулярных инструментов как в
различных областях фундаментальных исследований, так для решения широкого
спектра прикладных задач. В частности, их используют в качестве молекулярных
зондов для детального изучения работы ферментативных систем in vitro и in vivo,
изучения метаболических путей и т.д. Аналоги нуклеиновых кислот уже
используют в медицине в роли НК-направленных терапевтических средств [1], а
также зондов в молекулярной диагностике [2].
Для создания агентов, способных высокоэффективно работать в данных
областях необходимо, чтобы олигонуклеотиды обладали рядом свойств, одним из
главных среди которых является возможность формировать специфические
комплексы с комплементарными последовательностями ДНК и/или РНК, а также
селективно воздействовать на молекулярно-биологические процессы. Нативные
олигонуклеотиды зачастую не обладают совокупностью физико-химических,
молекулярно-биологических и биологических свойств, которые бы позволили их
успешно использовать. В связи с этим уже разработан и продолжают создаваться
широкий спектр аналогов и производных нуклеиновых кислот. Такие соединения
могут обладать модифицированными гетероциклическими основаниями, остатком
сахара, замещенным остатком фосфорной кислоты или измененным
сахарофосфатным остовом. Наибольшую популярность приобрели соединения,
обладающие модифицированным остовом: фосфотиоатные производные (PS) [3],
“замкнутые” нуклеиновые кислоты (LNA) [4], пептидные нуклеиновые кислоты
(PNA) [5] и фосфордиамидные морфолиновые олигонуклеотиды (РМО) [6]. Два
последних можно отнести к отдельному классу незаряженных аналогов, к
которым также можно отнести метилфосфонаты [7], фосфорамиды [8], и ряд
других, в которых замещен один из немостиковых атомов кислорода в остатке
фосфорной кислоты [9]. Такие соединения уже используют в системах
молекулярной диагностики, а также на их основе разработаны лекарственные
препараты, одобренные управлением по санитарному надзору за качеством
пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) [10,11].
Наиболее важным свойством таких аналогов являются способность
формировать специфичные стабильные комплексы с ДНК и/или РНК. Их физико-
химические свойства должны быть достаточно изучены, и они должны обладать
химической и биологической стабильностью. Важной положительной чертой
аналогов НК является удобство, простота и вариативность их химического
синтеза, что приводит к их умеренной стоимости, и как следствие, более
широкому использованию.
Например, введение PS-модификации достаточно просто и требует лишь
изменения одного из этапов эффективного твердофазного синтетического цикла –
окисления атома фосфора. Это позволяет получать PS-олигомеры на основе
практически любых амидофосфитных мономеров, в различных положениях
олигомерной цепи [10]. В случае LNA олигомеров используют модифицированные
мономеры, которые так же могут быть введены в любую позицию в рамках
стандартного протокола синтеза [11]. PNA и PMO аналоги значительно
проигрывают им, поскольку предполагают использование для их синтеза
специальных предшественников и методов синтеза [12]. Амидофосфатные
производные с замещенной фосфатной группой, обладают относительно простым
методом синтеза по сравнению с другими нейтральными аналогами. Однако
относительная простота получения не сделала их популярными из-за ряда причин.
В частности, подверженности кислотному гидролизу [13] и сниженной
стабильности их комплексов с РНК [14]. Обе эти проблемы – химическая
стабильность и высокая эффективность молекулярной гибридизации, критически
важны для их применения в качестве ген-направленных соединений при доставке
методом эндоцитоза и блокирования транскрипции или трансляции. Кроме того,
![](https://expert-mik.ru/wp-content/themes/24author/assets/img/signup-document.png)
Публикации автора в научных журналах
Помогаем с подготовкой сопроводительных документов
Хочешь уникальную работу?
Больше 3 000 экспертов уже готовы начать работу над твоим проектом!