Разработка подходов по подавлению экспрессии генов человека для терапии онкологических и наследственных заболеваний на примере меланомы кожи и миодистрофии Ландузи-Дежерина

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
В первой части обзора описаны современные представления об эндогенной
активации экспрессии генов человека и различных методах её достижения в порядке их открытия. Во второй части представлены различные методы эндогенной репрессии экспрессии генов человека, также в порядке их открытия. В последнем разделе второй части описаны открытие, развитие и ограничения такого метода управления экспрессией генов, как РНК-интерференция. В третьей части обзора дано заключение, суммирующее информацию, приведённую в предыдущих частях.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы исследования
Для решения поставленных задач работа проведена на двух видах биоматериала:
выделенной РНК и культивируемых клетках клеточных линий человека. Проанализированы образцы РНК четырёх меланомных клеточных линий человека (A375, G361, Sk-mel-1 и Sk-mel-5) и трёх линий миобластов человека (1190K, 1080FSHD и 186FSHD). Эксперименты in vivo проведены на одной меланомной (А375) и трёх линиях миобластов человека (1190K, 1080FSHD и 186FSHD). Линии миобластов человека получены из культур миобластов, извлечённых у здорового донора (1190K) и больных с подтверждённым диагнозом миодистрофии Ландузи-Дежерина (1080FSHD и 186FSHD). Работу с клеточными линиями меланомы кожи человека предварял
биоинформатический и литературный анализ 91 потенциально критически важного гена для выживания этого типа клеток. Работу с культурами миобластов предварял анализ морфологических и молекулярно-генетических характеристик этих клеток.
Методы исследования
Выделение РНК проведено из образцов линий эукариотических клеток с помощью гуанидин-тиоционатного метода с использованием химических реактивов, располагаемых лабораторией (степень чистоты ХЧ).
Электрофорез в агарозном геле проведён для оценки качества и количества выделенной РНК.
Реакция обратной транскрипции проведена с использованием системы ImProm- IITM Reverse Transcription System (Promega, США) в соответствии с инструкцией производителя.
Полимеразная цепная реакция в режиме «реального времени» (ПЦР-РВ)
проведена на программируемом термоциклере StepOnePlus (Applied Biosystems, США) с помощью разработанных в лаборатории и лично соискателем олигонуклеотидных праймеров и зондов.
Трансфекция эукариотических клеток проведена при помощи реагентов METAFECTENE® PRO (Biontex), Lipofectamine 3000 (Invitrogen) и методом кальций- фосфатной трансфекции в соответствии с рекомендациями производителей.
Тест по определению метаболической активности («выживаемости») клеток проведён с помощью красителя МТТ (Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide) (ООО НПП «ПанЭко», Россия) согласно рекомендациям производителя.
Тест для определения скорости миграции клеток (Wound-healing тест) проведён в соответствии с мировым опытом, почерпнутом в литературе, с использованием светового микроскопа и системы фотофиксации Axiocam (ZEISS, Германия), программного обеспечения ImageJ (FIJI) и программного обеспечении Exel (Microsoft).
Разработка олигонуклеотидов. Для поиска необходимых последовательностей РНК и ДНК, а также разработки олигонуклеотидов (праймеров, зондов и малых интерферирующих РНК (siРНК)) использованы следующие открытые базы данных: RefSeq (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/), Ensemble (http://www.ensembl.org/index.html), GENCODE (http://www.gencodegenes.org/). Нуклеотидные последовательности проанализированы с помощью пакета программ
BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Праймеры для ПЦР разработаны при помощи программы OLIGO 7 (DBA Oligo, Inc.). Малые интерферирующие РНК разработаны с помощью программы siRNAfit, созданной в лаборатории функциональной геномики МГНЦ (Кривошеева И., Вяхирева Ю. et al., 2021).
Предварительный анализ экспрессии генов в различных клеточных линиях и тканях осуществлён с помощью данных из геномного браузера FANTOM5_SSTAR (https://fantom.gsc.riken.jp/5)
Статистическая обработка данных осуществлена с использованием пакета программы Statistica 10.0 (StatSoft).
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Анализ основных генов для выживания клеток меланомы
С целью отбора наиболее перспективных генов для анализа их «необходимости» для выживания клеток меланомы кожи проведён биоинформатический анализ и анализ литературных данных. Из 91 гена, ранее идентифицированных in silico как критически важные опухолевые гены для выживания клеток меланомы кожи (Pyatnitskiy, Karpov et al., 2015), с помощь баз данных FANTOM5 SSTAR (Functional Annotation of the Mammalian Genome, Semantic catalog of Samples, Transcription initiation And Regulators), базы данных компании deCODE и литературных источников отобраны 8 наиболее перспективных генов. Эти 8 генов проанализированы на предмет их экспрессии на уровне РНК в клеточных линиях меланомы A375, G361, Sk-mel-1 и Sk-mel-5 при помощи метода ПЦР-РВ. Результат анализа показал, что только 4 гена, UNC45A, STK11IP, RHPN2 и ZNFx1, экспрессируются в линии А375 на достаточном уровне для проведения экспериментальной проверки гипотезы при помощи нокдауна. Клеточные линии G361, Sk-mel-1 и Sk-mel-5 продемонстрировали экспрессию интересующих генов на слишком низком уровне для проведения экспериментов по нокдауну. Дальнейшие эксперименты проведены на клеточной линии А375 с генами UNC45A, STK11IP, RHPN2 и ZNFx1.
Эксперименты по нокдауну генов ZNFx1, RHPN2, STK11IP и UNC45A.
Для каждого из выбранных генов, а именно ZNFx1, RHPN2, STK11IP и UNC45A, разработано и протестировано от 1 до 3 siРНК для подавления их экспрессии в клеточной линии меланомы А375. Для дизайна siРНК использована собственная
программа лаборатории, которая анализирует 20 нт последовательности мРНК гена и применяет к ним правила, перечисленные в обзорной работе Lagana (Lagana, Veneziano et al., 2015). Для каждого гена наиболее эффективная siРНК использована для изучения функциональных эффектов нокдауна для жизнеспособности и миграции. Для гена ZNFx1 выбрана siZNFx1#2, для гена RHPN – siRHPN#2, для STK11IP – siSTK11IP, а для UNC45A – siUNC45A. (рис. 1).
Рисунок 1. Подавление экспрессии генов-кандидатов при помощи различных siРНК в клеточной линии А375.
Примечание: Изменение экспрессии вычислено методом 2-ΔΔСт. Сравнены Ст генов- кандидатов с Ст генов «домашнего хозяйства» в клетках, обработанных специфической siРНК и в контрольных клетках (обработанных контрольной, неспецифической, siРНК).
Анализ результатов МТТ-теста не выявил статистически значимых изменений в выживаемости клеток, кроме одной временной точки (3 день) для гена STK11IP (Рис. 2).

Рисунок 2. Анализ изменения жизнеспособности меланомных клеток линии А375 во времени (в сутках) при подавлении в них экспрессии генов-кандидатов ZNFx1, RHPN2, STK11IP и UNC45A.
Примечание: Клетки линии А375 трансфицированы в 96-луночном планшете и проанализированы с помощью МТТ-теста. Значение по оси ординат соответствует разнице между оптической плотностью раствора формазана при длине волны 570 нм и фоновым поглощением при длине волны 670 нм. Нулевая точка по оси времени соответствует измерению жизнеспособности клеток в день трансфекции. Планки погрешностей соответствуют стандартному отклонению.
Далее проанализирована скорость миграции клеток, трансфицированных целевыми и контрольной siРНК, с использованием метода «Wound-healing». Результаты этого эксперимента показали, что нокдаун любого из генов-кандидатов, ZNFx1, RHPN2, STK11IP или UNC45A, увеличивает скорость миграции клеток (p<0,05) (Рис. 3). Рисунок 3. Индекс скорости миграции клеток меланомы A375 при проведении нокдауна в них указанных генов. Примечание: Клетки линии А375 трансфицированы контрольной (неспецифической) siРНК и siРНК, направленными на гены RHPN2, STK11IP, UNC45A и ZNFx1. Относительную скорость миграции вычислена из угла наклона прямой, аппроксимирующей график изменения площади, не занятой клетками, во времени. Планки погрешностей соответствуют стандартному отклонению.