Диагностические маркеры и предикторы неонатальной иммунной тромбоцитопении

Объем исследования и критерии включения пациентов. Все беременные женщины и новорожденные, включенные в исследование, наблюдались в ГБУЗ «Морозовская ДГКБ ДЗМ» и ГБУЗ «Измайловская ДГКБ ДЗМ». Исследование было одобрено этическими комитетами соответствующих клиник. Информированные согласия было получено от
всех участников.
Публикации. По результатам диссертации опубликовано 9 научных работ: 5 статей в журналах из списка ВАК, включая 2 статьи в журналах Q1 квартиля, и 4 тезиса докладов. Основные положения диссертации доложены на нескольких российских и зарубежных конгрессах.
Неонатальная трансиммунная тромбоцитопения (НТИТ). В исследование были включены 100 беременных женщин с диагнозом ИТП, установленным по следующим критериям: 1) количество тромбоцитов <100×109/л; 2) отсутствие других, неиммунных причин тромбоцитопении; 3) повышение уровня тромбоцитассоциированных IgG (ТА- IgG). После родов у части новорожденных была диагностирована неонатальная тромбоцитопения (нТП) с количеством тромбоцитов сразу после родов <100х109/л Неонатальная аллоиммунная тромбоцитопения (НАИТ). В исследование было включено 27 семей, в которых родители относили себя к русским или к другим европейским популяциям России. У детей, родившихся в этих семьях, диагностировали НАИТ по следующим критериям: 1) тромбоцитопения у новорожденного; 2) отсутствие тромбоцитопении у матери; 3) отсутствие иных причин возникновения нТП, в том числе ИТП, 4) наличие у матери цАТ, направленных против тромбоцитов отца и не реагирующих с тромбоцитами матери. Лабораторные методы. Отбор крови у детей и взрослых осуществлялся в соответствии со стандартизированными методиками. Кровь собирали без антикоагулянта (сыворотка) и с антикоагулянтами: ЭДТА 5% (150 мM), цитрат натрия 3,8% (129 мM), кислый цитрат - декстроза (КЦД) 1,25% (65 мM цитрата, 85 мМ цитрата натрия. 2% декстрозы (D- глюкозы)). Количество и средний объем тромбоцитов (СОТ) определяли в гематологическом анализаторе Abacus Junior B (Diatron Ltd., Austria), используя кровь, взятую в ЭДТА (5% (150 мM)). Методы, использованные для исследования ауто- и аллоантител против тромбоцитов, представлены на Рис. 1. Тромбоцит-ассоциированные иммуноглобулины (ТА-IgG) определяли по связыванию с отмытыми тромбоцитами 125I меченых антител козы против IgG человека, как описано ранее [Khaspekova S.G. еt al., 2015,]. ТА-IgG считали повышенными при уровне более 200% от контрольных значений у здоровых доноров. Циркулирующие (сывороточные) антитела (цАТ) в сыворотке матери определяли с помощью самостоятельно разработанного ИФА с использованием в качестве мишени нефиксированных, адгезированных на пластике тромбоцитов донора (НТИТ) или отца ребенка (НАИТ), как описано ранее [Хаспекова С.Г. и др., 2018, Khaspekova S.G. еt al., 2019]. Тест MAIPA (Monoclonal Antibody Immobilization of Platelet Antigens, иммобилизованные с помощью моноклональных антител антигены тромбоцитов) использовали для идентификации антигенов цАТ матерей при исследовании НТИТ и для выявления аллоантигенных мишеней в ГП IIIа (HPA1a и 1b) при исследовании НАИТ. Мажорные мембранные ГП IIb-IIIa и ГП Ib иммобилизовали из лизата тромбоцитов, на сорбированные на пластике моноклональные АТ (моноАТ) – CRC64 и VM16d соответственно, и исследовали связывание с ГП ауто- и аллоантител из сывороток пациентов [Khaspekova S.G. еt al., 2019]. Плазменный гликокалицин ‒ фрагмент тромбоцитарного ГП Ib, отщепляющегося от тромбоцитов при их разрушении и является маркером их оборота, определяли методом ИФА, разработанным в лаборатории клеточной адгезии НМИЦ кардиологии [Semenova M.M. et al., 1999]. Генотипирование HPA аллоантигенов проводили с помощью ПЦР, используя коммерческие наборы (BAG-gene HPA-TYPE (IMMUCOR)). Рис. 1. Использованные в работе методы определения антитромбоцитарных антител. Определение анти-НLА антител в сыворотках матерей с ИТП, проводили с помощью комплимент зависимого цитотоксического теста (лимфоцитотоксический тест) [Bodmer J еt al., 1966] с некоторыми модификациями, как описано в работе Головкиной Л.Л. и соавторов [Golovkina L. L. еt al., 2003]. Статистика. Статистический анализ был выполнен в программе: Statistica 10 (Stat. Soft, USA). Данные представляли, как медианы, 25% и 75% перцентили. Для сравнения групп использовали непараметрический анализ, поскольку в выборках отсутствовало нормальное распределение, – тест Манна-Уитни (Mann-Whitney) для сравнения количественных параметров и тест Хи-квадрат для сравнения качественных показателей. При анализе корреляционных взаимосвязей использовали тест Спирмана. При анализе теста на антитромбоцитарные цАТ, как предиктора НТИТ: определяли чувствительность и специфичность, проводили анализ ROC кривых, рассчитывали прогностическую значимость. Результаты исследования и их обсуждение. Неонатальная трансиммунная тромбоцитопения (НТИТ). В настоящей работе мы проводили поиск предикторов НТИТ у новорожденных от женщин с ИТП. У 100 женщин, включенных в исследование, был установлен диагноз ИТП во время беременности. Было зафиксировано снижение количества тромбоцитов менее 100×109/л (56 (48 – 76)×109/л), исключены не иммунные причины тромбоцитопении, а уровень ТА-IgG был выше 200% от контроля (340 (290 − 410)%). Учет повышения ТА-IgG позволил исключить матерей с неспецифическим снижением уровня тромбоцитов на поздних сроках беременности. Уровень плазменного гликокалицина, характеризующего оборот тромбоцитов, не был снижен − (1,8 (1,5 – 1,95) мкг/мл) по сравнению с показателями в контрольном пуле от 10 здоровых доноров (2 мкг/мл), что указывает на отсутствие подавления мегакариоцитов костного мозга. У беременных женщин с ИТП была зафиксирована типичная для ИТП сильная обратная корреляция между количеством тромбоцитов и уровнем ТА-IgG (r= ‒ 0.774, p<0.001), что подтверждает определяющую роль аутоантител в развитии тромбоцитопении. После родов матерей разделили на 2 группы ‒ 37 матерей, у которых родились дети с нТП, и 63 матери, у которых родились дети без нТП (нТП+ и нТП- группы соответственно). В группе нТП+ содержание тромбоцитов у новорожденных в первые сутки после рождения было ниже 100×109/л (47 (33 – 61) ×109/л). Уровень ТА-IgG составлял 270 (210 - 370) % от уровня здоровых доноров и у 28 детей был выше 200%, хотя ТА-IgG измеряли на 2-5 сутки после рождения. К этому времени содержание тромбоцитов у части новорожденных уже выросло по сравнению с первым днем после родов, и большинство (19 детей) получило лечение внутривенными иммуноглобулинами, что могло повлиять на уровень определяемого ТА-IgG по сравнению с первыми сутками после рождения. Из таблицы 1 видно, что группы нТП+ и нТП- не имели значимых различий по возрасту, времени начала ИТП (до/во время беременности), частоте использования кортикостероидов, количеству тромбоцитов, СОТ, и уровню ТА-IgG. Количество спленомегалий было минимальным – одна женщина в группе нТП+. Обе группы достоверно отличались только по одному признаку – наличию антитромбоцитарных цАТ, которые определяли, используя адгезированные тромбоциты здоровых доноров, как мишени для АТ из сывороток матерей. Таблица 1. Характеристика матерей с ИТП, у которых родились дети с и без нТП (нТП+ и нТП− группы) Показатели матерей с ИТП Группа нTП+ (n = 37) Группа нTП− (n = 63) p Возраст ИТП до беременности, % (n) Лечение кортикостероидами, % (n) Спленэктомия, % (n) Кол-во тромбоцитов, ×109/л Средний объем тромбоцитов, фл ТА-IgG, % от контроля Уровень гликокалицина, мкг/мл цАТ, % (n) 28 (23 - 31) 29% (11) 16% (6) 3% (1) 58 (45 - 68) 9,7 (9,2 - 10,3) 360 (310 - 420) 1,8 (1,5 - 1,9) 89% (33) 30 (26 - 33) 35% (22) 19% (12) 0% (0) 59 (43 - 79) 9,9 (9,1 - 11,0) 320 (270 - 400) 1,8 (1,5 - 2,0) 3% (2) н/д н/д н/д н/д н/д н/д н/д н/д < 0.001 Представлены медианы (25%-75%), проценты (n) Примеры определения цАТ в сыворотках у матерей с ИТП представлены на Рис. 2. В иммунологических методах, как в тесте ИФА на цельных тромбоцитах, так и далее в тесте MAIPA (см. ниже) для исключения неспецифических ложноположительных реакций был применен следующий подход. При раститровке ответ фиксировался как положительный только тогда, когда положительная реакция в титре 1 (сыворотка без разведения) воспроизводилась в титре 2. Это было обусловлено тем, что в предварительных экспериментах наблюдалось неспецифическое увеличение А 492 при добавлении некоторых неразведенных контрольных сывороток (доноры без ИТП) к иммобилизованным на пластике тромбоцитам и даже в лунках без тромбоцитов. Пример ложноположительной сыворотки, с показателями, незначительно превышающими контрольные (сыворотка донора), только без разведения (пациентка РО), и кривые связывания двух положительных сывороток с титром 4 и 32 (пациентки ПУ и РА), представлены на Рис. 2. То есть все положительные сыворотки имели титр ≥ 2. Такой подход позволил избегать ложноположительных ответов и повысил специфичность теста. 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 1 2 4 8 16 32 64 Титр Донор Пациентка РО (-) Пациентка ПУ (+) Пациентка РА (+) Рис. 2. Определение антитромбоцитарных цАТ, реагирующих с тромбоцитами здоровых доноров, у пациенток с ИТП. ИФА. К адгезированным тромбоцитам добавляли следующие сыворотки в различных титрах: сыворотка здорового донора (отрицательный контроль) (“Донор”, (●)); сыворотка пациентки РO, которую не считали положительной в связи с незначительным повышением А492 лишь при титре 1 по сравнению с контрольной сывороткой, которое не воспроизвелось при титре 2 (“Пациентка РO”,(○)); положительная сыворотка пациентки ПУ с титром 4 (“Пациентка ПУ”,(▼)); положительная сыворотка пациентки РА с титром 32 (“Пациентка РА”, ( )). Уровень связывания с тромбоцитами цАТ в анти-HPA-1a сыворотке в титре 16, использованной в качестве положительного контроля, составил 0,652 A492. A492 Антитромбоцитарные цАТ, были выявлены у 33 из 37 матерей в группе нТП+, и у 2 из 63 матерей, в группе нТП‒ (см. Таблицу 1). Чувствительность теста составила 89%, а специфичность – 97%. Площадь под ROC-кривой, построенной в зависимости от наличия нТП у новорожденных и титра цАТ в крови у матерей с ИТП, составила 0,939 (Рис. 3), что говорит о высокой прогностической возможности теста. Прогностическая значимость положительного результата составила – 94%, а отрицательного результата – 93,8%. При выполнении анализа на цАТ сыворотку матерей добавляли в титрах от 1 (без разведения) до 64. Титры цАТ в 33 положительных сыворотках варьировали от 2 до 32: 10 с титром 2; 7 с титром 4; 8 с титром 8; 7 с титром 16 и 1 с титром 32. Две сыворотки, реагирующие с тромбоцитами в нТП‒ группе, имели титр 2. Рис. 3. ROC анализ. Титр цАТ (≥ 0, >0, >2, > 4, > 8, > 16, > 32) у матерей с ИТП и наличие нТП у новорожденных. Титр «0» – отсутствие цАТ в крови у матери.
В группе нТП+ наблюдалась сильная обратная корреляция между титром материнских цАТ и содержанием тромбоцитов у новорожденных: r = − 0,774, p <0,001, n = 37 (отсутствие цАТ соответствовало титру 0), что иллюстрирует Рис. 4. Таким образом, степень тяжести неонатальной тромбоцитопении у новорожденных напрямую зависит от количества циркулирующих антитромбоцитарных антител в крови у матерей. Рис. 4. Обратная корреляция титра цАТ у матерей с ИТП и количества тромбоцитов у новорожденных в группе нTП + (r = −0,749, р <0,001). Титр «0» - отсутствие цАТ в крови у матери. Антигенную направленность цАТ у части матерей с ИТП определяли с помощью антиген специфического теста MAIPA, рассматривая главные антигены тромбоцитов – ГП IIb-IIIa и ГП Ib, как основные мишени. Типичные кривые связывания антитромбоцитарных цАТ в разных титрах с ГП IIb-IIIa и ГП Ib приведены на Рис. 5. Также нельзя исключить потерю и/или изменение аффинитета части эпитопов тромбоцитарных антигенов при приготовлении лизата тромбоцитов для теста MAIPA, несмотря на использование мягкого, не ионного детергента, Тритона Х-100. Не было обнаружено никаких взаимосвязей между наличием и титром анти-ГП IIb-IIIa антител и в тесте MAIPA и титром реагирующих с тромбоцитами цАТ, r = 0,182, p = 0,456, n = 19 (отсутствие анти-ГП IIb-IIIa антител соответствовало титру 0). То есть тест MАIPA, оказался малоинформативным как для прогноза неонатальной тромбоцитопении, так и для характеристики антитромбоцитарных цАТ. Антитела против НLА аллоантигенов обнаруживаются у 15−20% беременных женщин. Мы идентифицировали их в сыворотках части матерей с ИТП в группах нТП+ и нТП- с помощью комплимент зависимого цитотоксического теста. Антитела к HLA были обнаружены у 3 женщин из 11 в группе нТП+ и у 2 из 12 в группе нТП-. Не было выявлено никакой взаимосвязи между наличием анти-HLA антител и титром антитромбоцитарных цАТ. Эти данные указывают на то, что анти-HLA антитела не влияют на развитие и глубину неонатальной тромбоцитопении у детей, и крайне редко могут вызывать тромбоцитопению. Судя по литературным данным, таких случаев было зарегистрировано не более нескольких десятков [Bonstein L., еt al., 2017]. Рис. 5. Определение цАТ, реагирующих с иммобилизованными ГП IIb-IIIa и ГП Ib, у пациенток с ИТП. MAIPA. к иммобилизованному ГП IIb-IIIa (ГП IIb-IIIa) добавляли следующие сыворотки в различных титрах: контрольная сыворотка здорового донора (“Донор”, (●)); сыворотка пациентки ИЖ с титром 4 (“Пациентка ИЖ”, (○)); сыворотка пациентки KA с титром ≥ 8 (“Пациентка KA”, (■)). Уровень связывания с иммобилизованным ГП IIb-IIIa цАТ из анти-HPA-1a сыворотки в титре 16, использованной в качестве положительного контроля, составил 0,579 A492. К иммобилизованному ГП Ib (ГП Ib) добавляли следующие сыворотки в различных титрах: контрольную сыворотку здорового донора (“Донор”, (●)); сыворотку пациентки KA c титром 2 (“Пациентка KA”, (□)); сыворотку пациентки ТА с титром 4 (“Пациентка TA”, (▼)). Неонатальная аллоиммунная тромбоцитопения (НАИТ) Особенности патогенеза НАИТ в российской популяции исследовались в 27 семьях, в которых родители относили себя к русским или другим европейским популяциям России, а у детей был установлен диагноз НАИТ. У матерей не фиксировалась тромбоцитопения (уровень тромбоцитов был не ниже 150×109/л), не было повышения уровня ТА-IgG выше 200% от уровня контрольных доноров. (Характеристика матерей – см. Таблица 2). Эти данные указывают на отсутствие у матерей ИТП и исключают возможность рождения ребенка с НТИТ. Не было выявлено не иммунных причин, способных вызвать нТП у новорожденных. Тем не менее у всех детей в этих семьях в первые сутки после рождения и до начала лечения внутривенным введением иммуноглобулинов было зарегистрировано снижение количества тромбоцитов ниже 100×109/л (45 (18‒80)×109/л). Таблица 2. Характеристика матерей в семьях, где родились дети с НАИТ Характеристики пациенток (n=27) Возраст, лет Кол-во тромбоцитов во время беременности, х109/л Уровень ТА-IgG, % от контроля У предыдущих детей после рождения диагностировали нТП Выкидыш в анамнезе Антитромбоцитарные цАТ реагирующие с тромбоцитами отца, но не матери Представлены медианы (25%-75%), проценты (n) 30 (28,5-31,5) 177 (165-195) 150 (137-175) 3 (11%) 4 (14%) 27 (100%) Подтверждали иммунный характер тромбоцитопении у новорожденных, измеряя уровень ТА-IgG на 3−5 сутки после рождения. У всех детей уровень ТА-IgG был выше 200% от контрольных значений у здоровых доноров − (370 (250−550) %). У всех матерей в крови были обнаружены цАТ, реагирующие с тромбоцитами отца, но не реагирующие с их собственными тромбоцитами, что является ключевым диагностическим критерием НАИТ. На тромбоцитах отца представлены конфликтные аллоантигены, общие с новорожденным, но отсутствующие на тромбоцитах матери. Определение цАТ проводили методом ИФА, используя в качестве мишени иммобилизованные на пластике тромбоциты отца ребенка. Тромбоциты новорожденных с тромбоцитопенией не использовали в этом анализе по следующим причинам: 1) трудности связанные со взятием крови в достаточном количестве для данного анализа у новорожденного; 2) целевые эпитопы аллоантигенов на поверхности тромбоцитов новорожденного могут быть оккупированы материнскими аллоантителами. Типичные кривые связывания цАТ с тромбоцитами отца приведены на рис. 6. В качестве отрицательного контроля использовали сыворотку здорового донора, а в качестве положительного ‒ ранее охарактеризованную анти-HPA-1a сыворотку. В данном исследовании все протестированные образцы сыворотки от 27 матерей реагировали с тромбоцитами от отцов в титрах от 4 до 64 и не реагировали с тромбоцитами самих матерей. Эти данные наряду с отсутствием тромбоцитопении у матери, и отсутствием не иммунных причин развития нТП позволил выставить всем новорожденным в этих семьях диагноз НАИТ. Мать Анти НРА-1а Отец Донор 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 1 2 4 8 16 32 64 128 Титр Рис. 6. Связывание аллоантител матери ребенка с НАИТ с тромбоцитами отца. ИФА. Мать с HPA-1b/1b, ребенок с HPA-1a/1b и отец с HPA-1a/1a генотипами. К адгезированным на пластике тромбоцитам отца добавляли в различных разведениях (титрах): сыворотку матери («мать», ●), ранее охарактеризованную анти-HPA-1a сыворотку («анти-HPA-1a», (■) − положительный контроль), сыворотку отца («отец», (▲) и сыворотку здорового донора («донор», (▼) − отрицательный контроль). После постановки диагноза НАИТ проводили исследование молекулярной природы HPA-аллоантигенных конфликтов, выполняя генотипирование HPA-1, -2, -3, -4, -5 и -15 аллоантигенов у матерей, детей и части отцов. С помощью такого подхода НРА конфликтные антигены были выявлены в 23 из 27 семей (таблица 3). Среди 23 семей в 16 (70%) выявлена несовместимость по HPA-1 аллоантигену с одинаковой частотой (35%) конфликтов по НРА-1a (мать – HPA-1b/b и ребенок с HPA-1a) и НРА-1b (мать − HPA- 1a/1a, ребенок с HPA-1b) антигенам. В некоторых случаях конфликты по HPA-1 сочетались с другими возможными несовместимостями ‒ HPA-1a + НРА 2b (n=1); НРА- 1a + НРА-3b (n=1) и НРА-1b + НРА-5a (n=2). В 5 из 23 семей (22%) зарегистрированы изолированные конфликты по НРА-15 аллоантигенам (2 по НРА-15а и 3 по НРА-15b). Таким образом, по частоте встречаемости несовместимость по НРА-15 оказалась на втором месте после несовместимости по НРА-1. Изолированный конфликт по НРА-3b А492 Конфликтный аллоантиген НРА-3b НРА-5b НРА-15a НРА-15b n (%)1 Титры аллоантител в сыворотке матерей (против тромбоцитов отца) 16 4; 4 4; 8; 8 антигену зарегистрирован в 1 (4%) семье и по НРА-5b – также в 1 (4%) семье. В 4 из 27 семей генотипирование HPA-1, -2, -3, -4, -5 и -15 не выявило несовместимостей, что вероятно, указывает на наличие конфликтов по другим аллоантигенам. Таблица 3. Конфликты по НРА аллоантигенам при НАИТ НР А-1a НРА-1a + НРА-2b НРА-1a + НРА-3b 8 (35)2 1 16-64 32 32 НР А-1b НРА1b + НРА-5a 8 (35)2 2 16‒64 16; 64 1 (4)3 1 (4)3 2 (9)3 3 (13)3 1 % из 23 зарегистрированных генотипированием НРА конфликтов. 2 В том числе комбинированные несовместимости НРА-1a + НРА-2b, НРА-3b и НРА1b + НРА-5a. 3 Изолированные несовместимости по одному аллоантигену. Высокочувствительный тест ИФА (с использованием нативных тромбоцитов в качестве мишеней) позволил выявить разницу в титрах аллоантител при конфликтах по разным НРА антигенам. Наиболее высокие титры материнских цАТ, реагирующих с тромбоцитами отца, зарегистрированы в семьях с HPA-1 конфликтами (как с HPA-1a, так и с HPA-1b) ‒ от 16 до 64, а наиболее низкие ‒ в семьях с HPA-15 конфликтами ‒ от 4 до 8. В семьях с HPA-3b и HPA-5b несовместимостью в обоих случаях зарегистрированы титры антител 16 (таблица 3). Наиболее низкие титры − при HPA-15 конфликтах, что скорее всего связано с низким уровнем экспрессии этого аллоантигена, локализованного в CD109 белке, ‒ около 1000 копий на 1 тромбоцит [Curtis B., еt al., 2014]. Высокие титры − при HPA-3 и -5 и наиболее высокие – при HPA-1 конфликтах, так же вероятно связаны с уровнем экспрессии HPA-1 и -3 аллоантигенов, локализованных в ГП IIb-IIIa (αIIb/β3 интегрин) и HPA-5 аллоантигена, локализованного в ГП Ia-IIa (α2β1 интегрин), существенно выше – около 80 000 и 10 000 копий на 1 тромбоцит соответственно [Ikeda Y., еt al., 2008].) В данной работе были впервые изучены причины НАИТ в российской популяции. Результаты исследования показали, что в России частота встречаемости конфликтов по некоторым НРА антигенам, вызывающим развитие НАИТ, существенно отличается от таковых в других европейских популяциях (таблица 4). Таблица 4. Конфликты по НРА аллоантигенам при НАИТ в российской популяции и в европейских популяциях. Конфликтный аллоантиген % Конфликтов Российская Европейские популяции* популяция Польша 35 91,4 35 2,1 Великобритания Дания 75 73 1,5 8,5 НРА-1a НРА-1b НРА-3b 4 - - 3,3 НРА-5b НРА-15a НРА-15b 4 6,5 15,5 11,8 9 - 13 - 4 3,4 *[Curtis B.R. and McFarland J.G, 2014] У части матерей провели подтверждение антигенной специфичности цАТ, полученной по данным генотипирования, методом MAIPA. Во всех случаях анализировали связывание аллоантител из сыворотки матерей, предположительно (по результатам HPA генотипирования) направленных против НРА-1a и -1b (генотипы матерей HPA-1b/b и -1a/a соответственно), а в качестве мишеней использовали ГП IIb- IIIa, иммобилизованный из лизата тромбоцитов доноров с известными генотипами HPA- 1а/а и -1b/b. Кривые связывания приведены на рис.7. Положительные реакции регистрируются только при добавлении сыворотки пациентки с генотипом HPA-1a/a к ГП IIb-IIIa донора с генотипом HPA-1b/b и сыворотки пациентки с генотипом HPA-1b/b к ГП IIb-IIIa донора с генотипом HPA-1a/a, что подтверждает наличие у этих матерей аллоантител со специфичностью, соответствующей результатам генотипического анализа. Было протестировано 16 сывороток предварительно генотипированных по НРА- 1 матерей. Во всех случаях результаты иммунологического теста MAIPA совпали с результатами генотипирования. 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 ГП IIb-IIIa HPA-1a/a Пациентка ПЕ, анти НРА-1b Пациентка БР, анти НРА-1а 1248 Титр 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 ГП IIb-IIIa HPA-1b/b Пациентка ПЕ, анти НРА-1b Пациентка БР, анти НРА-1а 1248 Титр Рис. 7. Связывание цАТ с антигеном из лизата тромбоцитов типированных доноров. ГП IIb-IIIa иммобилизовали из лизата доноров ‒ с генотипом ГП IIb-IIIa HPA-1а/а и ГП IIb- IIIa HPA-1b/b. К ГП IIb-IIIa добавляли в различных титрах сыворотки матерей (пациенток), родивших детей с НАИТ, в крови которых содержатся цАТ против тромбоцитов отцов. Пациентка ПЕ (●) имела генотип HPA-1a/a и предположительно (по результатам генотипирования) вырабатывала аллоантитела против HPA-1b аллоантигена, а пациентка БР (○) имела генотип HPA-1b/b и предположительно (по результатам генотипирования) вырабатывала аллоантитела против HP A-1а аллоантигена. Результаты антигенного анализа подтверждают результаты генотипирования. цАТ пациентки ПЕ (генотип HPA-1a/a) реагировали только с ГП IIb-IIIa HPA-1b/b, а пациентки БР (генотип HPA-1b/b) только с ГП IIb-IIIa HPA-1/a В настоящей работе впервые изучены причины НАИТ в российской популяции. Известно, что у лиц белой расы в США и в странах Европы наиболее частой причиной НАИТ является несовместимость по НРА-1a аллоантигену, когда мать, гомозиготная по более редкому НРА-1b аллелю, вырабатывает антитела против тромбоцитов плода, несущих унаследованный от отца НРА-1а вариант этого антигена. Такие конфликты регистрируются в 70--80% НАИТ в этих популяциях [Bussel J., еt al., 2008, Zdravic D., еt al., 2016]. В 23 семьях, в которых мы идентифицировали природу HPA конфликтов, наиболее частой причиной несовместимости оказались НРА-1 аллоантигены (16 из 23 семей, 70%), A492 A492 но с одинаковой частотой конфликтов по НРА-1а и по НРА-1b вариантам (по 8 случаев, 35%). Кроме того, второй, наиболее частой причиной НАИТ оказались НРА-15 конфликты – 22% (5 из 23 семей). НРА-15 конфликты в ранее обследованных европейских популяциях встречаются реже и составляют по одним данным 4% [Biino G., еt al., 2013], по другим менее 2% [Curtis B., еt al., 2014]. В большинстве европейских популяций второе место среди причин НАИТ занимает несовместимость по НРА-5b антигену с частотой около 10−15% [Zdravic D., еt al., 2016, Ghevaert C., еt al., 2007]. В нашей группе зарегистрирован лишь один конфликт по этому аллоантигену. Нужно отметить, что частота встречаемости разных аллельных вариантов НРА антигенов в России не отличается от других европейских популяций [Golovkina L., еt al., 2011, Pchelina S., еt al., 2017]. Поэтому единственное возможное объяснение столь большого вклада НРА-1b и НРА-15 конфликтов в развитие НАИТ в России – это более высокая вероятность алло-иммунизации матерей по этим аллоантигенам. Такое явление может быть обусловлено особенностями распределения в российской популяции HLA антигенов, участвующих в презентации НРA-1b и HPA-15. В частности, в соответствии с этим предположением у доноров русского происхождения зарегистрирована высокая частота HLA гаплотипов HLA-DRB1*07:01, -DQB1*02 [Khamaganova E., еt al., 2017], наличие которых ассоциировано с продукцией HPA-1b алло-антител у HPA-1a/1a пациентов, которым проводились множественные переливания тромбоцитов [Golovkina L., еt al., 2015]. Выводы 1. Наличие у матерей с ИТП циркулирующих антитромбоцитарных аутоантител, выявляемых по их реакции с тромбоцитами здоровых доноров, является предиктором развития неонатальной трансиммунной тромбоцитопении у новорожденных. Тест обладает высокой чувствительностью − 89% и специфичностью – 97% (площадь под ROC кривой – 0,94). 2. Степень тяжести тромбоцитопении у новорожденных от матерей с ИТП коррелировала с уровнем циркулирующих антитромбоцитарных аутоантител в крови матери: коэффициент корреляции между титром аутоантител у матери и количеством тромбоцитов у новорожденных r = ‒ 0,774 (р <0,001). 3. Наличие у матери с нормальным содержанием тромбоцитов циркулирующих аллоантител, реагирующих с тромбоцитами отца и не реагирующих с тромбоцитами матери, является маркером неонатальной аллоиммунной тромбоцитопении у ребенка. Наиболее высокие титры аллоантител были зарегистрированы при несовместимости по HPA-1 аллоантигенам (как HPA-1a, так и HPA-1b) ‒ от 16 до 64, а наиболее низкие − при несовместимости по HPA-15 аллоантигенам (от 4 до 8). В двух семьях с изолированной несовместимостью по HPA-3b и HPA-5b аллоантигенам титры антител составили 16. 4. Выявлены наиболее распространенные иммунологические конфликты, являющиеся причиной неонатальной аллоиммунной тромбоцитопении в Российской популяции. Конфликты по HPA-1 аллоантигенам встречаются наиболее часто и составляют 70% (16 семей из 23) с одинаковой частотой конфликтов по НРА-1a (мать – HPA-1b/b и ребенок с HPA-1a) и НРА-1b (мать HPA-1a/1a, ребенок с HPA-1b) аллоантигенам. Вторыми по частоте были конфликты по НРА-15 аллоантигенам ‒ 22% (5 семей из 23). 5. Разработан и апробирован алгоритм дифференциальной диагностики неонатальных иммунных тромбоцитопений с использованием методов определения антитромбоцитарных антител у матери и ребенка. Практические рекомендации. 1. Для прогноза возможного развития и степени тяжести тромбоцитопении у новорожденного от матери с ИТП рекомендуется определять у нее наличие и титр циркулирующих антитромбоцитарных аутоантител в последнем триместре беременности и по возможности за месяц до родов. 2. Если у матери с нормальным количеством тромбоцитов и нормальным течением беременности и родов рождается ребенок с тромбоцитопенией неясного генеза, то для проверки диагноза аллоиммунной тромбоцитопении рекомендуется определить иммунологическую реактивность сыворотки матери по отношению к тромбоцитам отца. Так же это исследование рекомендуется проводить у беременных женщин без признаков тромбоцитопении, если у них в анамнезе были выкидыши неясной природы и/или у предыдущих детей при рождении диагностировалась тромбоцитопения неизвестной этиологии. 3. Линейка тестируемых антигенов при генотипировании семей, в которых родились дети с неонатальной аллоиммунной тромбоцитопенией, должна включать в первую очередь НРА-1 и НРА-15, аллоантигены, являющиеся наиболее частой причиной развития этой патологии в Российской популяции. 4. Для дифференциальной диагностики неонатальных иммунных тромбоцитопений рекомендуется использовать предложенный в работе алгоритм обследования матерей и новорожденных, включающий определение числа тромбоцитов и уровня тромбоцитассоциированных антител у матери и новорожденного и измерение циркулирующих антител в крови матери (рис. 8).