Экспрессия нейротрофинов в новой коре крыс и их цитопротективные эффекты при фокальной церебральной ишемии

Комплексное решение задач настоящего исследования проводилось с помощью экспериментальной редукции кровотока в бассейне средней мозговой артерии с последующим анализом неврологических нарушений (инструментальная и визуальная оценка чувствительности и двигательной активности) и топографической верификации области инсульта окрашиванием участков мозга с использованием 2,3,5- трифенилтетразолия хлорида.
Характеристика экспериментальной модели. Основной раздел работы выполнен на материале 60 крыс-самцов весом 200-250 г, содержащихся в стандартных условиях вивария. Условия содержания животных, а также экспериментальные условия соответствовали директиве 2010/63/EU Европейского союза 2010 года, определяющей правила научных экспериментов над животными. Эксперимент одобрен Междисциплинарным комитетом по этике ФГБОУ ВО ТГМУ Минздрава России, протокол No 4 от 6 марта 2013 г. Животных содержали в виварии в соответствии с «Санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник» (от 6.04.1993).
Фокальный ишемический инсульт моделировали с помощью метода постоянной филаментной окклюзии. Оперативное вмешательство осуществлялось в асептических условиях под ингаляционным однокомпонентным наркозом севофлураном. По достижении глубокого наркоза, крыса фиксировалась на манипуляционном столике с подогревом в положении на спине. После обработки операционного поля антисептиком на передней стороне шеи по средней линии производился разрез кожи длиной 1,5 см, выделялась левая общая сонная артерия (ОСА) и ее бифуркация на внутреннюю (ВСА) и наружную (НСА) сонные артерии, соответственно. Затем выполнялась перевязка ОСА и НСА. Крыло-небная артерия, как коллатераль ВСА, и коллатерали НСА – затылочная и верхняя щитовидная артерии – коагулировались. Через прокол ОСА в ее просвет вводился окклюдер – полиамидная нить (филамент), который надежно заполнял весь поперечник сосуда. Для усиления адгезивных свойств филамента его предварительно покрывали силиконом и обрабатывали в растворе поли-L-лизина. Окклюдер проводился интравазально в собственно ВСА на глубину около 1,5-2,0 см. Нить оставалась в просвете артерии и фиксировалась перевязкой ВСА. После чего рана ушивалась.
Время операции составляло 40-60 мин. Описанные манипуляции полностью исключают ретроградный и коллатеральный кровоток в ВСА, дают возможность
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, четырёх глав собственных исследований, заключения, выводов и библиографического указателя. Объём диссертации включает 126 страниц машинописного текста, 5 таблиц, 27 рисунков, включающих 111 микрофотографий, 26 графиков и 5 схем. Список литературы состоит из 219 источников.
ФГБОУ ВО ТГМУ
контролировать зону распространения инсульта в бассейне средней мозговой артерии. Животных выводили из эксперимента через 3-и, 7-е, 14-е и 21-е сутки после операции. На каждом сроке исследовали по 3 крысы. Контролем служили интактные животные. Для анестезии использовали внутрибрюшинное введение 3%-го раствора тиопентала натрия (60 мг/кг), после чего животных декапитировали.
Оценка эффективности моделируемого инсульта. Тестирование состояния животных после операции проводили регулярно через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 24, 48 и 72 часа после филаментной окклюзии по методу Rogers et al. (1997). Оценку неврологического дефицита выражали в баллах: 0 – нет неврологических симптомов; 1 – неспособность полностью вытянуть правую лапу; 2 – сила правой передней конечности заметно снижена; 3 – вращающейся и ползущее поведение к правой стороне «кружение по кругу»; 4 – не в состоянии ходить самостоятельно. Анатомические координаты области инфаркта мозга определяли с помощью окрашивания в растворе 2,3,5-трифенилтетразолия хлорида (ТТХ). Мозг извлекали на стекло, помещали в холодный физиологический раствор на 10 мин при 4°С и затем разрезали во фронтальной плоскости на ломтики толщиной 2-3 мм. Последние погружали в 2%-ый раствор ТТХ и выдерживали в течение 30 мин в темноте при 37°С. После инкубации ишемизированная ткань выглядят как неокрашенный участок теменной коры и внутренней капсулы величиной 0,3-1,3 см.
Модель экзогенного подведения BDNF. Для изучения цитопротективных свойств нейротрофинов и их влияния на ишемическую толерантность нейронов мы исследовали локализацию про- и антиапоптотических факторов в новой коре при моделируемом инсульте. Животных с филаментной окклюзией средней мозговой артерии разделяли на две группы. Животным первой группы (n=6) в хвостовую вену вводили 0,3 мл (50 мкг/мл) BDNF (Recombinant BDNF protein, Abcam, Великобритания, ab9794). Животные второй группы (n=6) служили контролем, им в хвостовую вену инъецировали 0,3 мл физиологического раствора (Zhang et al., 2018). После верификации инсульта с помощью ТТХ, фронтальные срезы больших полушарий обрабатывались для иммуноцитохимического выявления локализации иммунореактивных каспазы-3, p53, Bcl- 2 и Mdm2.
Головной мозг экспериментальных и контрольных животных обрабатывали для иммуноцитохимического исследования локализации нейротрофинов (NT-3, BDNF, GDNF), нейроглиальных маркеров (GFAP, Iba-1, S-100) и апоптотических факторов (каспаза-3, p53, Bcl-2, Mdm2). Гисто- и иммуноцитохимические исследования начинали не позднее 15-20 мин после извлечения материала.
Иммуногистохимические и гистологические методы исследования. Материал головного мозга фиксировали в 10% нейтральном формалине на фосфатном буфере в течение 24 часов, после чего промывали 0.1 М Na-фосфатном буфере (рН 7,2) с 6-7 кратной сменой раствора и заливали в парафин по общепринятой методике. Срезы толщиной 15 мкм монтировали на предметные стекла, депарафинировали и инкубировали первичными антителами, разведенными в фосфатном буфере, содержащем Тритон Х-100 и нормальную сыворотку козы, в течение ночи при комнатной температуре. Данные об использованных первичных антителах и их рабочее разведение приведены в таблице 1. Срезы инкубировали в течение ночи при температуре +4°С. После чего промывали 0.1 М Na-фосфатным буфером и затем в течение 1 ч инкубировали в растворе биотинилированных вторичных антител против иммуноглобулина мыши и кролика

Таблица 1
Антитела
GFAP Iba-1 S-100
Характеристика первичных антител
соответственно первичным антителам (Biotinylated Goat anti-Mouse IgG (ab64255, Abcam, UK,) и Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Biotin, (No 31820; Invitrogen, США) в разведении согласно протоколу фирмы производителя, а затем в растворе авидин- пероксидазного комплекса (Abcam, Великобритания). После этого срезы выдерживали 4 мин в растворе диаминобензидина (DAB Substrate Kit; Abcam, Великобритания), затем трижды промывали фосфатным буфером, обезвоживали и заключали в бальзам. В качестве контроля из среды исключали первичные антитела, окрашивание клеток отсутствовало.
Производитель
Abcam, Великобритания (ab7260)
Abcam, Великобритания (ab5076) Abcam, Великобритания (ab14849)
Рабочее разведение
1:1000 4 μg/ml 1:3000
GDNF кроличьи поликлональные
Abcam, Великобритания (ab18956)
, США (2070329)
5 μg/ml
BDNF мышиные моноклональные
Abcam, Великобритания (ab205067)
5 μg/ml
NT-3 кроличьи поликлональные
Abcam, Великобритания (ab216491)
1:200
Caspase-3
кроличьи моноклональные
Thermo Fisher Scientific
1:10
p53 кроличьи моноклональные
Thermo Fisher
Invitrogen (
Scientific), США (MA5-14516)
1:100
Bcl-2 кроличьи поликлональные
Thermo Fisher
Invitrogen (
Scientific), США (PA5-27094)
1:500
Mdm2 кроличьи поликлональные
Thermo Fisher
Invitrogen (
Scientific), США (PA5-85094)
1:500

Морфометрия и количественная обработка данных. Препараты просматривали в световом микроскопе AxioScope A1 (Carl Zeiss, Германия) и фотографировали при помощи цифровой камеры AxioCam ICc3. Морфометрическую обработку полученных фотографий проводили при помощи пакета программ AxioVision 4.8.1. Относительную плотность иммунноокрашенных клеток вычисляли на участках коры площадью 0,1 мм2. При подсчете учитывались только сохранные клетки, содержащие ядро, с учетом поправки на толщину среза и диаметр ядра по Аберкромби. Включение этой поправки в расчеты позволяет исключить повторный подсчет на серийных срезах одной и той же клетки, в результате ее фрагментации. Достоверность межгрупповых различий определяли методом рангового дисперсионного анализа с попарными двусторонними post hoc тестами Манна-Уитни. Достоверными признавались различия при P ≤ 0.05 с поправкой Бонферрони на множественную проверку нулевых гипотез.
В отдельных случаях определяли долю позитивно окрашенных нейронов. Для этого с помощью окуляр-морфометрической сетки подсчитывали абсолютное количество иммунореактивных клеток на участках коры площадью 0,29 мм2 в 20-25 полях зрения и высчитывали их долю от среднего числа клеток, окрашенных в сходных областях по методу Ниссля. Данные обрабатывали методом вариационной статистики с определением t-критерия достоверности по Стьюденту (P<0,05). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Модель филаментной окклюзии средней мозговой артерии соотносится с гемодинамическими изменениями при инсульте у человека (Sommer, 2017). Внесенные нами методические модификации позволяют исследовать топохимию различных НТ, опосредующих ишемическое повреждение нейронов и глии, а также изучить распространение апоптоза как ведущего механизма гибели клеток в условиях постишемической экспрессии генов. Эти данные позволяют картировать цитопротективные эффекты НТ. Маркированные нейроны по-разному реагируют на ишемическое воздействие и даже в зоне тотального инсульта всегда имеются погибшие и пережившие это явление клетки. В настоящей работе установлено гетерогенное распределение BDNF, GDNF и NT-3 в неокортексе крыс, которое дополняется их различной стратификацией в ядре инсульта и пенумбре на каждом сроке ишемии. У контрольных животных BDNF-иммунореактивные нейроны обнаруживаются во всех слоях коры, имеют интенсивно окрашенный перикарион и первичные сегменты дендритов. Экспрессия BDNF преобладает в пирамидных клетках, количество которых в контроле составляет 81,3±1,1%. Субпопуляция BDNF-позитивных интернейронов включает полиморфные и биполярные клетки. Динамика плотности BDNF-реактивных клеток у экспериментальных крыс в разных слоях коры значительно отличается от контрольной группы (рис. 1). В первые сутки ишемии в ядре инсульта маркируются пирамидные и непирамидные клетки слоев II и V с высокой степенью иммунореактивности и небольшие скопления бледно окрашенных нейронов в слоях I и VI. На третьи сутки ишемии ядро инсульта становится полностью организованным. Большинство клеток здесь дистрофически изменены, они увеличены в размерах, перикарионы без чётких контуров. В нейропиле наблюдаются признаки перивазального и перинейронального отёка. Границы слоёв стёрты, чётко определяются только слои I/II, где на BDNF окрашивается лишь 9,8±2,1% клеток от их общего количества в контроле. В остальных слоях встречаются редкие пирамидные клетки и астроциты с умеренной и слабой иммунореактивностью. На 8 сутки после операции в слое V выявляются единичные BDNF-позитивные клетки, а на 21 сутки в ядре ишемии нейроны и глиальные клетки не маркируются. В зоне пенумбры BDNF-иммунореактивные клетки превалируют в слоях II/III и V. Их количество редуцируется в первые и третьи сутки ишемии, а начиная с восьмых суток, постепенно увеличивается. Количество таких клеток возрастает примерно на 3,2±1,1% на каждые 100-150 мкм латерально от границы ядра инсульта. При сравнении плотности маркированных клеток во II слое коры в ядре и пенумбре ни в одном из исследованных периодов ишемии достоверных различий не обнаружено. Однако в слоях V и VI на третьи и двадцать первые сутки после окклюзии плотность BDNF- иммунореактивных клеток в пенумбре достоверно превышает их количество в фокусе ишемии. Рис. 1. Динамика пространственной плотности BDNF-иммунореактивных клеток в ишемическом очаге и пенумбре новой коры крыс при экспериментальной ишемии. По оси абсцисс --- контрольное значение плотности (С) и значения плотности в контрольных точках ишемического процесса (1, 3, 8, 21 сутки). По оси ординат --- пространственная плотность клеток (в 0,1 мм2). Высокую степень неоднородности демонстрирует топография иммунореактивного GDNF (рис. 1). У контрольных животных маркер локализуется в нейронах всех слоёв коры, составляющих 52±4,5% от общего количества клеток. Относительное количество окрашенных нейронов в ядре инсульта неизменно снижается. Впервые сутки их выявляется 29±2,1%, на 8 сутки – 13,8±0,6% и 3,1±0,2% на 21 сутки после окклюзии СМА. При этом в первые трое суток плотность клеток в ядре ишемии достоверно возрастает в слоях I/II и снижается в глубоких слоях коры. Основную порцию GDNF- иммунореактивности в ядре и пенумбре на 8-е и 21-е сутки эксперимента формируют глиальные клетки. Сравнительная оценка плотности маркированных клеток в одинаковые сроки «ишемического» периода показывает различные значения по слоям коры в ядре инсульта и пенумбре. Рис. 2. Динамика пространственной плотности NT-3-иммунореактивных клеток в ишемическом очаге и пенумбре новой коры крыс при экспериментальной ишемии. По оси абсцисс --- контрольное значение плотности (С) и значения плотности в контрольных точках ишемического процесса (1, 3, 8, 21 сутки). По оси ординат --- пространственная плотность клеток (в 0,1 мм2). При иммуногистохимическом выявлении NT-3 в неокортексе контрольных крыс обнаруживаются преимущественно пирамидные клетки, составляющие 78,3±2,4% от общего числа нейронов. В первые сутки после индукции инсульта в ядре ишемии наблюдается снижение иммунореактивности по всему поперечнику коры с максимальной концентрацией реактивных клеток в слое II, в то время как в слоях III/IV и VI выявляются лишь единичные клетки. В I и VI слоях коры ни в одной из контрольных точек экспериментальной ишемии не отмечено достоверных различий между плотностью клеток в зоне фокуса и пенумбры, в то время как в остальных слоях такие различия становятся ярко выраженными (рис. 2). Так, в первые сутки инсульта в пенумбре отмечается постепенное нарастание общего количества иммунореактивных клеток с превалированием последних в слоях V и VI и заметным нейрональным опустошением в поверхностных слоях коры. На третьи и восьмые сутки эксперимента в ядре ишемии почти не встречаются NT-3-позитивные нейроны. В пенумбре в этот период NT-3 экспрессируют в основном нейроны слоёв II/III, в остальных слоях встречаются редкие диффузно рассеянные клетки. В астроцитах иммунореактивность заметно снижается, а их скопления располагаются в непосредственной близости к ядру ишемии. На 21-е сутки в ядре инсульта между стенками кистоподобных лакун наблюдаются диффузно рассеянные мелкие NT-3-позитивные клетки с округлым или полигональным перикарионом. В этот удаленный период ишемии в пенумбре выявляется топографический паттерн иммунореактивности, соответствующий распределению NT-3 в контроле, хотя и при значительно меньшем количестве окрашенных клеток. Нейрональный компартмент НТ дополняет их нейроглиальный пул, который играет решающую роль в развитии адаптации к окислительному стрессу и нейровоспалению. Выяснение состояния глиальных клеток можно рассматривать как своеобразный «маркер» повреждения ткани мозга при гипоксии и ишемии. Реакция глиоцитов в ядре инсульта и ишемической пенумбре характеризуется четкой пространственной и временной динамикой, при которой закономерно меняются их стратификация, морфологические и иммунологические свойства. Распределение GFAP меняется уже в первые сутки ишемии, когда в фокусе инсульта увеличивается количество иммунореактивных астроцитов (таблица 2). Таблица 2 Плотность распределения глиальных клеток в 0,1 мм2 теменной коры крысы на разных сроках ишемии (М±SEM) Маркер/ топография Контроль 1 сутки 3 сутки 8 сутки 14 сутки 21 сутки GFAP Фокус инсульта Пенумбра 4,7±0,06 7,9±0,4 4,8±0,3 3,8±0,2 9,3±0,8 1,0±0,07 16,9±0,8 0,8±0,07 16,9±0,8 0 19,1±2,1 S-100 Фокус инсульта Пенумбра 5,3±0,1 6,3±0,05 5,8±0,1 3,0±0,08 10,5±0,9 1,2±0,08 16,7±1,3 1,0±0,07 18,1±2,1 0,9±0,06 22,8±4,1 GDNF Фокус инсульта Пенумбра 0,2±0,01 0,9±0,07 1,3±0,04 2,8±0,08 2,0±0,04 4,7±0,2 3,9±0,3 3,1±0,4 2,9±0,03 1,1±0,03 2,5±0,05 Iba-1 Фокус инсульта Пенумбра 14,1±1,4 17,2±1,3 11,3±0,7 33,8±1,5 14,4±0,9 56,1±6,3 18,6±0,9 39,8±3,2 17,3±1,4 31,3±2,1 15,1±0,8 Количество GFAP-позитивных клеток здесь падает до нуля, но постепенно нарастает в перифокальной зоне. На 8-21 сутки она включает множество астроцитов с высоким содержанием GFAP, окружающие очаг инсульта со всех сторон. Ширина GFAP- иммунореактивной пенумбры достигает 500-800 мкм в латеральных направлениях, сверху она занимает слои I/II, а снизу совпадет с положением подкоркового белого вещества. На 21 сутки обнаруживается перераспределение реактивных астроцитов: их плотность возрастает на границе с фокусом инсульта и снижается по периферии пенумбры (таблица 2). Описанные изменения ведут к смещению границ иммунореактивной перифокальной зоны и заметному сужению очага инсульта в поздний ишемический период. Распределение S-100-позитивных астроцитов в норме и на всех сроках ишемии в основном повторяет характеристический паттерн локализации GFAP. На 3 и 8 сутки в ядре инсульта, где практически не выявляется S-100-реактивной глии (таблица 2), окрашивается субпопуляция пирамидных нейронов. Эти последние формируют скопления в слоях III и V и никогда не наблюдаются в области пенумбры. Относительное количество S-100-позитивных пирамидных клеток составляет 37,3±3,9% на 1 сутки, 22,2±1,2% на 3 сутки и 16,3±2,3% на 8 сутки эксперимента. Позднее они не маркируются. Высокую степень неоднородности демонстрирует топография GDNF. У контрольных животных маркер локализуется в нейронах слоёв II/III и V/VI и очень незначительно – в глии. Динамика экспрессии GDNF в астроцитах показывает обратную зависимость (таблица 2). Максимум GDNF-иммунореактивной глии наблюдается в ядре инсульта и перифокальной пенумбре в конце первой недели от индукции ишемии. Iba-1, как избирательный маркер микроглии, окрашивает её по всей коре и в подкорковом белом веществе, где в норме она локализуются диффузно без какого-либо регулярного порядка. Типичный Iba-1-позитивный микроглиоцит имеет сому диаметром 7-10 мкм, от которой радиально отходят несколько тонких шиповидных мало ветвящихся отростков длиной до 40 мкм. Развитие инсульта радикально меняет форму клеток и их положение в коре. Их плотность резко возрастает в фокусе ишемии уже на 3 сутки и достигает максимума на 8 сутки (таблица 2). В этот период ядро инсульта окрашивается как сплошная иммунореактивная зона, чётко отграниченная от пенумбры. В самой пенумбре численность микроглии мало отличается от контрольных значений. На каждом сроке ишемии активированные микроглиоциты имеют характерную рамнификацию. Вначале тела клеток увеличиваются в размерах, отростки их утолщаются и утрачивают часть коллатералей, покрываясь на всем протяжении варикозными утолщениями. На третьи сутки отростки приобретают вид пеньков и коротких вздутий, а затем исчезают. В фокусе инсульта на 8-21 сутки микроглия состоит исключительно из популяции безотросчатых округлых или овальных клеток. Для оценки цитопротективной эффективности нейротрофинов мы исследовали экспрессию про- и антиапоптотических факторов в теменной коре при фокальном ишемическом инсульте и характер их распределения при внутривенной инъекции BDNF. В контрольной группе крыс относительное количество Bcl-2-, Mdm-2, каспаза-3- и p53- иммунореактивных нейронов составляет 21,7±1,9%, 2,3±0,03%, 5,3±0,3% и 3,2±0,2%, соответственно. Активация экспрессии проапоптотических молекул (p53 и каспазы-3) отмечается на всем протяжении исследованного ишемического периода (рис. 3). Иммунореактивные клетки распределяются в коре очень неравномерно. В фокусе ишемии на первые сутки выявляются небольшие популяции пирамидных и непирамидных нейронов в слоях II/III. На третьи сутки их количество достоверно возрастает, однако в контралатеральном полушарии этот эффект выражен гораздо слабее. На 8е сутки возникает достоверное снижение доли каспаза-3- и p53-иммунореактивных нейронов. На 21е сутки эти показатели достоверно снижаются по сравнению с восьмыми сутками. При этом во всех контрольных точках, кроме 1 суток, процентная доля клеток в контралатеральном полушарии достоверно ниже по сравнению с ядром инсульта и пенумброй (рис. 3). В пенумбре на p53 и каспазу-3 выявляются диффузные скопления пирамидных нейронов в слоях III и V. Количество иммунореактивных клеток здесь нарастает постепенно и достигает максимума на 3 сутки. Затем их численность слегка снижается, однако на 21 сутки в пенумбре наблюдается всплеск иммунореактивности в крупных пирамидных клетках V слоя. Рис. 3. Bcl-2, каспаза-3-, MDM2- и p53-иммунопозитивных клеток в теменной коре крыс на разных сроках ишемического повреждения в отсутствии BDNF (верхний ряд графиков) и внутривенном подведении BDNF (нижний ряд графиков). По оси абсцисс - время после инициации ишемического повреждения (сут), по оси ординат - относительное количество маркированных клетках (%). Ишемический инсульт вызывает закономерную альтерацию экспрессии антиапоптотических молекул Bcl-2 и Mdm-2. Локализация молекул в неокортексе экспериментальных животных имеет гетерогенный характер. Bcl-2-реактивные клетки доминируют в ядре ишемии, где в поздний ишемический период можно идентифицировать глиальные и ненейрональные элементы. Процентная доля иммунореактивных клеток здесь достоверно меньше, чем в контралатеральном полушарии, на всех исследованных сроках ишемии. Аналогичный количественный паттерн наблюдается в пенумбре на первые и третьи сутки ишемии. Однако если в ядре инсульта определяется достоверное снижение количества Bcl-2- и Mdm-2- иммунореактивных клеток от 3-их к 21-м суткам, то в пенумбре и контралатеральном полушарии процентная доля клеток сначала достоверно возрастает, а на 21 сутки – достоверно снижается. Mdm-2-реактивные клетки локализуется преимущественно в пенумбре и исключительно в нейронах. В течение всего ишемического периода наблюдается тенденция к смещению Mdm-2-иммунореактивного окрашивания с поверхностных уровней коры к слоям V и VI. На 21 сутки высокая степень экспрессии Mdm-2 обнаруживается в крупных пирамидных нейронах V слоя. При этом в ядре ишемии процентная доля маркированных клеток достоверно выше этих показателей в контралатеральном полушарии. Экзогенное подведение BDNF не одинаково влияет на экспрессию про- и атиапоптотических факторов и реорганизует их локализацию на стороне ишемического повреждения (рис. 3). Так, процентная доля Mdm-2-иммунореактивных клеток в пенумбре значительно и достоверно возрастает с 1 на 3 сутки, а затем – так же достоверно и с хорошей величиной эффекта убывает. При этом в пенумбре во всех контрольных точках количество маркированных клеток достоверно выше, чем в ядре инсульта и контралатеральном полушарии, с максимальными значениями на 1, 3 и 8 сутки. Кроме того, количество клеток в пенумбре достоверно выше, а в ядре инсульта достоверно ниже аналогичных показателей, полученных на модели без введения BDNF. При этом количество Mdm-2-иммунореактивных клеток в контралатеральном полушарии фактически идентична таковой в модели без BDNF. Различия в распределении Bcl-2- иммунореактивных клеток при введении BDNF менее заметны. В этом случае Bcl-2 экспрессирует сравнительно небольшая популяция интернейронов слоёв II/III и VI, а их количество во всех контрольных точках мало отличается от показателей на модели без BDNF. Описанная динамика распределения антиапоптотических молекул на фоне введения BDNF сопровождается достоверным уменьшением количества каспаза-3- и p53- иммунореактивных клеток с максимумом эффекта на 3-и и 8-е сутки (рис. 3). При этом значимых изменений в контралатеральном полушарии не обнаружено. В самом очаге инсульта существенных изменений не выявляется, а основная порция позитивно окрашенных клеток здесь относится к категории астроцитов, микроглии или пришлых фагоцитов. Не вызывает сомнения, что в фокусе инсульта и окружающей пенумбре наблюдается избирательная гибель нейронов, которую, как показывают результаты нашей работы, поддерживают неоднородная экспрессия НТ, баланс экспрессии апоптотических и противоапоптических молекул и избирательная реакция глии в различные периоды ишемического процесса. Очаг тотального некроза, ядро инсульта, окружается пенумброй – зоной обратимого ишемического повреждения, где наблюдается избирательная и отсроченная гибель клеток. В механизме этой избирательности участвует фактор, индуцируемый гипоксией α1, который запускает экспрессию апоптотических молекул и НТ (Barteczek et al. 2017; Sarkar et al. 2019). На моделях временной редукции церебрального кровотока показано, что в ядре ишемии в первую очередь погибают пирамидные нейроны средних и нижних корковых слоёв, а в пенумбре – клетки слоёв I/II и поверхностного уровня слоя III (Witte et al. 2000). Причины этого явления связывают с дифференцированной локализацией субъединицы GluR2 AMPA-рецепторов, имеющей ограниченную проницаемость для ионов Ca2+. При инсульте GluR2 сдерживает распространение глутаматной гипервозбудимости, что наряду с апоптозом ГАМК- ергических нейронов вызывает неоднородную гибель клеток по слоям коры (Sommer, Kiessling 2002). Иммунолокализация исследованных нами НТ согласуется с описанным порядком ишемического повреждения только в первые сутки инсульта, когда в ядре и пенумбре плотность окрашенных нейронов демонстрирует противоположные тренды. Первоначальной реакцией на окислительный стресс является тотальная редукция маркированных клеток на стороне повреждения. В отсроченный период эти показатели увеличиваются, однако существенно варьируют для каждого типа НТ. Достоверное снижение количества маркированных клеток в соответствующих слоях ядра и пенумбры может быть связано с аноксической гибелью части нейронов. Остальная их популяция характеризуется селективной устойчивостью и высоким уровнем экспрессии НТ. К ним относятся пирамидные нейроны супра- и инфрагранулярных слоев, и в меньшей степени интернейроны слоёв I и VI. Данные настоящей работы отвечают быстрой и активной экспрессии генов BDNF и NT-3 и их рецепторов с максимумом через 72 часа после окклюзии средней мозговой артерии (Dmitrieva et al. 2016). Нарастание синтеза НТ при увеличении экспозиции фокальной ишемии способно успешно компенсировать ишемию мозга (Mitroshina et al. 2019). При этом нейроны слоя IV в ядре инсульта не выявляются, а в пенумбре их количество значительно редуцировано. Относительно небольшая популяция BDNF- и NT-3-позитивных клеток обнаружена нами на 8-ой и 21-ый день от начала инсульта. Слой IV отличается значительной концентрацией возбуждающих глутаматергических связей, которые формируют таламокортикальные афференты и шипиковые звездчатые клетки (Andjelic et al. 2009). Можно полагать, что эти нейроны лишаются нейротрофиновой поддержки в период ишемической гипервозбудимости и поражаются в первую очередь. Если границы ядра инсульта, как правило, определяются чётко, то ареал распространения пенумбры при микроскопии коры не всегда столь очевиден. Своеобразным маркером границ пенумбры могут служить скопления активированных астроцитов с индуцибельной экспрессией GDNF и GFAP. Специфика глиальной реактивности на разных этапах инсульта кардинально меняется и зависит от комплексной перестройки ткани мозга в пенумбре и ядре ишемии. Индукция основных глиальных белков всегда сопровождает альтерацию нейронов при ишемии, нейровоспалении и гипервозбудимости (Michetti et al., 2019). В одних случаях это явление вызывает цитопротективные эффекты, в других – обращает их на противоположные. Смещение этого молекулярного «реостата» при инсульте, прежде всего, сказываются на состоянии нейронов пенумбры – главной мишени протективного воздействия. Однако определение границ пенумбры остаётся дискуссионным вопросом, особенно при микроскопии ишемизированного мозга. Наши данные по стратификации GFAP позволяют рассматривать его как полезный инструмент в решении этого вопроса. Внутри фокуса инсульта астроциты с повышенной экспрессией GFAP быстро исчезают, но постоянно окружают его в течение всего ишемического периода. При этом GFAP-позитивные астроциты часто группируются в I слое и подкорковом белом веществе, указывая на избирательную локализацию ядра ишемии с преимущественным поражением клеток глубоких слоев коры. Увеличение количества астроцитов в I слое неокортекса обнаружено нами также на границе раздела между ядром инсульта и пенумброй, где они изначально являются барьером для регенерации аксонов. Можно полагать, что гиперэкспрессия GFAP и НТ оказывает защитный эффект на субпиальные регионы коры, которые часто не подвергается повреждению даже при обширном кортикальном инфаркте (Mitroshina et al. 2019). Представления о сложных нейроглиесосудистых контактах в последнее время существенно дополнились данными об участии глии в генерации потенциалов действия и синаптической пластичности, а способность астроцитов синтезировать НТ, газотрансмиттеры, рецепторы медиаторов позволяет рассматривать их в качестве равноправного партнера нейронов в информационных процессах мозга (Калиниченко и др., 2019; Ma et al., 2016). Данные настоящего исследования указывают на тесные метаболические отношения астроцитов и нейронов, адаптирующие их к условиям ишемии. Установленное нами постепенное смещение GDNF-иммунореактивности из нейронального в глиальный компартмент пенумбры следует рассматривать как проявление протективных свойств нейротрофина. Способность астроцитов аккумулировать высокие уровни GDNF показана на различных моделях ишемического инсульта (Duarte et al., 2012). Механизмы подобных взаимосвязей остаются неясны. Однако известно, что индукцию экспрессии GDNF в астроцитах опосредуют аденозиновые А2А-рецепторы (Yamagata et al., 2007). Можно полагать, что аноксия быстро истощает нейронный пул АТФ, вызывает нарастание уровня аденозина в нейропиле и вторичное накопление GDNF в астроцитарной глии. Если это действительно так, то GDNF здесь противостоит вазоконстрикторному действию АТФ, которое при нарушении кровотока может усиливать ишемический процесс (McConnell et al. 2017). Рассмотренные варианты иммунореактивности клеток в зоне ишемической пенумбры дополняют данные по локализации BDNF- и NT-3-позитивных клеток, которая в разные периоды корковой ишемии закономерно смещается в латеральном и вертикальном направлениях от ядра инсульта. Этот факт указывает на динамические изменения границ нейропротективной зоны и согласуется с гипотезой, рассматривающей пенумбру как мозаику из множественных микролокусов переживающих инсульт нейронов (del Zoppo et al. 2011). Эта особенность касается и контралатерального полушария, где при экспериментальном инсульте наблюдается индукция экспрессии NT-3, TrkA и TrkC, (Dmitrieva et al. 2016), а по нашим данным формируется сходный с пенумброй паттерн иммунолокализации НТ. В самом фокусе инсульта мы наблюдали обратный процесс – появление иммунореактивного S-100 в пирамидных нейронах и исчезновение его в астроцитах. Эти процессы происходят в первую неделю после окклюзии сосуда и, видимо, являются следствием постишемической распространяющейся деполяризации. S-100 – кальций- связывающий протеин, вовлекается в утилизацию избытка Ca2+, который неизбежно возникает при развитии эксайтотоксичности (Michetti et al., 2019). Индукция экспрессии S-100 здесь выступает как адаптивный фактор, предохраняющий нейроны от перевозбуждения и гибели. Подобный феномен описан относительно индуцибельной NO- синтазы, которая вырабатывается в активированных астроцитах при эпилептогенезе (Калиниченко и др., 2004) и пирамидных нейронах в фокусе ишемического инсульта (Zhou et al., 2007). Не исключен и другой вариант, при котором S-100 поступает в пирамидные клетки путём транслокации белка из цитоплазмы глиоцитов. Ранее было показано, что в условиях ишемии астроциты могут транспортировать функционирующие митохондрии и цитопротекторы непосредственно в нейроны по Ca2+-зависимому механизму (Hayakawa et al., 2016). Повышение астроцитарной реактивности не всегда носит протективный характер. При интенсивном окислительном стрессе астроциты вступают в молекулярные ассоциации с микроглией и становятся мишенью провоспалительных цитокинов (Liddelow et al., 2017). При феномене эксайтотоксичности массивный вход ионов Ca2+ в митохондрии повреждает и даже блокирует продукцию АТФ. Формирующаяся ситуация энергетического голода потенцирует еще одно ключевое событие – гиперпродукцию оксида азота, наработку пероксинитритов и других свободных радикалов (Охотин и др., 2002). В этой ситуации астроциты способны усиливать отек и вазоспазм, а также выделять цитотоксические и апоптотические факторы. Астроциты могут также участвовать в защите от окислительного стресса через механизмы, которые включают использование глутатиона, антиоксидантной аскорбиновой кислоты и редокс-чувствительного фактора транскрипции Nrf2. Путь использования Nrf2 активируется как в культуре тканей, так и в моделях ишемии in vivo. Астроциты могут иметь значительно большую метаболическую пластичность, чем нейроны. В очаге инсульта они переходят на гликолитический путь, компенсируя падение уровня АТФ, что является процессом, который, по-видимому, не выражен у нейронов. В свою очередь, АТФ и другие пурины повышают пролиферацию астроцитов, активирует микроглию в участке повреждения. Недавно было показано (Zhang et al., 2020), что антиоксидантная система астроцитов сопряжена с метаболизмом GDNF. Дефицит этого нейротрофина при экспериментальном инсульте усиливает состояние окислительного стресса за счет подавления глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. Реактивные астроциты могут нарабатывать GDNF, который стимулирует постишемическую репарацию нервных волокон и является потенциальной стратегией терапии инсульта. Видимо, все микроглиоциты окрашиваются на Iba-1 (Коржевский, Кирик, 2015). Они постепенно заполняют фокус инсульта и с 8-х суток составляют превалирующую популяцию. Микроглиоциты закономерно теряют отростки, накапливают высокое содержание Iba-1, что, в целом, подчеркивает их возросшую подвижность и фагоцитарную активность (Хожай, Отеллин, 2013). Активированная микроглия трансформируются из состояния покоя, характеризующейся разветвленной морфологией в форму амебоидных клеток и активируют поверхностные молекулы, включающие CD14, главный комплекс гистосовместимости и хемокиновые рецепторы. Хотя астроциты выделяют определенные провоспалительные цитокины, микроглия является основным источником цитокинов в поврежденном мозге. Первичные медиаторы включают фактор некроза опухоли, IL-1b и интерферон g, которые приводят к продукции вторичных медиаторов, таких как арахидоновая кислота, NO и матриксные металлопротеиназы (Muresanu et al., 2019). Мы не можем достоверно утверждать наличие тесных взаимосвязей астроцитов и микроглии в наших экспериментах. Однако сопоставление топографии и плотности GFAP, S-100 и Iba-1-иммунореактивных клеток показывает смещение их к границам фокуса инсульта и сужение площади пенумбры. Поскольку фокальный инсульт при постоянной окклюзии питающих сосудов сопровождается длительным окислительным стрессом, это явление возникает как результат истощения протективных механизмов в позднем периоде ишемии. Однако не всегда индукция НТ воспроизводит заметный протективный эффект. Молекулы BDNF- и NT-3 секретируются в виде смеси предшественников и их зрелых форм, имеющих разные рецепторные мишени и функциональную активность. Например, proBDNF специфически активирует сцепленный с сортилином «рецептор смерти» p75NTR и запускает апоптоз, а зрелая форма BDNF регулирует TrkB и репаративные процессы (Sasi et al. 2017). На модели фототромбоза кортикальных сосудов установлено, что proBDNF экспрессируется уже через 6 часов от начала инсульта, а его созревание завершается к концу первых суток. При этом пиковые значения экспрессии p75NTR отмечаются в течение трех суток ишемии (Rahman et al. 2018). Баланс этих влияний остаётся критическим в оценке протективных свойств НТ. Поскольку в нейропиле присутствуют обе их фракции, обнаруженная нами валовая индукция иммунореактивного BDNF может не коррелировать с общим количеством жизнеспособных клеток. Результаты настоящей работы указывают на значимую роль апоптоза в редукции нейронов на протяжении всего ишемического периода. Относительно высокий процент каспаза-3-реактивных клеток позволяет рассматривать этот маркер как значимый параметр оценки распространения нейродеструктивного процесса при постоянной окклюзии сосудов, питающих мозг. На моделях временной ишемии после 50-минутной окклюзии средней мозговой артерии установлено появление фермента уже через 8 часов с пиком активности в конце первых суток после реперфузии. В этой ситуации гиперэкспрессия сохраняется в течение 14 дней (Zille et al. 2012). Однако, чем продолжительнее ишемия, тем короче время индукции каспазы-3 (Chaitanya and Babu 2008). Так, перманентная окклюзия СМА у крыс вызывает селективную индукцию про- апоптотических факторов начиная с 6 часов и с максимумом в конце первых суток после повреждения. При этом каспаза-8 преимущественно выявляется в крупных пирамидных нейронах слоя V, а каспаза-3 только в нейронах слоёв II/III и в микроглии на протяжении всего периода ишемии (Velier et al. 1999). Мы наблюдали двухфазный характер повышенной экспрессии p53 и каспазы-3 в пирамидных нейронах пенумбры на 3 и 21 сутки ишемии. Активация апоптоза на ранних этапах инсульта согласуется с патогенезом глутаматергической эксайтотоксичности и не случайно возбуждение NMDA-рецепторов неизменно стимулирует экспрессию p53 (Poulaki et al. 1999). Установлено, что в острой фазе инсульта гиперстимуляция NMDA-рецепторов в ишемическом ядре вызывает некроз нейронов. Однако в зоне пенумбры апоптотические процессы, индуцированные умеренной активацией NMDA-рецепторов, связаны, главным образом, с окислительным стрессом (Slavoaka et al., 2020). Апоптоз нейронов и глиальных клеток в поздний период ишемии можно рассматривать как адаптивную реакцию в ответ на постишемическую реорганизацию ткани мозга. Внутривенное введение BDNF в первые часы инсульта меняет картину апоптотической гибели нейронов на всех этапах ишемии. При экспериментальном инсульте внутривенное введение BDNF существенно снижает выраженность постишемических неврологических симптомов, связанных с нарушением двигательной и чувствительной функций (Zhang et al. 2018). Установлено активирующее влияние BDNF на экспрессию других ростовых факторов и неоангиогенез (Jiang et al. 2017). Индукция инсульта способствует повышению концентрации BDNF в ткани мозга уже через 4 часа после его внутривенного введения (Ramos-Cejudo et al. 2015). BDNF не только подавляет апоптоз, но также регулирует возбудимость корковых нейронов. В новой коре синтез BDNF осуществляется, в основном, в постсинаптических глутаматергических нейронах и действует через мобилизацию системы фосфоинозитид 3-киназы/протеин киназы B (PI3K/Akt) и протеинкиназы mTOR. Эти киназы являются центральным звеном в регуляции эндогенной цитопротекции при ишемическом инсульте у человека и крыс (Wang et al. 2009). В течение несколько часов после нарушения кровотока нейроны зоны пенумбры быстро увеличивают выработку молекулы Akt (Zhao et al. 2006). Одновременно нейроны способны активно экспрессировать BDNF и эндотелиальные факторы роста. Этот эффект сохраняется до двух недель от начала инсульта (Ishrat et al. 2012). Результаты настоящего исследования соотносятся с известной динамикой активности BDNF при том, что развитие инсульта вызывает неравномерное повреждение нейронов ядра и пенумбры. Мы полагаем, что эти гетерогенные воздействия обусловлены неоднозначным влиянием BDNF на экспрессию p53, Bcl-2 и Mdm-2 в пирамидных и непирамидных нейронах. Выраженность апоптоза зависит от баланса про- и антиапоптотических факторов. Однако сведения о взаимодействии этих молекул при ишемии весьма противоречивы. Так, гиперпродукция Mdm-2 блокирует апоптотическое действие p53, однако при реперфузии большинство Mdm-2-позитивных нейронов подвергается апоптозу в пенумбре через сутки после ишемии (Tu et al. 1998). Возможно, Mdm2 действует лишь при полном отсутствии в клетке p53, либо активирует альтернативный путь апоптоза через выработку фактора транскрипции E2F1 (Martin et al. 1995). Не исключен и третий вариант, при котором смещение эффектов Mdm2 опосредуется секрецией нейротрофинов. Наши данные об активирующем влиянии BDNF на экспрессию Mdm-2 вполне согласуются с этой гипотезой. Таким образом, неоднородная стратификация НТ и их избирательная реакция на ишемическое повреждение определяются их различным участием в поддержании цитопротективных и нейродеструктивных эффектов. При инсульте BDNF выступает как значимый нейропротективный фактор регуляции апоптотической гибели клеток. Воздействие BDNF носит избирательный характер на разные популяции корковых нейронов и может представлять полезную фармакологическую модель в поиске препаратов направленной коррекции ишемических повреждений. ВЫВОДЫ 1. Постоянная окклюзия средней мозговой артерии вызывает закономерное изменение экспрессии нейротрофинов в теменной коре крыс. Иммунолокализация BDNF, NT-3 и GDNF характеризуется топографической гетерогенностью и динамично варьирует по слоям коры в ядре инсульта и пенумбре в разные периоды ишемии. Количественное представительство иммунореактивных клеток указывает на их неоднородную редукцию в условиях экспериментального инсульта. 2.Пространственная плотность клеток, экспрессирующих BDNF и NT-3, демонстрирует в ядре инсульта и пенумбре противоположные топографические тренды:  в ядре инсульта на 1-е и 3-и сутки ишемии характерна значительная редукция иммунореактивных клеток в IV-VI слоях коры, в супрагранулярных слоях их количество остаётся относительно стабильным;  на 8-е сутки ишемии в ядре инсульта нейротрофины в нейронах не выявляются, в пенумбре возникает индукция иммунореактивности, где NT- 3 превалирует в нейронах слоёв II/III, BDNF – в нейронах слоёв II/III и V;  на 21-е сутки ишемии в ядре инсульта BDNF и NT-3 выявляются в ненейрональных элементах, в пенумбре паттерн их распределения соответствует топографии нейротрофинов в интактной коре но при значительно меньшем количестве окрашенных клеток;  топография нейротрофинов в контралатеральном полушарии повторяет характер их локализации в области пенумбры на всех сроках ишемического повреждения. 3. Развитие инсульта сопровождается реверсией распределения GDNF в глиальном и нейрональном пуле коры. GDNF-позитивные нейроны локализуется в слоях II/III и V/VI, их относительное количество в пенумбре составляет 29±2.1% в 1-е сутки, 13.8±0.6% на 8-е сутки и 3.1±0.2% на 21-е сутки инсульта. В астроцитах отмечается обратная тенденция к нарастанию плотности GDNF- иммунореактивной популяции в течение всего ишемического периода. 4. Астроциты, экспрессирующие GFAP и S-100β, локализуются в области пенумбры и определяют ее границы. Плотность GFAP-и S-100β-позитивных астроцитов возрастает на границе с фокусом инсульта и снижается на периферии пенумбры. 5. Ишемическое повреждение вызывает индукцию S-100β в пирамидных нейронах, составляющих 37.3±3.9% в 1-е сутки инсульта и 5.4±0.3% на 14-й день ишемии. В поздние сроки инсульта S-100β в пирамидных клетках не определяется. 6. В фокусе инсульта концентрируется Iba-1-иммунопозитивная микроглия, проявляющая признаки активированных макрофагов. Максимальная плотность микроглии возникает на 8 сутки инсульта и соотносится с понижением количества GFAP-иммунореактивных астроцитов. 7. Локализация проапоптотических факторов является индикатором нейродеструктивного процесса в фокусе ишемии. Доля нейронов, экспрессирующих каспазу-3 и р53 преобладает в зоне пенумбры достигая максимальных значений на 3-и сутки ишемии. 8. BDNF выступает как значимый нейропротективный фактор регуляции апоптоза при ишемическом инсульте. На фоне внутривенного введения BDNF в пенумбре достоверно усиливается экспрессия противоапоптотических молекул Mdm2 и Bcl- 2 и снижается количество р53- и каспаза-3-реактивных нейронов.