Фармакогностическое исследование дуба черешчатого (Quercus robur L.)

Во введении содержится описание актуальности темы представленного исследования, цель, задачи, научная новизна и практическая значимость, основные положения, выносимые на защиту, сведения о публикациях по теме исследования и апробации работы.
Глава 1 представляет собой обзор опубликованных результатов фармакогностических исследований дуба черешчатого (Quercus robur L.) отечественных и иностранных авторов. В главе описаны данные, касающиеся ареала, химического состава, подходов к стандартизации коры дуба черешчатого Также описаны фармакологические свойства сырья и препаратов дуба, применяемых в медицинской практике.
Глава 2 включает описание объектов и методов исследования.
Глава 3 посвящена результатам исследования по морфолого-анатомическому изучению листьев и почек дуба черешчатого с использованием люминесцентного метода. Также в главе приводятся данные сравнительного исследования петиолярной анатомии дуба черешчатого и его близкородственных видов, произрастающих на территории Самарской области.
В главе 4 приведены результаты выделения индивидуальных соединений из листьев дуба черешчатого, данные по их химическому строению и структуре.
Глава 5 посвящена разработке методик качественного и количественного анализа листьев и почек дуба черешчатого с использованием ТСХ и УФ-спектрофотометрии. В главе также приводятся результаты исследования экстракционного препарата настойки листьев дуба и индивидуальных веществ методом ВЭЖХ анализа. Приведены результаты исследования по определению динамики накопления (биоаккумуляции) суммы флавоноидов в листьях дуба черешчатого. Приведены рекомендуемые числовые показатели сырья, включенные в проект ФС на новый вид ЛРС «Дуба черешчатого листья».
Глава 6 содержит результаты скринингового исследования антимикробной активности водно- спиртовых извлечений и спиртовых настоек листьев, почек и коры дуба черешчатого, предварительные результаты исследования диуретической активности астрагалина, а также результаты изучения острой токсичности спиртовой настойки листьев дуба черешчатого.
Диссертационная работа завершается выводами, заключением, практическими рекомендациями, описанием перспектив дальнейших исследований и списком литературы.
В приложениях к диссертации приведены акты внедрения (Приложение No 1); патенты РФ: «Способ количественного определения суммы флавоноидов в листьях дуба черешчатого» (No 2751189, заявка No 2020133909; дата регистрации 12.07.2021); приоритетная справка на изобретение РФ «Способ количественного определения суммы флавоноидов в почках дуба черешчатого» (заявка No 2021131121; дата поступления 25.10.2021; W21066025); приоритетная справка на изобретение РФ «Способ получения настойки листьев дуба черешчатого, обладающей антимикробной активностью» (заявка No 2021131123; дата поступления 25.10.2021; W21066027) (см. Приложения No 2). В приложении к диссертации приведена сравнительная таблица исследования морфологических признаков листьев рода Quercus (Приложение No 3); данные по фитохимическому исследованию листьев перспективных видов рода Quercus (Приложение No 4); таблицы результатов изучения антимикробной активности ЛРС дуба черешчатого (Приложение No 5). В приложении No 6 представлены проекты ФС на новые виды ЛРС «Дуба черешчатого листья» и «Дуба черешчатого почки», гербарные образцы видов дуба, сырье которых было использовано в процессе выполнения диссертационного исследования.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования
Объектами диссертационной работы являлись образцы листьев дуба черешчатого (Quercus robur L.), дуба скального – Q. petraea Liebl.; дуба красного – Q. rubra L.; дуба летнего фастигиата – Q. robur var. fastigiata (Lam.) Spach.; дуба монгольского – Q. mongolica Fisch. ex Ledeb.; дуба крупноплодного – Q. macrocarpa Michaux и дуба Мюлленберга – Q. Muehlenbergii Engelmann, культивируемые на территории Самарской области. Образцы сырья заготавливались с 2019 по 2021 гг.
В рамках диссертационной работы исследовались: водно-спиртовые извлечения листьев, коры и почек дуба черешчатого, образцы экстракционных препаратов (настоек) листьев, коры и почек дуба черешчатого в соотношении «сырье-экстрагент» – «1:5» на 40%, 70% и 96% этиловом спирте, а также индивидуальные вещества: астрагалин (3-О-β-D-глюкопиранозид 3,5,7,4′-тетрагидроксифлавона);
афзелин (3-О-α-L-рамнопиранозид 3,5,7,4′-тетрагидроксифлавона); рамнопиранозид 3,5,7,3′,4′-пентагидроксифлавона); изокверцитрин 3,5,7,31,4′-пентагидроксифлавона); 3-О-α-L-рамнопиранозид
кверцитрин (3-О-α-L- (3-О-β-D-глюкопиранозид 3,5,7,4′-тетрагидрокси-3′,-
метоксифлавона; 3-О-β-D-глюкопиранозид 3,5,7,4′-тетрагидрокси-3′,-метоксифлавона; рамноза; рутин; кверцетин; цинарозид; кемпферол; танин; галловая кислота; катехин.
Морфолого-анатомическое исследование осуществлялось с применением цифровых микроскопов марки «Motic DM-1802», «Motic DM-39C-N9GO-A» и «ZEISS ZEN 2» (лицензионное программное обеспечение ZEISS Software Licensing | V1.0 en 04 / 2018» с увеличениями x40, x100, x400, а также люминесцентного микроскопа марки «Альтами» «ЛЮМ-2» с использованием голубого (330-400 нм) и желтого (420-550 нм) светофильтров. Оцифровка результатов микроскопического анализа и определение размерности гистологических элементов проводились с помощью программного обеспечения «Motic Images Plus 2.0 ML» (PC&Mac) 1301100100224/001 20111017; DM1 102-10250-00-09820.
Изучение химического состава листьев дуба черешчатого проводили методом адсорбционной колоночной хроматографии с использованием силикагеля марки L 40/100 мкм и L 100/250 мкм (Чехия) и полиамида (Woelm Pharma, Германия). Для исследования методом ТСХ извлечений из изучаемого сырья, выделенных веществ и разработанных ЛРП использовали пластинки марки «Sorbfil ПТСХ-АФ-А-УФ» и «ПТСХ-П-А-УФ» (Россия). Хроматографический анализ осуществляли методом обращенно-фазовой ВЭЖХ на микроколоночном жидкостном хроматографе «Милихром-6» (НПАО «Научприбор») в градиентном режиме при использовании стальной колонки «КАХ-6-80-4» (No2; 2 мм х80 мм; Сепарон-C18 7 мкм). Спектрофотометрическое исследование извлечений из сырья и разработанных препаратов проводили на спектрофотометрах «Specord 40» (Analytik Jena) и «СФ- 2000» в кюветах с толщиной слоя 10 мм в диапазоне длин волн от 190 нм до 700 нм. Спектры 1Н- ЯМР получали на приборе «Bruker AM 300», спектры 13С-ЯМР – на приборе «Bruker DRX 500», регистрацию масс-спектров электронного удара проводили электроструйной ионизацией на приборе «MicrOTOF» спектрометре при энергии ионизирующих электронов 70 эВ и колебании температурного режима ионного источника от 100 до 250 °С.
Образцы настоек изучаемых видов сырья дуба черешчатого получали методом дробной перколяции на 70% спирте этиловом в соотношении «сырье-экстрагент» 1:5.
С использованием фармакологических методов анализа проводилось изучение влияния выделенного нами из листьев дуба черешчатого вещества астрагалина на выделительную функцию почек. Также проводилось исследование острой токсичности разработанного ЛРП настойки листьев дуба черешчатого. Для определения антимикробного действия извлечений из изучаемого вида сырья использовался метод двойных серийных разведений (пробирочный, макрометод) на питательном бульоне Мюллера-Хинтона (Bio-Rad, США) с использованием штаммов Американской коллекции типовых культур: Staphylococcus aureus (АТСС 29213), Escherichia coli (АТСС 25922), Pseudomonas aeruginosa (АТСС 27853), а также Candida albicans (клинический штамм).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Морфолого-анатомическое исследование листьев дуба черешчатого
Дополнены и определены основные диагностически значимые признаки нового вида ЛРС «Дуб черешчатого листья», которые заключаются в следующем:
1) Наличие устьиц аномоцитного типа на нижней стороне листа с характерной люминесценцией: при λ=420 нм – устьица желтые по окружности и зеленовато-желтые внутри; при
λ=360 нм края устьиц розовые (характерно для СО рутина), в центре – голубовато-зеленые, что характерно для веществ кемферола и кверцетина (рис. 1 и 2);
2) Опушение эпидермиса и жилки нижней стороны листа одиночными простыми и ветвистыми волосками с гладкой поверхностью (длина до 100 мкм) (рис. 1А). Кроме того, присутствуют трихомы, головка которых светится желто-оранжевым светом при λ=420 нм и розово-красным светом при λ=360 нм (рис. 1В), что характерно для веществ астрагалина, рутина и кверцитрина (рис. 2)
3) Листовая пластинка дорсовентрального типа. Эпидемис листа на поперечном срезе люминесцирует желто-оранжевым светом при λ=420 нм и розово-красным при λ=360 нм (характерно для рутина) (рис. 1З, 1И);
4) Основной объем жилки занимает проводящая система, представленная в виде 3-х закрытых крупных блоков плотно сомкнутых коллатеральных пучков, отмеченных на рисунке 1Ж штрих- пунктиром (рис. 1Ж). В абаксиальной части присутствует блок коленхимы (свечение при λ=420 нм – желто-зеленое, при λ=360 нм – голубоватое), в адаксиальной части заметно развит блок склеренхимы (свечение при λ=420 нм – яркое желто-зеленое, при λ=360 нм – яркое голубоватое, что характерно для дубильных веществ) (рис. 1Ж);
5) При проведении гистохимических реакций микропрепаратов отмечается их лигнификация при ярко-желтом окрашивании тканей проводящей системы и склеренхимы (реакция с сернокислым анилином) (рис. 1Н). Отмечается окрашивание липофильных клеток кутикулы и механического пояса в оранжево-красный цвет (реакция с 5% раствором Судана III) (рис. 1М). В центре поперечного среза наблюдается темно-синее окрашивание содержимого клеток (реакция с раствором Люголя) (рис. 1О). На поперечных срезах в клетках эпидермиса и проводящей системы присутствуют друзы неправильной формы. Клетки ксилемы и блока склеренхимы светятся ярко-зеленым цветом при λ=420 нм и ярко-голубым при λ=360 нм, что характерно для дубильных веществ (галловая кислота) (рис. 1З, 1И).
Рисунок 1 – Диагностичные признаки листьев дуба черешчатого. А – эпидермис нижней стороны листа (×100); Б, В – люминесценция эпидермиса нижней стороны при λ=420 и λ=360 нм
соответственно (×400); Г, Д, Е – устьица нижней стороны листа: без облучения, при λ=420 и при λ=360 нм соответственно (×400); Ж, З, И – поперечный срез медиальной части: без облучения, при облучении λ=420 и при λ=360 нм соответственно (×100); К, Л – проводящая система на поперечном срезе при λ=420 и λ=360 нм соответственно (×400); М – фрагмент поперечного сечения после окраски 0,5 % раствором Судана III (×400); Н – фрагмент поперечного сечения после окраски 10 % раствором сернокислого анилина (×400); О – окраска раствором Люголя, поперечный срез (×400).

Обозначения: 1 – трихома; 2 – устьице; 3 – одноклеточный волосок; 4 – друзы; 5 – монокристаллы.
Рисунок 2 – Сравнительная люминесценция стандартных образцов, используемых в морфолого-анатомическом анализе. Обозначения: А – СО галловой кислоты; Б – СО рутина; В – СО кемпферола; Г – СО кверцитрина; Д – СО кверцетина; Е – астрагалин.
Сравнительный анализ петиолярной анатомии листьев дуба черешчатого и его некоторых близкородственных видов наглядно показал четкие различия в очертаниях поперечных срезов черешков (в абаксиальной и адаксиальной частях), опушении и строении проводящей системы, имеющих видовую специфичность. Что позволяет использовать метод петиолярной диагностики для целей при установлении подлинности сырья. Результаты сравнения петиолярной анатомии близкородственных видов рода Quercus представлены в таблице 1 (табл. 1).
Таблица 1 – Сравнительная петиолярная анатомия поперечных срезов листовых пластинок Quercus robur L. и некоторых представителей рода Quercus L.
Фрагмент Название вида
среза Q. robur Quercus petraea Q. fastigiata Q. Muehlenbergii
Базальная часть
Медиальная часть
Апикальная часть
2. Фитохимическое исследование листьев дуба черешчатого
В ходе исследования химического состава листьев дуба черешчатого методом адсорбционной жидкостной колоночной хроматографии впервые из листьев дуба черешчатого выделены и идентифицированы вещества 3-О-α-L-рамнопиранозид 3,5,7,4′-тетрагидрокси-3′,-метоксифлавона и рамноза. Впервые в РФ из листьев дуба черешчатого выделены флавоноиды: астрагалин; афзелин; кверцитрин; изокверцитрин (3-О-β-D-глюкопиранозид 3,5,7,31,4′-пентагидроксифлавона) и 3-О-β-D-

15
глюкопиранозид 3,5,7,4′-тетра гидрокси-3′,-метоксифлавона (табл. 2). Идентификация выделенных веществ проводилась с использованием методов ТСХ-, УФ-спектрофотометрии, 1Н-ЯМР-, 13С-ЯМР- спектроскопии, а также масс-спектрометрии (табл. 2). Масс-спектры наиболее значимого вещества для листьев дуба черешчатого астрагалина и его агликона представлены на рисунке 3.
Таблица 2 – Характеристики веществ, выделенных из листьев дуба черешчатого методом колоночной хроматографии
No Название соединения, Масс- Структурная формула Описание п/п брутто-формула спектр, m/ƶ вещества
1.
Астрагалин (3-О-β-D- глюкопи- ранозид 3,5,7,4′- тетрагидрокси флавона) (С21Н20О11)
471.0898 [M+Na]+
Кристаллическое вещество светло- желтого цвета
2.
Афзелин (3-О-α-L- рамнопиранозид 3,5,7,4′-тетра гидроксифлавона) (С21Н20О10)
309.0370 [M+Na]+
Кристаллическое вещество светло- желтого цвета
3.
Кверцитрин (3-О-α-L- рамнопиранозид 3,5,7,3′,4′- пентагидроксифлавона) (С21Н20О12)
471.0897 [M+Na]+
Кристаллическое вещество светло- желтого цвета
4.
Изокверцитрин (3-О-β-D- глюкопиранозид 3,5,7,3′,4′- пентагидроксифлавона) (С21Н20О12)
501.0003 [M+К]+
Кристаллическое вещество светло- желтого цвета
5.
3-О-α-L-рамнопиранозид 3,5,7,4′-тетрагидрокси-3′, -метоксифлавона (С22Н20О11)
501.0006 [M+Na]+
Аморфное вещество светло- желтого цвета
6.
3-О-β-D-глюкопиранозид 3,5,7,4′-тетрагидрокси-3′, – метоксифлавона (С22Н22О12)
501.0006 [M+Na]+
Кристаллическое вещество светло- желтого цвета
7.
Рамноза (С6Н10О5)
187.0557 [M+Na]+
Призматические кристаллы белого цвета

Для идентификации агликонов проводился кислотный гидролиз флавоноидных гликозидов в присутствии 2 % HCl на кипящей водяной бане в течение 2 часов. После проведения кислотного гидролиз отмечается сдвиг хроматографических зон для анализируемых веществ с Rf = 0,66 до Rf = 0,54. Наличие D-глюкозы в структуре астрагалина и L-рамнозы в структурах афзелина и кверцитрина подтверждали методом бумажной хроматографии.
Рисунок 3 – Масс-спектр астрагалина (А) и агликона астрагалина (Б)
Таким образом, проведено исследование химического состава листьев дуба черешчатого методом адсорбционной колоночной хроматографии, в ходе которого выделены 7 веществ, а также установлена их структура.
3. Разработка методик качественного и количественного анализа листьев дуба черешчатого
Результаты фитохимического изучения листьев дуба черешчатого использовались при разработке методик качественного и количественного анализа сырья данного растения.
3.1. Качественный анализ листьев рода Quercus методом тонкослойной хроматографии Экспериментально подобраны условия проведения ТСХ-анализа водно-спиртовых извлечений и экстракционного препарата настойки листьев дуба черешчатого, которые заключаются в использовании хроматографической системы «трихлорметан : спирт этиловый : вода» в соотношении 25:18:2. При просмотре в УФ-свете при длине волны 366 нм и после проявления раствором диазобензолсульфокислотой (ДСК) вещество астрагалин детектируется в виде зоны адсорбции Rf
около 0,66 (астрагалин) и СО рутина в виде зоны адсорбции Rf около 0,54 (рис. 4).
В связи с отсутствием СО астрагалина нами предложено использовать для целей стандартизации СО рутина, как вещества, близкого к астрагалину по структуре и спектральным характеристикам. По этой причине нами предложен показатель Rst, который равен отношению коэффициента удерживания (Rf) астрагалина в настойке листьев дуба к коэффициенту удерживания
рутина (Rf) равный ⁓ 1,22 (рис. 4).

Рисунок 4 – Хроматографические профили растворов извлечений листьев представителей рода Quercus на 70% спирте этиловом в системе растворителей «трихлорметан : спирт
этиловый : вода» в соотношении 25:18:2: А – детектирование в УФ-свете при λ=366 нм; Б – детектирование в УФ-свете при λ=254 нм; В – обработка раствором ДСК.
Обозначения: 1 – Q. robur L.; 2 – Q. robur fastigiata; 3 – Q. petraea Liebl.; 4 – Q. rubra L.;
5 – Q. Muehlenbergii Engelmann; 6 – Q. mongolica Fisch. ex Ledeb.; 7 – Q. macrocarpa Michaux; 8 – СО рутина; 9 – астрагалин.
3.2. Качественный анализ настойки листьев дуба черешчатого методом ВЭЖХ
Сравнение значений времени удерживания пиков веществ на ВЭЖХ-хроматограмме извлечения листьев дуба черешчатого и времени удерживания пиков индивидуальных веществ позволило идентифицировать в извлечении рутин, изокверцитрин, кверцитрин, астрагалин, афзелин, кверцетин и кемпферол, выделенных ранее методом колоночной хроматографии. Результаты исследования флавоноидного состава, полученные с использованием метода ВЭЖХ, позволяют рекомендовать данный метод с целью подтверждения подлинности листьев дуба черешчатого (рис. 5 и 6). В качестве подвижной фазы использовалась система «ацетонитрил : вода» в градиентном режиме с использованием следующих соотношений: 25-75 (1000 мкл), 4-6 (600 мкл), 6-4 (800 мкл) с добавлением 1 % ледяной уксусной кислоты от объема воды. Присутствие перечисленных веществ подтверждалось путем их добавок к настойке с последующим ВЭЖХ-анализом при аналогичных условиях (рис. 5). ВЭЖХ-хроматограмма астрагалина представлена на рисунке 6.
Рисунок 5 – ВЭЖХ-хроматограмма настойки листьев дуба черешчатого. Обозначения: 1 – СО рутина; 2 – СО изокверцитрина; 3 – СО кверцитрина; 4 – астрагалин; 5 – СО афзелина;
Рисунок 6 – ВЭЖХ-хроматограмма астрагалина.
Обозначения: 1 – индивидуальное вещество астрагалин.
6 – СО кверцетина; 7 – СО кемпферола.
3.3. Качественный анализ листьев дуба черешчатого методом УФ-спектроскопии
При изучении электронных спектров водно-спиртового извлечения листьев дуба черешчатого обнаруживаются характерные для флавоноидов, в частности флавонолов, 2 максимума поглощения: коротковолновый при длине волны 265±2 нм и длинноволновый при 350±2 нм (рис. 7-1).
Рисунок 7 – Электронные спектры растворов водно-спиртового извлечения из листьев дуба черешчатого. Обозначения: 1 – электронный спектр извлечения (прямая спектрофотометрия); 2 – электронный спектр извлечения с добавлением +AlCl3; 3 – дифференциальный спектр извлечения.
Рисунок 8 – Электронные спектры поглощения водно-спиртового раствора рутина. Обозначения: 1 – электронный спектр СО рутина (прямая спектрофотометрия); 2 – электронный спектр СО рутина с +AlCl3; 3 – дифференциальный спектр СО рутина.
В присутствии AlCl3 наблюдается батохромный сдвиг длинноволновой полосы в области 270 и 395 нм, что подтверждает флавоноидную природу веществ в водно-спиртовом извлечении листьев дуба черешчатого (рис. 7-2). В дифференциальном варианте электронного спектра характерны два максимума поглощения при аналитических длинах волн 276 и 412 нм (рис. 7 и 8). Отмечается схожее строение профиля электронных спектров извлечения листьев дуба черешчатого с профилем электронных спектров СО рутина (рис. 8). Исходя из этого, в дальнейшем, для проведения стандартизации листьев дуба черешчатого предлагается использовать СО рутина и проводить пересчет на данное вещество при аналитической длине волны 412 нм (дифференциальный вариант) (рис. 8).
3.4. Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в листьях дуба черешчатого
В результате проведенного эксперимента определены оптимальные параметры экстракции БАВ из листьев дуба черешчатого: экстрагент – 80 % этанол; соотношение «сырьё-экстрагент» – 1:50; время экстракции – 30 мин; степень измельчения – 2 мм. В результате разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в листьях дуба черешчатого с использованием метода дифференциальной УФ-спектрофотометрии при аналитической длине волны 412 нм в пересчете на СО рутина. Использование предложенных условий в методике обосновано тем, что при добавлении к водно-спиртовому извлечению раствора AlCl3 наблюдается батохромный сдвиг длинноволновой полосы флавоноидов с максимумом поглощения в дифференциальном варианте при длине волны 412 нм, что соответствует максимуму спиртового раствора рутина (рис. 7 и 8).
Методика количественного определения суммы флавоноидов в листьях дуба черешчатого.
Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 80 % этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарированных весах с точностью до ±0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 30 мин. Затем колбу охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (красная полоса).
Испытуемый раствор готовят следующим образом: 2 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 1 мл 3 % спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96 % (испытуемый раствор А). Измеряют оптическую плотность испытуемого раствора на спектрофотометре при длине волны 412 нм через 40 минут после приготовления. В качестве раствора сравнения используют раствор, полученный следующим образом: 2 мл извлечения (1:50) помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора спиртом этиловым 96 % до метки.
Приготовление раствора СО рутина. Около 0,0207 г (точная навеска) рутина помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 30 мл 70 % этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимого колбы до комнатной температуры доводят объем раствора 70 % этиловым спиртом до метки (раствор А рутина). 1 мл раствора А рутина помещают в мерную колбу на 25 мл, прибавляют 1 мл 3 % спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96 % (испытуемый раствор Б рутина). Измеряют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре при длине волны 412 нм. В качестве раствора сравнения используют раствор, который готовят следующим образом: 1 мл раствора А рутина помещают в мерную колбу на 25 мл и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96 % (раствор сравнения Б рутина).
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:
,
где A – оптическая плотность испытуемого раствора; Ao – оптическая плотность раствора СО рутина; m – масса сырья, г; mо – масса СО рутина, г; W – потеря в массе при высушивании в процентах. Значение удельного показателя поглощения – 240.
Метрологическая оценка результатов эксперимента проводилась в соответствии с требованиями ГФ РФ «ОФС.1.1.0013.15». Результаты метрологической оценки методики представлены в таблице 3. Ошибка единичного определения суммы флавоноидов в листьях дуба черешчатого с доверительной вероятностью 95 % составляет ±0,32 % (табл. 3).
Таблица 3 – Метрологическая оценка методики количественного определения суммы флавоноидов в листьях дуба черешчатого Quercus robur L.
Noп/п 1 2 3 4 5 6 7 8

Показатели метрологической оценки
f
S2
S
P, %
t (P, f)
±x
ε, %
Извлечения из листьев дуба
10 1,63 0,000307 0,017529 95 2,113 0,005285 0,32
Валидационная оценка разработанной методики проводилась в соответствии с ГФ РФ ОФС.1.1.0012.15 по показателям: специфичность, линейность, правильность. Специфичность методики определялась по соответствию максимумов поглощения комплекса флавоноидов листьев дуба черешчатого и СО рутина с алюминием хлоридом. Линейность методики определяли для серии растворов рутина (с концентрациями в диапазоне от 0,00880 до 0,03520 мг/мл). Коэффициент корреляции составил 0,98953. Правильность методики определяли методом добавок путем добавления раствора рутина с известной концентрацией (25 %, 50 % и 75 %) к испытуемому раствору. При этом средний процент восстановления составил 98 %.
Таким образом, листья дуба черешчатого являются перспективным источником БАВ, с содержанием суммы флавоноидов 1,63 % (нижний предел содержания – не менее 0,30 %).
В виду сходства электронных спектров поглощения водно-спиртового извлечения листьев дуба черешчатого и вещества астрагалина допускается также проводить количественное определение суммы флавоноидов в листьях дуба черешчатого в пересчете на астрагалин (при наличии его СО) при аналитической длине волны 406 нм (значение удельного показателя поглощения астрагалина равно 300).
3.5. Определение динамики накопления суммы флавоноидов в листьях дуба черешчатого
Результаты анализа содержания суммы флавоноидов в листьях дуба черешчатого, заготовленных в период с мая по сентябрь 2019-2021 гг., показывают, что максимальное содержание флавоноидов в листьях дуба черешчатого приходится на период «конец мая-начало июня». Таким образом, оптимальным временем сбора листьев дуба черешчатого является конец мая-начало июня, в период их распускания.
3.6. Числовые показатели для нового вида ЛРС «Дуба черешчатого листья»
На основании полученных данных для листьев дуба черешчатого в соответствии с методиками, описанными в ГФ РФ XIV издания были определены следующие показатели качества сырья: влажность – не более 9%, содержание золы общей не более 10 %, золы, нерастворимой в хлористоводородной кислоте не более 3 %, содержание частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 1 мм – не более 5 %. Содержание экстрактивных веществ, извлекаемых 70% спиртом этиловым, в листьях дуба черешчатого составляло – не менее 35 %, содержание суммы флавоноидов не менее 0,30 %, дубильных веществ – не менее 2 %. В результате проведенных исследований числовые показатели были рекомендованы в проект ФС для нового вида ЛРС «Дуба черешчатого листья».
4. Обоснование способа получения и методик стандартизации ЛРП «Дуба черешчатого листьев настойка»
Обоснованы подходы к анализу препарата настойки листьев дуба черешчатого, полученной на 70 % спирте этиловом методом дробной перколяции в соотношении «1:5». Содержание суммы
флавоноидов методом дифференциальной спектрофотомерии в полученной настойке на 70 % спирте этиловом в пересчете на СО рутина составило 0,24±0,003 %, в пересчете на астрагалин – 0,33±0,003 %. В результате исследования антимикробной активности настойки в отношении штаммов микроорганизмов S. aureus, E. coli, P. aeruginosa, C. albicans, установлено подавление роста исследуемых штаммов. В частности, при разведении в 16 раз задерживается рост штамма P.aeruginosa и штамма S. aureus, при разведении в 32 раза – задержка роста E.coli и при разведении в 64 раза – C. albicans. Учитывая полученные результаты, предлагается новый антимикробный препарат «Дуба черешчатого листьев настойка».
В результате исследования диуретической активности было подтверждено наличие выраженного креатининуретического действия для вещества астрагалина, выделенного из листьев дуба черешчатого.
На основании результатов проведенных исследований по изучению острой токсичности препарат «Дуба черешчатого листьев настойка» был отнесен к IV классу токсичности – малоопасные вещества (ГОСТ 12.1.007-76).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, в процессе выполнения научно-исследовательской работы в рамках заявленной темы были получены следующие результаты:
1. В ходе морфолого-анатомического исследования выявлены диагностические признаки перспективных видов сырья Quercus robur L.:
– для листьев дуба черешчатого характерно: опушение эпидермиса и жилки нижней стороны листа простыми одноклеточными волосками и железистыми трихомами с характерной розово-красной люминесценцией (при λ=360 нм). В жилках листа содержатся кристаллические включения в виде друз и монокристаллов. В зоне проводящей системы листа (ксилеме) локализованы вещества флавоноидной природы (астрагалин, кверцитрин и рутин). Дубильные вещества локализованы в механической ткани (склеренхима) и клетках эпидермиса.
– для близкородственных видов рода Quercus выявлены особенности петиолярной анатомии, которые заключаются в отличии очертаний поперечных срезов в базальной, медиальной и апикальной частях, а также в характере опушения эпидермиса;
– для почек дуба черешчатого отмечены особенности в расположении крупных фрагментов соцветий и примордиев (V -образное), характере кроющих чешуй («сложенное»), в опушении эпидермиса одноклеточными простыми кроющими волосками и трихомами, а также в характере структуры проводящей системы.
2. Впервые из листьев дуба черешчатого методом адсорбционной колоночной хроматографии выделены и идентифицированы вещества 3-О-α-L-рамнопиранозид 3,5,7,4′-тетрагидрокси-3′,- метоксифлавона и рамноза. Впервые в РФ из листьев дуба черешчатого выделены флавоноиды – астрагалин, афзелин, кверцитрин, изокверцитрин и 3-О-β-D-глюкопиранозид 3,5,7,4′-тетрагидрокси- 3′,-метоксифлавон. Выделенные вещества идентифицированы методами ТСХ-, УФ- спектрофотометрии, 1Н-ЯМР-, 13С-ЯМР-спектроскопии, а также масс-спектрометрии.
3. Предложено для определения подлинности листьев дуба черешчатого использовать метод ТСХ (система «трихлорметан : этиловый спирт : вода» 25:18:2) в присутствии СО рутина (Rf = 0,54) и диагностически значимого компонента астрагалина (Rf = 0,66). Предлагается также использовать метод УФ-спектроскопии (в электронном спектре поглощения водно-спиртового извлечения в
дифференциальном варианте имеется два максимума: при длине волны 320±2 нм и 406±2 нм) с использованием СО рутина. Кроме того, разработаны методики анализа нового антимикробного препарата «Дуба черешчатого листьев настойка» методами TCХ, ВЭЖХ- и УФ-спектрофотометрии. В процессе качественного анализа настойки листьев дуба черешчатого методом ВЭЖХ подтверждено наличие 7 веществ: рутина, изокверцитрина, кверцитрина, астрагалина, афзелина, кверцетина и кемпферола.
4. Разработана и научно обоснована методика количественного определения суммы флавоноидов в листьях Quercus robur L. спектрофотометрическим методом с использованием СО рутина. Содержание суммы флавоноидов находится в пределах от 0,30 % до 1,63 % (аналитическая длина волны 412 нм).
Разработана и научно обоснована методика количественного определения суммы флавоноидов в почках Quercus robur L. спектрофотометрическим методом с использованием СО цинарозида. Содержание флавоноидов находится в пределах от 0,27 % до 0,44 % (аналитическая длина волны 400 нм).
5. Обнаружена антимикробная активность в условиях in vitro для водно-спиртовых извлечений и экстракционных препаратов (настоек) на основе коры, листьев и почек дуба черешчатого. Для настойки листьев дуба черешчатого отмечается максимальная задержка роста микроорганизмов E. coli, C. аlbicans при разведении в 32 и 64 раза соответственно; в отношении P. aeruginosa, S. aureus при разведении в 16 раз. Учитывая полученные результаты, и, исходя из данных о содержании суммы флавоноидов, обоснована целесообразность использования растительного экстракционного препарата «Дуба черешчатого листьев настойка».
6. Проведено исследование диуретической активности вещества астрагалина, для которого обнаружено и подтверждено креатининуретическое действие; результаты исследования острой токсичности «Дуба черешчатого листьев настойка» (экстрагент – 70 % этанол), подтверждают безопасность использования препарата в медицинской практике.
7. Регламентированы показатели качества для листьев Quercus robur L. Предложен нижний предел содержания суммы флавоноидов в пересчете на рутин – не менее 0,30 %, дубильных веществ не менее 2 %; экстрактивных веществ, извлекаемых спиртом 70 % не менее 35 %; влажность не более 9 %. На основе полученных данных разработан проект ФС на новый вид ЛРС – «Дуба черешчатого листья».
Практические рекомендации. Результаты диссертационной работы будут способствовать совершенствованию подходов к стандартизации ЛРС, содержащего флавоноиды, и могут быть использованы в учебном процессе по дисциплинам «Фармакогнозия» и «Фармацевтическая химия», а также в организациях и предприятиях, специализирующихся в области создания, стандартизации, сертификации и контроля качества лекарственных средств.
Перспективы дальнейшей разработки темы. Проведение диссертационного исследования имеет научно-практическое значение для фармакогнозии и фармацевтической химии с целью дальнейшего изучения химического состава растений, содержащих флавоноиды, а также для разработки методик анализа и стандартизации ЛРС дуба черешчатого, которые отвечают современным фармакопейным требованиям. В рамках дальнейшего изучения, важное значение имеет научное обоснование комплексного использования ЛРС дуба черешчатого в медицинской и фармацевтической практике с применением современных методов анализа, а также изучение фармакологического действия растительного сырья представителей рода Quercus L.