Фенотипическая и молекулярно-генетическая изменчивость популяции на примере восточной прыткой ящерицы Lacerta agilis exigua

Актуальность темы исследования. В последнее время из-за
увеличения антропогенного воздействия происходят изменения и
сокращение естественных ареалов многих видов животных, а вызванное
человеком уменьшение биоразнообразия растет и затрагивает всю планету
(Barnosky et al., 2011; Ceballos et al., 2020; Almond et al., 2020; Wake,
Vredenburg, 2008). По различным оценкам современные темпы вымирания
видов на два-три порядка выше, чем “фоновые” (Ceballos et al., 2015).
Ограниченные ресурсы охраны природы делают первостепенной задачей
определение ключевых областей биоразнообразия и потенциальных угроз
для них, что особенно важно для ресурсных и редких видов животных (Brum
et al., 2017; Pollock et al., 2017; Roll et al., 2017; Kier et al., 2009; Orme et al.,
2005; Kunin, Gaston, 2012). В связи с этим изучение характеристик такого
широко распространенного вида как прыткая ящерица, позволяющих
объективно отражать и прогнозировать состояние её популяций,
представляется актуальным.
В связи с высокой численностью и плотностью популяций, прыткая
ящерица является популярным объектом различных исследований (Roitberg
et al., 2015; Ljungström et al., 2015). Прыткая ящерица занимает существенное
место в трофических цепях как хищник и объект питания рептилий, птиц и
млекопитающих (Казьмин и др., 2018; Вилкина и др., 2000; Пекло,
Очаповский, 2013), а также как промежуточный и постоянный хозяин многих
видов паразитов (Шарпило, 1976; Шималов, 2010), поддерживающий
природные очаги трансмиссивных заболеваний (Bauwens et al., 1983;
Majlathova et al., 2008). Таким образом, прыткая ящерица является важным
узлом трофических цепей, взаимоотношений «паразит – хозяин», а также
одним из видов, формирующих биоразнообразие занимаемых биотопов.
Структуру и состояние популяций животных описывают с помощью
фенотипических характеристик, однако их оценка из-за высокого уровня
вариабельности приводит к противоречивым данным. В этой связи более
надёжным методом контроля состояния популяции и её динамики может
быть комплексный анализ фенотипических и молекулярно-генетических
признаков (Kozak et al., 2011). Ещё одной характеристикой, отражающей
состояние популяции, может быть соотношение полов и половая
дифференциация, изменчивость которых в зависимости от факторов среды
широко известна (Геодакян, 2000; Артамонова и др., 2021).
Традиционным методом оценки состояния популяций прыткой
ящерицы является анализ морфометрических параметров, характеристик
щиткования и окраски. Несмотря на большое количество соответствующих
исследований (Прыткая ящерица, 1976; Сухов, 1948; Терентьев, Чернов,
1949; Калябина-Хауф, Ананьева, 2004; Корнейчук, Чирикова, 2005; Песков и
др., 2010; Малюк, 2014; Eplanova, Roitberg, 2015; Больных, Жигилева, 2015;
Кукушкин и др., 2020), многие аспекты фенотипической изменчивости,
например, выраженность половых отличий, остаются дискуссионными.
В качестве дополнительного показателя состояния популяции могут
быть использованы характеристики геномной нестабильности, которая у
самцов ряда видов животных выше, чем у самок (Olsson et al., 2010; Дробот,
Ремизова, 2012; Симонян и др., 2015; Rebecca L. Watson et al, 2017; Kathleen
et al., 2018; Nicky Rollings et al, 2019). Повышенная смертность
новорожденных самцов по сравнению с самками является крайним
следствием влияния неблагоприятных факторов среды, в то же время
некоторые другие геномные характеристики, такие как высокополиморфные
геномные элементы (микросателлиты и ретротранспозоны), могут
объективно отражать действие факторов меньшей интенсивности.
Цель и задачи. Целью работы было изучение фенотипической и
молекулярно – генетической изменчивости восточной прыткой ящерицы
Lacerta agilis exigua, как модельного вида, для оценки состояния ее
популяций в разных локалитетах.
Исходя из поставленной цели, нами решались следующие задачи:
1. оценить встречаемость прыткой ящерицы в рационе птиц;
2. оценить фенотипическое разнообразие ящериц различных
локалитетов;
3. для оценки молекулярно-генетической изменчивости провести
сравнительный анализ полиморфизма фрагментов ДНК, фланкированных
инвертированными повторами микросателлитов и длинными концевыми
повторами эндогенных ретровирусов, оценить зависимость полиморфизма
ДНК-маркеров от локализации в геноме;
4. выбрать из полученных данных по ДНК маркерам наиболее
информативные для выявления межпопуляционных, межполовых и
индивидуальных отличий у исследованных групп ящериц;
5. для оценки состояния популяции сравнить выраженность
полового диморфизма ящериц по фенотипическим признакам и генетическим
дистанциям по ДНК маркерам в зависимости от условий локалитета.
Научная новизна. Обнаружены половые отличия по популяционно-
генетической дифференциации восточной прыткой ящерицы в различных
локалитетах, описано присутствие участков гомологии в геноме восточной
прыткой ящерицы к длинным концевым повторам эндогенных ретровирусов
Sabrina и SIRE-1. Обнаружено, что характеристикой состояния популяции
может быть не только численное соотношение самок и самцов, но и
индивидуальное разнообразие самцов по сравнению с самками по различным
характеристикам. Впервые выявлены высоко полиморфные ДНК маркеры,
позволяющие получать наиболее информативные по количеству локусов и
полиморфизму спектры, необходимые для описания генетических структур и
их динамики у восточной прыткой ящерицы с высоким разрешением, а также
совпадающие внутри- и межпопуляционные отличия по отдельным
фенотипическим признакам и спектрам ДНК-маркёров.
Практическая значимость. На примере прыткой ящерицы показано,
при использовании комплексного анализ полиморфизма разных геномных
элементов и фенотипических характеристик, что каждый из них вносит свой
индивидуальный вклад в формирование популяционно – генетических
отличий восточной прыткой ящерицы по полу и локалитету, что позволяет
предлагать такой комплексный анализ как наиболее информативный метод
для оценки состояния популяций и контроля динамики популяционной
структуры.
Методология. Основой идеи диссертации послужили исследования,
посвящённые поиску наиболее информативных характеристик, способных
отражать состояние популяции животных в зависимости от различных
факторов среды (Gullberg et al., 1997; Ciobanu et al., 2004; Гречко и др., 2006;
2001; 2005; 2011; Ljungström et al., 2015) с целью контроля и
прогнозирования его дальнейшей динамики.
Положения, выносимые на защиту.
1. Морфометрические характеристики и показатели фолидоза у
прыткой ящерицы по-разному отвечают на действие факторов окружающей
среды, что может объяснять противоречивость оценок при изучении
состояния популяций.
2. При применении ДНК маркеров наиболее информативными по
количеству выявляемых генотипов и их полиморфизму оказываются
связанные с ретротранспозонами по сравнению с микросателлитами.
3. Каждая фенотипическая и молекулярно-генетическая
характеристика вносит свой вклад в дифференциацию животных в
зависимости от пола и занимаемого локалитета.
4. Выраженность полового диморфизма по ряду фенотипических и
молекулярно-генетических характеристик в популяциях меняется в
зависимости от условий среды обитания.
5. Предварительный анализ референтных геномов по
распределению генотипируемых участков локализации микросателлитов и
фрагментов ретротранспозонов и выяснение их ассоциаций с частотой
встречаемости такой вторичной структуры ДНК, как G4 квадруплексы,
может способствовать увеличению эффективности их применения в
популяционно-генетических исследованиях.
Степень достоверности и апробация результатов. Полученный
цифровой материал обработан биометрически по стандартным методикам.
Основные положения диссертации были доложены на следующих
конференциях:
1. Международная научная конференция «Ломоносов – 2019» (МГУ 12-
23 апреля 2019 г.);
2. Международная студенческая научно-практическая конференция,
посвященная 145-летию со дня рождении А.Г. Дояренко (РГАУ-МСХА
имени К.А. Тимирязева 26-29 марта 2019 г.);
3. Всероссийская (национальная) научно-практическая конференция
«Актуальные проблемы молодежной науки в развитии АПК» (Курская
ГСХА, 11-13 декабря 2019 г.);
4. Международная научно-практическая конференция «Сохранение
разнообразия животных и охотничье хозяйство России» (РГАУ- МСХА
имени К.А. Тимирязева, 2019 г.);
5. XVIII Международный конкурс научных работ PTScience 16.07.2020;
6. Международная научная конференция «Ломоносов – 2021» (МГУ 12-
23 апреля 2021 г.);
7. IV Международная научная конференция по доместикации
«Доместикация как основа аграрной цивилизации», посвященная памяти
академика Дмитрия Константиновича Беляева (НИИПЗК, 2-4 июня 2021 г.);
8. Международная научно-практическая конференция «Сохранение
разнообразия животных и охотничье хозяйство России» (РГАУ- МСХА
имени К.А. Тимирязева, 2022 г.).
Личный вклад автора. Автором самостоятельно проведены все этапы
научного исследования, включая планирование, подготовку и проведение
экспериментов, анализ полученных результатов.
Публикация результатов исследования. Основные результаты
работы опубликованы в 10 научных статьях, в том числе 3 из них в журналах,
рекомендованных ВАК России, и 2, входящих в базу данных Web of Science
и Scopus.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 160 страницах
компьютерного текста и включает введение, основную часть, содержащую 36
таблиц и 52 рисунка, заключения, списка литературы (193 наименований, в
том числе 98 на иностранных языках) и 8 страниц приложения.
Благодарности. Автор выражает благодарность коллективу кафедры
зоологии ФГБОУ ВО РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, сотрудникам
сектора герпетологии зоологического музея МГУ.

Наибольшее количество статистически значимых отличий по
морфометрическим признакам обнаружено при сравнении ящериц самого
северного и южного локалитетов 1 и 3. Половой диморфизм по
морфометрическим признакам наиболее выражен у ящериц локалитета с
самой высокой антропогенной нагрузкой – локалитета 1, между самками и
самцами ящериц обнаружено 16 статистически значимых отличий, при этом
между самцами и самками ящериц самого восточного локалитета 2 выявлено
только 4 отличия по морфометрии, локалитета 3 – 11, локалитета 4 – 8.
Ящерицы самого южного локалитета – третьего – ожидаемо превзошли
по морфометрическим параметрам ящериц других изучаемых локалитетов,
находящихся значительно севернее.
В свою очередь при анализе показателей щиткования ящериц
локалитета 1 и 2 между ними обнаружены статистически значимые отличия
по 3 характеристикам. При оценке выраженности полового диморфизма по
показателям щиткования статистически значимые различия между самцами и
самками наблюдались между ящерицами восточного и западного
локалитетов 2 и 4. Между самками и самцами ящериц локалитетов 1, 3
половой диморфизм по показателям щиткования отсутствовал.
Как отмечалось выше, уровень разнообразия чешуйчатого покрова
зависит от климатических факторов, и увеличивается у ящериц степных
районов по сравнению с лесостепными (Симонов, 2009). Нами получены
похожие данные, так как в менее благоприятных локалитетах – 1 и 3,
которые характеризуется низкими температурами и подвергаются
наибольшему антропогенному давлению, вариативность чешуйчатого
покрова оказалась ниже, чем у ящериц локалитета 2 и 4.
Необходимо обратить внимание на очень высокий уровень
полиморфизма LTR праймеров (фрагментов эндогенных ретровиусов) в
спектрах ДНК прыткой ящерицы, не наблюдающийся, например, у
млекопитающих (Глазко и др., 2020). Среди праймеров микросателлитов
уровень полиморфизма был не так высок, среди них по количеству
консервативных локусов выделяется праймер (GAG)6C, по спектрам
ампликонов которого наблюдаются и значительно меньшие значения
генетических дистанций между всеми группами ящериц.
Относительно ме́ньшие значения генетических дистанций между
самками по ряду праймеров, полученные нами, совпадают с литературными
источниками, свидетельствующими о том, что у целого ряда видов
млекопитающих и рептилий геномы самцов характеризуются повышенной
геномной нестабильностью по сравнению с самками (Kathleen E. Fischer and
Nicole C. Riddle, 2018). Повышенная нестабильность генома у самцов была
выявлена у прыткой ящерицы при помощи микроядерного теста. При этом
половой диморфизм по геномной нестабильности, оцениваемый по
микроядерному тесту, увеличивается от центра ареала к его краям, в
результате чего уменьшаются половые различия между ящерицами (Дробот,
Ремизова, 2012).
По литературным данным половой диморфизм становится более
выраженным в неблагоприятных условиях среды на границе ареала, где
требуется более высокая эволюционная пластичность популяции (Геодакян,
1987, 2000; Булахова, 2004). Нами получены похожие данные,
показывающие, что у прытких ящериц хутора Средний локалитета 3,
половой диморфизм по генетическим дистанциям выражен сильнее, чем у
ящериц хутора Верхнекардаиьского локалитета 1, что может
свидетельствовать о том, что половая дифференциация по генетической
структуре может быть разной в зависимости от местообитания группы
животных и даёт возможность оценивать влияние различных факторов среды
на состояние популяции данного ресурсного вида.
Полученные нами данные могут свидетельствовать о том, что
выраженность полового диморфизма может отличаться в зависимости от
локалитета.
По сравнению с микросателлитными локусами, наибольшее
количество полиморфных фрагментов геномной ДНК ящериц выявлено с
использованием в качестве праймеров фрагментов LTR Sabrina и SIRE 1,
что делает возможным использование таких спектров для оценки
особенностей генетической структуры и контроля ее динамики у
представителей данного вида. Следует отметить, что праймеры (TGC)6C и
(GAG)6C встраиваются в кодирующие последовательности генов
NC_051819.1 и NC_051839.1 соответственно, а праймеры Sabrina и SIRE 1–
в некодирующие последовательности генов C1QL4 и COL9A1.
В общем, полученные нами данные свидетельствуют о
специфических особенностях ответа фенотипических и молекулярно-
генетических признаков на действие разных факторов окружающей среды
на изучаемых животных, в частности, на популяции прыткой ящерицы, а
также что самцы животных, по видимому, являются более
чувствительными к их воздействию, что выражается в их большей
смертности, более высоком уровне разнообразия фенотипических
признаков и большими значениями генетических дистанций. Подобные
данные были получены другими исследователями, которые отмечают, что
самцы являются более «предпочтительной» мишенью естественного
отбора у ряда видов животных (Winkler et al., 2021). Повышенную
смертность мужского пола, которая приводит к большему разнообразию
самцов по сравнению с самками, различные исследователи рассматривают
как выгодную для популяции форму информационного контакта со средой.
В экстремальных условиях среды третичное соотношение полов падает
(высокая смертность мужского пола), а вторичное – растет (повышается
«оборачиваемость» самцов), то есть повышенная смертность мужского
пола – это механизм, повышающий эволюционную устойчивость
популяции (Геодакян, 1973; Хайрутдинов, 2009).
Таким образом сопоставление анализа фенотипических и
молекулярно-генетических характеристик, выраженности полового
диморфизма и дифференциации самцов по генетическим дистанциям
можно использовать для оценки состояния популяции животных в
зависимости от различных факторов среды.
Исходя из полученных данных, можно сделать следующие выводы:
1. Прыткая ящерицы является важной частью рациона 14 видов
птиц из 8 семейств. Наибольшая доля прыткой ящерицы была обнаружена в
погадках степной пустельги и большой белой цапли, что подчёркивает
ресурсную значимость данного вида.
2. Наибольшее количество статистически значимых отличий по
морфометрическим признакам обнаружено при сравнении ящериц
локалитета 1 с ящерицами локалитета 3. Ящерицы самого южного локалитета
– третьего – ожидаемо превзошли по морфометрическим параметрам ящериц
других изучаемых локалитетов, находящихся значительно севернее. В свою
очередь показатели щиткования вовлекались в дифференциацию ящериц, в
основном, при сравнении западного локалитета 4 со всеми остальными.
3. Наибольшая доля полиморфных локусов выявлена при
использовании в качестве праймеров PCR фрагментов LTR Sabrina и SIRE 1,
она составила 100%, наименьшая доля полиморфных локусов была получена
в спектрах праймера (GAG)6C – 36%.
4. По большинству фенотипических характеристик половой
диморфизм был наиболее выражен у ящериц северного локалитета 1, по
молекулярно – генетическим – у ящериц южного локалитета 3. Наибольшие
фенотипические отличия между ящерицами разных локалитетов
наблюдались между самками, по молекулярно – генетическим – между
самцами.
5. Половой диморфизм по морфометрическим признакам наиболее
выражен у ящериц локалитета с самой высокой антропогенной нагрузкой –
локалитета 1, между самками и самцами ящериц обнаружено 16
статистически значимых отличий, между самцами и самками ящериц
локалитета 2 выявлено только 4 отличия, между ящерицами локалитета 3 –
11, локалитета 4 – 8. При оценке выраженности полового диморфизма по
показателям щиткования статистически значимые различия между самцами и
самками наблюдались между ящерицами восточного и западного
локалитетов 2 и 4.
Генетические дистанции между самками и самцами оказались больше у
животных южного локалитета 3 (хутор Средний Ставопольского края), чем у
ящериц северного локалитета 1 (хутор Верхнекардаильский Волгоградской
области) по спектрам всех используемых праймеров.
6. Сравнительный анализ полиморфизма фрагментов геномной
ДНК в экспериментальных исследованиях популяционно-генетических
структур с использованием ISSR-PCR и IRAP-PCR маркеров и распределения
участков гомологии к используемых в качестве праймеров в PCR
нуклеотидных последовательностей в референтном геноме прыткой ящерицы
позволяет предполагать определенную ассоциацию между плотностью G4
квадруплексов и полиморфизмом таких маркеров.
Практические рекомендации
В целях оценки и контроля состояния популяции различных видов
позвоночных животных мы рекомендуем использовать комплексный анализ
фенотипических признаков и полилокусное генотипирование с
использованием в качестве праймеров микросателлитов и длинных концевых
повторов эндогенных ретровирусов с последующим сопоставлением
полученных результатов.
При оценке состояния популяции животных следует использовать
такой критерий, как индивидуальное разнообразие самцов по сравнению с
самками.
Для увеличения эффективности применения ISSR-PCR и IRAP-PCR
маркеров в популяционно-генетических исследованиях. следует проводить
предварительный анализ референтных геномов по распределению участков
гомологии к потенциальным праймерам и их ассоциаций с частотой
встречаемости G4 квадруплексов.