Филогенетическое разнообразие и гидролитический потенциал бактериального сообщества содового шламохранилища

Объекты и методы исследования
Объект изучения микробного разнообразия. Отбор проб проводили в
сентябре 2017 года на территории действующей и старой карты содового
шламохранилища АО «Березниковский содовый завод». Для исследований
микробиоты в действующем шламонакопителе были отобраны пробы воды
(дистиллерной жидкости), донных отложений (содового шлама), техногенного
поверхностного образования в прибрежной зоне и техногенного поверхностного
образования с ризосферой растений. В почвоподобных образованиях осушенного
шламохранилища пробы отбирали с поверхности, а также на глубине 5 и 10 см (в
точке 59,4288º с.ш., 56,7297º в.д.).
Физико-химические методы исследования. Элементный состав образцов
определяли на атомно-абсорбционном спектрофотометре AA-6300 SHIMADZU
(Япония). Кислотность, содержание карбоната и гидрокарбоната, определяли в
соответствии с ГОСТ 26423-85. Анализ хлоридов, сульфатов, фосфатов и нитратов
проводили в соответствии с ПНД Ф 16.1:2:2.3:2.2.69-10. Ионный состав и степень
минерализации анализировали с помощью системы капиллярного электрофореза
КАПЕЛЬ-105M (Россия), в соответствии с руководством производителя.
Выделение микроорганизмов проводили методом прямого высева на
агаризованную среду Пфеннига с рН 8, содержащую селективные субстраты (1,5%):
пептон для выделения протеолитиков, крахмал растворимый – для амилолитиков,
микрокристаллическую целлюлозу – для целлюлолитиков, твин-80 – для
липолитиков. Параллельно производили высев на богатой среде с рН 11 (Atlas, 1993)
без селективных субстратов.
Определение ростовых характеристик. Бактериальный рост оценивали по
изменению оптической плотности суспензии клеток при  540 нм на
фотоэлектроколориметре КФК-3 с использованием кварцевой 1 см кюветы, также
оптическую плотность суспензии определяли на планшетном ридере Infinite M1000
«Tecan», (Швейцария).
Удельную скорость роста (µ) рассчитывали по формуле (Ждан-Пушкина,
1983):
µ = 1 / ОП0 (ΔОП / Δt), ч-1(1)
где ОП0 – ОП540 в момент времени t0;
ΔОП – изменение оптической плотности культуральной среды за время Δt, ч.
Урожай клеток бактерий определяли как разность между максимальной и
исходной массой бактерий, выражали в г/л.
Экономический коэффициент потребления субстрата (Y) определяли по
формуле:
Y=X / C•100, %(2)
где: X – количество образовавшейся биомассы, г/л;
С – количество потребленного субстрата, г/л
Молекулярно-генетический анализ. Препараты хромосомной ДНК бактерий
получали фенольным методом, модифицированным для выделения ДНК из
актиномицетов (Гловер, 1988). Идентификацию изолятов проводили методом
секвенирования фрагмента гена 16S рРНК, амплифицированного в ПЦР-реакции с
использованием универсальных праймеров 27F 5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTC
AG-3′ и 1492R 5′-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3′. Сравнение полученных
нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК проводили с использованием он-
лайн сервиса EzBioCloud (https://www.ezbiocloud.net/).
Метагеномный анализ. Метагеномную ДНК выделяли из образцов материала
шламохранилища согласно научно-методическим рекомендациям (Андронов и др.,
2011), а также СТАБ-методом (Галиев, Цырульников, 2011). Метагеномный анализ
исследуемых образцов по генам 16S рРНК проводили на платформах MiSeq и Ion
Torrent PGM в Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова, г. Москва.
Приготовление библиотеки для секвенирования проводили в соответствии с
инструкциями и протоколами для секвенаторов MiSeq Illumina и Ion Torrent PGM
(Roche Kapa Library Prep Kit Illumina 50 Rxn / Набор KAPA).
Расчет индексов биоразнообразия. Для исследуемой среды рассчитывали
показатели α-разнообразия: индекс Шеннона и Симпсона. Меру выровненности
рассчитывали по индексу Пиелу (Воронин, 2014, Чернов и др., 2015). Индексы
разнообразия учитывали для двух таксономических уровней: родов и филумов.
Определение гидролитической активности, изолированных культур. Для
определения липолитической активности изолятов, выращенных на селективной
среде с твин-80, проводили биохимическую реакцию с р-нитрофениллауратом
(Bulow, Mosbach, 1987). Активность липазы определяли по приросту оптической
плотности среды при λ 405 нм, измеренной на спектрофотометре Ultraspec 3000 «GE
Healthcare», (США).
Активность амилазы оценивали с помощью коммерческого набора реактивов
для определения амилазы Альфа-Амилаза-Ольвекс ООО «Ольвекс Диагностикум»,
(Россия). Активность фермента определяли по изменению оптической плотности
среды при λ 405 нм на планшетном ридере Infinite M1000 «Tecan», (Швейцария) в
течение пяти циклов с интервалом в 1 минуту.
Измерение целлюлозолитической активности культур основано на
колориметрическом определении редуцирующих сахаров, выделившихся после 24-
часовой инкубации образцов с натриевой солью карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ).
Концентрацию глюкозы определяли с помощью коммерческого набора реактивов для
определения глюкозы Глюкоза-8-Ольвекс ООО «Ольвекс Диагностикум», (Россия).
Интенсивность окраски определяли фотометрически на планшетном ридере Infinite
M1000 «Tecan», (Швейцария) в течение пяти циклов с интервалом в 1 мин при λ 500
нм.
Протеазную активность оценивали по ширине зоны лизиса казеината натрия
«Sigma-Aldrich», (Германия) вокруг штриха.
Изучение влияния концентрации хлорида натрия и рН среды на рост и
гидролитическую активность наиболее перспективных штаммов. Для оценки
влияния концентрации хлорида натрия и рН на рост и активность наиболее
перспективных изолятов варьировали pH среды Пфеннига, содержащей
соответствующий источник углерода, в диапазоне от 6 до 11. Концентрация NaCl
составляла 0,5; 5; 50; 100; 200 г/л. О росте бактерий судили по увеличению биомассы
(мг/мл), выживаемость бактерий оценивали методом определения КОЕ при высеве на
твердую питательную среду из десятикратных разведений в физиологическом
растворе. Активность гидролитических ферментов определяли вышеуказанным
способом.
Оценка метаболической активности клеток. Для оценки метаболической
активности клеток исследуемую культуру окрашивали препаратом PrestoBlue HS Cell
Viability Reagent («Invitrogen», Thermo Fisher Scientific, США). Флуоресценцию
измеряли на планшетном ридере Infinite M1000 «Tecan», (Швейцария) при λ
возбуждения/эмиссии 560/590 нм. Условные единицы флуоресценции относили к
плотности бактериальной культуры, измеренной при λ 600 нм.
Атомно-силовая микроскопия. Изучение морфологии клеток проводили с
помощью атомно-силового микроскопа (АСМ) Asylum MFP-3D-BIO (Asylum
Research, США) в лаборатории атомно-силовой и конфокальной микроскопии на базе
Rhodococcus-центра Пермского государственного национального исследовательского
университета. Сканирование осуществляли в полуконтактном режиме на воздухе с
использованием кремниевого кантилевера AC240TS с резонансной частотой 50-90
кГц и константой жесткости 0,5-4,4 Н/м. Обработку микрофотографий проводили с
помощью программы Igor Pro 6.22A (WaveMetrics, США).
Для определения линейных размеров клеток (длина, ширина, высота) и
характеристики структуры поверхности клеток (шероховатости) получали двух- и
трехмерные топографические изображения бактерий. Форма клетки была принята за
эллипсоид и был вычислен объем клетки.
Определение внутриклеточного рН. Внутриклеточный рН у бактерий
определяли с помощью флуоресцентного зонда 5 (и 6-)–карбоксифлуоресцеин
сукцинимидилового эфира (cFDASE) (Breeuwer et al., 1996). Интенсивность
флуоресценции измеряли при длинах волн возбуждения 490 и 440 нм, длине волны
излучения 525 нм. В конце каждого анализа сигнал внеклеточной флуоресценции
(фон) определяли путем фильтрации суспензии клеток через мембранный фильтр
размером 0,22 мкм с последующим измерением.
Калибровочные кривые для бактериальных культур были построены на
основании зависимости ОП490/ОП440 от рН. Внешний и внутренний рН
уравновешивали добавлением валиномицина (1 мкМ) и нигерицина (1 мкМ).
Статистическая обработка. Статистическую обработку полученных данных
проводили с использованием стандартного пакета лицензионной программы MS
Excel 2007. При статистической обработке определяли среднее арифметическое,
стандартное отклонение, стандартную ошибку среднего. Достоверность различий
определяли с использованием критерия Стьюдента. Различия считали достоверными
при уровне значимости p˂0,05.
Проводили множественный регрессионный анализ. Рассчитывали коэффициент
детерминации R2, при 0,7≤R2≤1 корреляционную связь считали высокой, при
0,4≤R2≤0,7 средней, при 0≤R2≤0,4 низкой. Корреляцию считали достоверной при
уровне значимости при p<0,05. РЕУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Микробное разнообразие содового шламохранилища города Березники Физико-химическая характеристика воды и грунтов содового шламохранилища. В образцах действующего содового шламохранилища рН воды составляет 11–12,6, отложений соды – 11. В пробах грунта старой карты содового шламохранилища кислотность варьировала в пределах 8–8,5, а рН грунта прибрежной части действующего шламохранилища составляла 7,5. Основным элементом изученных сред являлся кальций. Наименьшее количество кальция содержали образцы техногенных поверхностных образований прибрежной зоны действующего шламонакопителя и воды, наибольшее – донные отложения. Во всех остальных образцах концентрация кальция в кислоторастворимых и ацетатно-аммонийных фракциях соответствовала 260–470 г/кг грунта. Количество магния возрастало с увеличением глубины отбора проб (13–17,6 г/кг). Концентрация натрия была максимальна в водной фазе и достигала 6 г/л. Также были обнаружены тяжелые металлы, в большем количестве присутствующие в техногенных поверхностных образованиях территории старой карты содового шламохранилища. Общей тенденциейявляется возрастаниеконцентрацииметалловвгрунте восстанавливающихся территорий старой карты содового шламонакопителя по сравнению с действующим шламохранилищем. В образцах из действующего шламонакопителя и с поверхности осушенных территорий доминируют хлорид-ионы. Суммарное содержание хлорид-ионов в старой и новой карте составляло 9,3 и 74,7 г/кг соответственно. С увеличением глубины в образцах возрастало содержание карбонатов/гидрокарбонатов. В осадке шламохранилища отмечается также значительное содержание аниона SО42–. Кроме того, следует отметить существенное снижение концентрации хлорид-ионов в образцах грунта старой карты шламохранилища с глубины 5 и 10 см по сравнению с поверхностью. Определение численности бактерий с различной гидролитической активностью. Рисунок 1. Количество КОЕ/г бактерий на среде с крахмалом (а), целлюлозой (б), твин- 80 (в), пептоном (г). Образцы отобраны с территории старой карты шламонакопителя с глубины 5 см (1-1), 10 см (1-2), поверхности (1-3) и объединенная проба (1-4); из действующего шламохранилища: техногенныеповерхностные образования(2-1),донные отложения (2-2) и ризосфера грунта прибрежной зоны (2-3) Образцы с территории старой карты шламонакопителя характеризовались высокимсодержаниеммикроорганизмов,обладающихамилолитической, целлюлолитической,протеолитическойилиполитическойактивностью, максимальным на глубине около 5 см (3,31×109 КОЕ/г амилолитиков, 2,63×109 КОЕ/г протеолитиков, 1,40×109 КОЕ/г липолитиков, 1,27×109 КОЕ/г целлюлолитиков). В осадке шламохранилища (рН 11) обнаружено незначительное количество микроорганизмов, утилизирующих твин-80, крахмал и целлюлозу, (4,4×104, 3,0×104 и 2,63×104 КОЕ/г соответственно). Однако в образцах прибрежной зоны, содержащих ризосферу растений (рН 8), количество микроорганизмов, утилизирующих крахмал, целлюлозу, твин-80 и пептон, повышалось до 8,4×108 КОЕ/г (рис. 1), что, очевидно, связано как с выделением биополимеров корнями растений, так и с менее экстремальными значениями рН. Также наблюдалось увеличение количества бактерий, обладающих липолитической активностью в образцах техногенных поверхностных образований действующей карты шламонакопителя (до 5,7×109 КОЕ/г). При высеве на богатую среду с рН 11 в действующем шламохранилище наименьшее количество микроорганизмов обнаружено в осадке, где численность бактерий составляла 1,5×104 КОЕ/г. Увеличение микроорганизмов наблюдалось в образцах прибрежной зоны и в образцах, содержащих ризосферу растений: 4,6×107 и 2×107 КОЕ/г соответственно. Максимальное количество алкалофильных микроорганизмов было определено в образцах осушенного шламохранилища, отобранных с глубины 5 и 10 см, численность составила 8,5×107 и 8,9×107 КОЕ/г. В образцах, отобранных с поверхности старой карты шламонакопителя, количество микроорганизмов составило 9,8×106 КОЕ/г. Метагеномныйанализмикробногосообществасодового шламохранилища. Бактериальное сообщество, по данным метагеномного анализа, сформировано 7 филумами: Firmicutes, Proteobacteria, Bacteroidetes, Acidobacteria, Verrucomicrobia, Acidobacteria, Actinobacteria и Candidatus Saccharibacteria. В результате сравнительного метагеномного анализа было показано, что в исследованных образцах содового шламохранилища доминируют представители филумов Proteobacteria и Firmicutes (рис. 2). Рисунок 2 – Соотношение филумов домена Bacteria в образцах старого осушенного и действующего содового шламохранилища. С территории старой карты образцы отобраны с глубины 10 см (1-2) и получена объединенная проба (1-4), с территории действующего шламохранилища отобраны образцы техногенных поверхностных образований (2-1), донных отложений (2- 2) и воды (2-3). В воде и техногенных поверхностных образованиях действующего содового шламохранилища преобладали представители филума Firmicutes (52,11% и 64,12% от общего числа прочтений соответственно). В осадках соды и в объединенном образце грунта старой карты содового шламохранилища превалировали протеобактерии, в основном род Acinetobacter. В образце, взятом с глубины 10 см из грунта осушенных территорий, преобладали Firmicutes и Acidobacteria, а количество протеобактерий и актинобактерий было сопоставимо. Филогенетическое разнообразие микробиоценоза грунта старой карты содового шламонакопителя было более выражено по сравнению с образцами осадков, воды и поверхностных техногенных образований вблизи действующего содового шламохранилища. В микробиоме объединенного образца грунта осушенного содового озера преобладали семейства Moraxellaceae и Staphylococcaceae (20–23%), а также Pseudomonadaceae и Burkholderiaceae (11–13%), тогда как на глубине 10 см в большей степени были представлены семейства Streptococcaceae и Cellulomonadaceae (рис. 3). Следует отметить, что бактерии семейства Cellulomonadaceae являются ассоциативными микроорганизмами растительных симбиозов, и их появление связано с восстановлением растительного покрова на этих территориях. В воде действующего шламонакопителя были обнаружены представители трех семейств: Staphylococcaceae (65%), Moraxellaceae (30%) и Lachnospiraceae (2%). В осадках соды и грунте прибрежной части стафилококки и моракселлы также преобладали, и филогенетическое разнообразие микроорганизмов увеличивалось по сравнению с водой. Рисунок 3 – Соотношение семейств домена Bacteria в объединенной пробе (а) и на глубине 10 см (б) старой карты содового шламонакопителя и в техногенных поверхностных образованиях (в) и донных осадках (г) действующего шламохранилища. Для оценки биологического разнообразия, выровненности и доминирования отдельных таксонов в структуре сообщества были рассчитаны индексы Шеннона, Пиелу и Симпсона (Таблица 1). Анализ полученных индексов показал, что исследуемые источники не отличаются высоким биоразнообразием. Наибольшее разнообразие домена Bacteria и более выравненное распределение бактериальных таксонов обнаружено в грунтах старой карты содового шламохранилища и твердого содового шлама, а наименьшее – в дистиллерной жидкости и поверхностных техногенных образованиях прибрежной зоны действующей карты шламохранилища. Таблица 1 Биоразнообразие микроорганизмов в средах содового шламохранилища Индексы биоразнообразия и выравненности сообщества ШеннонаСимпсонаПиелуШеннонаСимпсонаПиелу ФилумыРоды 11,260,360,641,430,300,73 20,780,520,400,890,480,45 30,420,800,231,160,390,59 40,880,570,451,830,170,94 51,390,280,711,490,280,76 Примечание: 1 – содовый шлам, 2 – дистиллерная жидкость, 3 – техногенные поверхностные образования в прибрежной зоне действующей карты содового шламохранилища, 4 – грунт старой карты содового шламохранилища, 5 – грунт старой карты содового шламохранилища, 10 см глубины Также проведен множественный регрессионный анализ зависимости количества прочтений нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК отдельных филумов от концентрации металлов в образцах. Обнаружена высокая положительная корреляционная связь содержания представителей филума Firmicutes с концентрацией Ca, Bacteroidetes, Verrucomicrobia, Candidatus Saccharibacteria – с концентрацией Na, Actinobacteria и Acidobacteria – с концентрацией Mg. Однако высокая положительная корреляционная связь была достоверна только для Bacteroidetes (p=0,02), что можно объяснить широкой распространенностью галофильности среди представителей этого филума. 2. Выделение и идентификация гидролитических алкалотолерантных бактерий содового шламохранилища Выделение и идентификация алкалотолерантных бактерий, обладающих выраженными гидролитическими свойствами. Для поиска бактериальных культур использовали два подхода: выделение на среде с селективными субстратами в отсутствие экстремальных условий (рН 8) и на богатой среде с рН 11 без селективных субстратов, так как объединение нескольких лимитирующих факторов при выделении чистых культур значительно сужает исходный материал для скрининга ферментативных активностей. В анализе использовали 58 штаммов бактерий, в том числе 48 были выделены на среде с селективными субстратами при рН 8, остальные 10 штаммов были выделены на богатой среде с рН 11. Методом ПЦР с использованием праймеров к гену 16S рРНК различных филогенетических групп бактерий и последующей секвенирующей реакцией оценивали состав микробного сообщества. В условиях умеренно-щелочной среды выделены алкалотолерантные бактерии. Среди бактерий, изолированных из материала старого содового шламонакопителя, значительную часть составляли протеобактерии. Так, на средах с твин-80 и пептоном преобладали представители класса Alphaproteobacteria – главным образом Ensifer morelensis, Gammaproteobacteria – виды рода Pseudoxanthomonas, а также Firmicutes, класс Bacilli. На среде с крахмалом наблюдалось большее таксономическое разнообразие изолятов: были выделены культуры Sphingopyxis panaciterrae и Ensifer morelensis, относящиеся к классу Alphaproteobacteria, Pseudomonas peli (класс Gammaproteobacteria), Microcella putealis и Arthrobacter ginsengisoli (филум Actinobacteria, порядок Micrococcales), Bacillus cereus (фулум Firmicutes, класс Bacilli) и Pedobacter quisquiliarum (филум Bacteroidetes, класс Sphingobacteriia). На среде с целлюлозой, являющейся наиболее сложно метаболизируемым субстратом из используемых, выделены культуры Lysobacter prati (класс Gammaproteobacteria), Paenarthrobacter aurescens (филум Actinobacteria, порядок Micrococcales), Metabacillus indicus (филум Firmicutes, класс Bacilli). Из образцов с территории действующего шламохранилища изолировали преимущественно культуры актинобактерий, порядок Micrococcales (представители родов Actinotalea, Arthrobacter, Citricoccus, Microbacterium, Microcella, Micrococcus, Paenarthrobacter), а также Firmicutes; класс Bacilli (виды рода Bacillus). При выделении на богатой среде с рН 11 не обнаружено существенных отличий между материалом действующей и старой карты содового шламохранилища по составу культивируемых микроорганизмов (Таблица 2). Большую часть изолятов составляли представители актинобактерий, в том числе выделены виды рода Oerskovia (филум Actinobacteria; порядок Micrococcales), а также бациллы B. aequororis, B. halmapalus, B. zhangzhouensis, которые не выделялись на средах с более низким pH и являются алкалофилами. Таким образом, было показано, что в содовых шламонакопителях развиваются гидролитические бактерии, адаптированные к экстремальным условиям среды. Скрининг гидролитической активности бактериальных изолятов из искусственной щелочной среды позволил выявить наиболее перспективные штаммы, обладающие как внеклеточными, так и связанными с клетками активностями амилазы (Ensifer morelensis, 30,32 мкмоль/(л·мин); Paenisporasarcina quisquiliarum, 20,03 мкмоль/(мг·мин); Paenarthrobacter nitroquajacolicus 14.7 мкмоль/(л·мин) и 8,65 мкмоль/(мг·мин)), липазы (Pseudomonas peli, 0,83 мкмоль/(л·мин) и 2,97 мкмоль/(мг·мин)), протеазы (Arthrobacter halodurans, 12 мм; Micrococcus aloeverae, 10 мм) и целлюлазы (Microbacterium pygmaeum, 0,49 ммоль/(л·сут); Lisobacter soli, 0,47 ммоль/(л·сут); Bacillus indicus, 0,17 ммоль/(мг·сут)) (Таблица 3). Достаточно высокая активность гидролитических ферментов у многих, выделенных из содового шламохранилища изолятов, вероятно, связана с дефицитом органического субстрата. Таблица 2 Идентификация изолятов гидролитических бактерий, выделенных на богатой среде с рН 11 ИзолятТиповой штамм ближайшегоСходствоКоличествоИдентифи- родственного вида и номер вгенов 16Sпрочтенныхкационный базе данных EzBioCloudрРНК, %нуклеотидовномер последова- тельности в GenBank 12345 Старая карта содового шламонакопителя 3-ДБOerskovia paurometabola,99,86748MT872073 DSM14281T AJ314821 4-ДБBrevibacterium pityocampae,100754MT872074 DSM21720T EU484189 5-ДБBacillus aequororis,99,87758MT875306 M-8T KC686697 12-ДБBacillus aequororis,99,76833MT875307 M-8T KC686697 13-ДБOerskovia enterophila,100845MT872075 DSM 43852T MAQA01000098 Действующее содовое шламохранилище 7-ДБBacillus halmapalus,99,75813MT872080 DSM 8723T KV917375 8-ДБBacillus zhangzhouensis,98,73709MT872079 DW5-4T JOTP01000061 9-ДБMicrocella putealis,100825MT872081 CV-2T AJ717388 Таблица 3 Активность амилазы и липазы штаммов, выделенных на богатой среде с рН 11 Амилолитическая активностьЛиполитическая активность Супернатант,Супернатант, ИзолятОрганизммкмоль/Биомасса,мкмоль/Биомасса, (л·мин) /мкмоль/(л·мин) /мкмоль/ биомасса,(мг·мин)биомасса,(мг·мин) мг/млмг/мл 123456 3-ДБOerskovia18,91 / 16,52,961,15/ 3,72,37 paurometabola 4-ДБBrevibacterium22,06 / 5,58,671,20/ 7,01,17 pityocampae 5-ДБBacillus aequororis20,69 / 5,811,800,95/ 4,61,85 9-ДБMicrocella putealis19,52 / 20,12,691,45/ 4,41,50 Влияние состава сред культивирования на гидролитическую активность наиболее перспективного изолята P. peli 3-Т, обладающего липазной активностью. Оптимизирована среда культивирования Pseudomonas peli 3-Т, обладающего липазной активностью. Источник азота варьировали, добавляя в среду мочевину, хлорид аммония и нитрат аммония в концентрации 0,03%. Источником углерода служили оливковое масло, подсолнечное масло, глицерин, твин-20 и твин-80 в концентрации 1%. Концентрацию наилучшего источника углерода варьировали в диапазоне 0,1–1,5%. В результате различных комбинаций было установлено, что наилучшим источником углерода для накопления биомассы бактерий P. peli 3-Т является глицерин (рис. 4). При использовании глицерина в среде в концентрациях от 0,1 до 1,5% максимальный рост культуры отмечен при концентрации 0,5%. Показано, что при росте на среде с мочевиной и использованием в качестве источников углерода глицерина или подсолнечного масла значительно увеличивалась липолитическая активность. Рисунок 4 – Рост Pseudomonas peli 3-Т на среде с мочевиной в качестве источника азота и глицерином (1), твин-20 (2), подсолнечным маслом (3), оливковым маслом (4) в качестве источника углерода В результате экспериментов по оптимизации среды культивирования перспективного в биотехнологическом отношении штамма P. peli – продуцента липазы, был скорректирован ее состав, обеспечивающий получение максимального количества активной биомассы (Таблица 4). В качестве основы предложена среда Пфеннига (Рандагуруева, Лаврентьева, 2009), источник углерода – глицерин (0,5%); источник азота – мочевина (0,03%). Таблица 4 Ростовые характеристики и липазная активность штамма Pseudomonas peli 3-Т в зависимости от различных сочетаний источников углерода и азота ПоказателиУрожайАктивностьУдельнаяЭкономический биомассы,липазы,скорость ростакоэффициент г/лмкмоль/мин/л(μ) в лог-фазе, ч-потребления Субстрат, источник1 субстрата (Y), азота% Глицерин(1%);9,30,60,0393 мочевина (0,03%) Глицерин (0,5%);6,91,260,08138 мочевина (0,03%) Твин – 20 (1%);6,40,060,0464 мочевина (0,03%) Глицерин(1%);9,1–0,0491 NH4Cl (0,03%) Твин – 20 (1%);6,10,10,0461 NH4Cl (0,03%) Глицерин(1%);10,50,0010,41105 NH4NO3 (0,03%) 3. Морфологичекие и физиолого-биохимические свойства факультативного алкалофила Bacillus aequororis 5-ДБ, изолированного из содового шламохранилища Проведен ряд исследований, целью которых было выявление особенностей адаптивного ответа алкалофильного штамма бацилл в среде с высокой концентрацией соли и в широком диапазоне рН в сравнении с нейтрофильным представителем того же рода. В качестве исследуемых реакций отмечали изменения морфологии и топографии поверхности, внутриклеточного рН и общего уровня метаболизма. Объектом исследований являлся штамм 5-ДБ, выделенный на полноценной среде с рН 11, проявивший высокую активность амилазы и идентифицированный как Bacillus aequororis. Для сравнения использовали коллекционный штамм Bacillus subtilis АТСС 6633, который является нейтрофильным. Влияние концентрации хлорида натрия и рН на рост и гидролитическую активность Bacillus aeuqororis 5-ДБ. Исследование динамики роста факультативного алкалофила B. aequororis 5-ДБ и нейтрофильной коллекционной культуры B. subtilis ATCC 6633 на слабо- и высокощелочной среде показало, что B. aequororis 5-ДБ накапливает значительно большую биомассу по сравнению с B. subtilis ATCC 6633, как на среде с рН 11, так и на среде с рН 8 (рис. 5). Рисунок 5. Динамика роста B. subtilis ATCC 6633, B. aequororis 5-ДБ на слабо- и высокощелочной среде Изучено влияние различных pH и концентрации NaCl на липолитическую и амилолитическую активность алкалофильного штамма B. aequororis 5-ДБ (рис. 6). Установлено, что ферментативная активность проявляется в широком интервале рН от 3 до 11. Интересным фактом является повышение активности при сочетании высокой концентрации соли и рН 11, что может быть связано с активацией мембранных транспортных процессов в щелочной среде. АБ Рисунок 6. Амилолитическая (А) и липолитическая активность (Б) в супернатанте культуры Bacillus aequororis 5-ДБ при различных концентрациях соли и рН Влияние концентрации хлорида натрия и рН на уровень метаболической активности Bacillus aequororis 5-ДБ. Для оценки влияния кислотности и концентрации соли в среде на уровень метаболической активности клеток алкалофильного штамма Bacillus aequororis 5-ДБ, выделенного из образцов старой карты шламонакопителя, и штамма сравнения Bacillus subtilis ATCC 6633, культуры окрашивали препаратом PrestoBlue HS, выявляющим физиологически активные клетки. Культуры предварительно выращивали на полноценной среде, затем инкубировали в солевом растворе с концентрацией NaCl 0,5 или 50 г/л при разных значениях pH (3, 5, 7, 8, 9, 11, 13) в течение 2-х и 48 часов. При окрашивании содержащийся в препарате резазурин в активно метаболизирующих клетках трансформируется в интенсивно флуоресцирующее производное. Было показано, что B. subtilis ATCC 6633 для проявления физиологической активности нуждался в длительной адаптации и проявлял наиболее выраженную метаболическую активность при рН 9. B. aequororis 5-ДБ не нуждался в предварительной адаптации и проявлял сходный уровень метаболической активности в широком диапазоне рН от 5 до 11. Однако B. subtilis ATCC 6633 был более устойчив к 48-часовому отсутствию субстрата, что выражалось в отсутствии подавления метаболической активности после этого периода голодания (рис. 7). АБ Рисунок 7. Количество активно метаболизирующих клеток B. subtilis ATCC 6633 (А), B. aequororis 5-ДБ (Б) в условиях: 1 – адаптация 2 ч, 0,5 г/л NaCl; 2 – адаптация 48 ч, 0,5 г/л NaCl; 3 – адаптация 2ч, 50 г/л NaCl; 4 – адаптация 48 ч, 50 г/л NaCl. Влияние концентрации хлорида натрия и рН на морфологию Bacillus aequororis 5-ДБ. Морфологию и топографию поверхности клеток B. aeuqororis 5-ДБ и B. subtilis ATCC 6633 при разном рН и концентрации NaCl в среде визуализировали и оценивали методом атомно-силовой микроскопии. Показано, что кратковременное воздействие среды с концентрацией NaCl 50 г/л приводило к возрастанию шероховатости поверхности как алкалофильного B. aequororis 5-ДБ, так и нейтрофильного B. subtilis ATCC 6633, тогда как после суточной адаптации этот показатель снижался, за исключением воздействия 50 г/л и рН 8 на B. subtilis ATCC 6633. При инкубации в кислой среде (рН 5) шероховатость поверхности B. aequororis 5-ДБ существенно не отличалась от контроля, а объём клеток увеличивался на 40%. При помещении клеток Bacillus subtilis ATCC 6633 в среду с pH 5 независимо от времени инкубации в ней на 31-35% увеличивалась шероховатость клеток, а также наблюдалось их некоторое укорачивание и увеличение поперечных размеров относительно контроля. Получены АСМ-изображения клеток B. aequororis 5-ДБ и B. subtilis ATCC 6633 после инкубации в условиях, отличных от контроля для данного штамма (рис. 8). Клетки B. aequororis 5-ДБ при воздействии 50 г/л NaCl в среде имели менее ровную поверхность, отмечалось скопление кристаллов соли, а после суточной адаптации в среде с рН 8 и 50 г/л NaCl клетки представляли собой короткие утолщенныепалочки,визуальноотличающиесяотконтроля.Клетки B. subtilis ATCC 6633 при воздействии высокоминерализованной среды имели неровные очертания и выраженную шероховатость поверхности, в препаратах отмечалось много неидентифицированных структур, по-видимому, являющихся клеточными обломками. Воздействие кислой среды (рН 5) на клетки B. subtilis ATCC 6633 визуально более выражено, поверхность клеток неровная и после двухчасовой, и после суточной адаптации. После суток инкубации в кислой среде наблюдается лизис клеток и присутствие клеточных обломков в препарате. В то же время, B. aequororis 5-ДБ более устойчив к рН 5, клетки после двухчасового воздействия ровные, имеют гладкую поверхность, после суток воздействия шероховатость поверхности увеличивается, лизис клеток незначителен. АБИК ВГЛМ ДЕНО ЖЗПР Рисунок 8. АСМ-изображения клеток B. aequororis 5-ДБ: А – 0,5 г/л NaCl, рН 11 (контроль); Б – 50 г/л NaCl, рН 11 (сразу); В – 50 г/л NaCl, рН 11(адаптация сутки); Г – 0,5 г/л NaCl, рН 8 (сразу); Д – 0,5 г/л NaCl, рН 8 (адаптация сутки); Е – 50 г/л NaCl, рН 8 (адаптация сутки); Ж – рН 5 (сразу); З – рН 5 (адаптация сутки). B. subtilis АТСС 6633: И – 0,5 г/л NaCl, рН 8 (контроль); К – 50 г/л NaCl, рН 8 (сразу); Л – 50 г/л NaCl, рН 8 (адаптация сутки); М – 0,5 г/л NaCl, рН 11 (сразу); Н – 0,5 г/л NaCl, рН 11 (адаптация сутки); О – 50 г/л NaCl, рН 11 (адаптация сутки); П – рН 5 (сразу); Р – рН 5 (адаптация сутки) Таким образом, установлено, что морфология клеток алкалофильного B. aequororis 5-ДБ менее подвержена изменениям в среде с высокой концентрацией соли (50 г/л), чем нейтрофильного B. subtilis АТСС 6633, клетки которого значительно уменьшаются в размерах, а после суточной адаптации к 50 г/л NaCl при рН 8, наоборот, увеличиваются в объеме за счет удлинения. Клетки B. aequororis 5-ДБ, являясь предадаптированными к высокой минерализации и щелочной среде, мало изменяются под влиянием условий, отличных от таковых культивирования. Шероховатость поверхности клеток и нейтрофильного, и алкалофильного штамма бацилл незначительно увеличивалась при возрастании концентрации соли в среде, что может говорить о потере воды клеткой, особенно на первых этапах адаптации к высокому содержанию соли. Интересным фактом является повышенная устойчивость факультативного алкалофила B. aequororis 5-ДБ к низкому рН, что является подтверждением общей неспецифической адаптивной способности данного штамма к неблагоприятным условиям окружающей среды. Влияние концентрации хлорида натрия и рН среды на внутриклеточный рН Bacillus aequororis 5-ДБ. Для измерения рН в работе использовали флуоресцентный зонд cFSE (5 (и 6-)-карбоксифлуоресцеин сукцинимидиловый эфир). Флуоресценция cFSE зависит от рН, зонд в виде диацетатного эфира cFDASE поглощается бактериями во время инкубации. При включении в клетку его сукцинимидильная группа образует конъюгаты с алифатическими аминами. Флуоресценцию можно обнаружить только после расщепления эфира внутриклеточной эстеразой. Карбоксифлуоресцеин не проявляет чувствительности к pH при возбуждении излучением с длиной волны 440 нм и имеет максимальную рН- чувствительность при возбуждении на длине волны 490 нм. После получения флуоресцентного сигнала на каждой длине волны возбуждения было вычислено независимое от концентрации соотношение между pH–чувствительными и нечувствительными к pH сигналами. Установлено, что для обеих культур почти во всех образцах внутриклеточный рН ниже внеклеточного (Таблица 5, 6), что является нормой для алкалофильных микроорганизмов. Нейтрофилы, растущие при рН 7 имеют маленький ΔpH, сопровождаемый значительным Δψ, отрицательным внутри. У алкалофилов внутриклеточный рН значительно ниже внешнего, Δψ алкалофилов выше, чем у нейтрофилов, но он частично компенсируется большим «реверсивным» Δ pH. Таблица 5 Изменение рНin в клетках Bacillus auquororis 5-ДБ в среде с разной концентрацией соли и рН КонцентрациярНoutpHin|ΔpH|pHin|ΔpH| NaCl, г/л2 часа адаптации48 часов адаптации 0,534,41,44,41,4 76,20,87,40,4 87,70,37,40,6 9728,20,8 118,62,49,31,7 5033,90,930 7617,250,25 8717,20,8 96,82,281 117,93,19,11,9 Таблица 6 Изменение рНin в клетках Bacillus subtilis АТСС 6633 в среде с разной концентрацией соли и рН КонцентрациярНoutpHin|ΔpH|pHin|ΔpH| NaCl, г/л2 часа адаптации48 часов адаптации 0,533030 87,60,47,50,5 97,61,47,81,2 119,11,98,32,7 5033030 87,70,37,50,5 97,61,47,91,1 118,22,88,12,9 Установлено, что B. aequororis 5-ДБ имеет более широкий диапазон толерантности к крайним значениям рН. Даже при рН 3 отмечена небольшая разница в концентрации протонов в отличие от B. subtilis АТСС 6633, где она равнялась нулю. Также следует отметить, что у B. aequororis 5-ДБ разница концентраций протонов ΔpH выше при рН 11, NaСl 50 г/л, чем при рН 11, NaСl 0,5 г/л и при рН 8 NaСl 0,5 и 50 г/л. Для культуры B. subtilis АТСС 6633 низкие значения рН являются губительными, а при защелачивании среды разница концентраций протонов повышается и незначительно отличается от таковой у B. aequororis 5-ДБ. Таким образом, даже нейтрофильные бациллы способны выдерживать высокий рН внешней среды, но при этом было показано, что факультативный алкалофил более устойчив к низкому рН за счет общей адаптивной способности. В экспериментах по определению гидролитической активности, уровня метаболизма, внутриклеточного рН и морфометрических показателей было отмечено, что сочетание высокий рН – высокая концентрация хлорида натрия (в наших экспериментах, рН 11 и 50 г/л NaCl) для клеток даже более благоприятно, чем сочетания слабощелочная среда – высокая концентрация NaCl (рН 8, 50 г/л) и высокий рН – низкая концентрация NaCl (рН 11, 0,5 г/л). Такая реакция клеток может быть связана с повышенной концентрацией ионов натрия, необходимых для обеспечения энергетического метаболизма в щелочных условиях. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Техногенные щелочные местообитания характеризуются уникальными условиями среды. Следовательно, микробное сообщество в данном биотопе также является уникальным и обладает рядом физиологических особенностей, которые обусловлены средой обитания. В результате исследований нами впервые проведена оценка микробного сообщества в содовом шламохранилище АО «Березниковский содовый завод». Изучено изменение микробного состава при восстановлении территорий после эксплуатации (осушение, частичное восстановление растительного покрова). Для оценки микробного разнообразия были использованы молекулярно-генетические методы, что позволило показать разнообразие прокариотов в экстремальных условиях, созданных деятельностью человека. Изучен элементный состав образцов щелочной техногенной среды, созданной в результате производства соды. Минеральный состав изучаемой среды отличается от естественных щелочных биотопов, что, очевидно, и является важнейшим фактором отличий в составе микробиоты этих экосистем. Изучена сукцессия бактериального сообщества при восстановлении территорий старой карты шламохранилища. Обнаружены изменения микробного сообщества, связанные со сменой состава техногенного образования, которые могут быть использованы в качестве индикаторов восстановления среды. Оценено α-разнообразие и выровненность бактериального сообщества сред содового шламохранилища. Методом высева на селективные среды определено количество бактерий с липолитической, протеолитической, амилолитической и целлюлозолитической активностями. Выделены алкалотолерантные бактерии, способные расти в широком диапазоне кислотности (от нейтральных до рН 11) и алкалофильные изоляты, растущие при рН 11, проявляющие высокую активность гидролитических ферментов. Изолированные культуры представляют интерес для биотехнологии как продуценты ферментов, устойчивых к щелочным значениям рН и высокой минерализации среды. Изучен биотехнологический потенциал выделенных и идентифицированных бактериальных изолятов, устойчивых к щелочной среде и высокому содержанию солей, с различными гидролитическими активностями. Обнаруженные свойства селекционированных культур и их ферментов представляют интерес для биотехнологического применения. Для наиболее продуктивного штамма, обладающего липолитической активностью, оптимизирована среда культивирования. Установлено, что мочевина способствует индукции липазной активности. Исследованы морфологические и физиолого-биохимические свойства факультативного алкалофила Bacillus aequororis 5-ДБ в сравнении с нейтрофильным Bacillus subtilis ATCC 6633. Данный штамм проявил высокую активность амилазы в широком диапозоне рН и степени минерализации. Вычислены морфометрические параметры клеток после инкубации в щелочной среде с высокой концентрацией хлорида натрия. Показано, что морфология клеток алкалофильной бациллы, в отличие от таковой нейтрофильной, не претерпевает значительных изменений при высокой минерализации среды как при непосредственном воздействии, так и после суточной адаптации. Исследована физиологическая активность культур при инкубации в щелочной среде с высокой концентрацией хлорида натрия. Показано, что клетки B. subtilis АТСС 6633 для проявления физиологической активности нуждались в длительной адаптации и проявляли наиболее выраженную жизнеспособность при рН 9, тогда как культура B. aequororis не нуждалась в предварительной адаптации и проявляла сходную метаболическую активность в широком диапазоне рН от 5 до 11. Таким образом, выявлены особенности адаптивных реакций и функционирования выделенных бактерий в экстремальных условиях высокоминерализованной и щелочной среды. Анализ полученных данных позволил заключить, что выделенные штаммы при условии дальнейшей селекции могут являться перспективными объектами в биотехнологии: в производстве моющих средств, биоремедиации, пищевой промышленности и сельском хозяйстве. Перспективой дальнейшей разработки темы диссертационного исследования является селекция выделенных штаммов в направлении увеличения ферментативной активности, создание биопрепаратов на их основе и изучение филогенетического разнообразия домена Archaea содового шламохранилища. ВЫВОДЫ 1.Изучено филогенетическое разнообразие микробиоценоза действующей и старой карты содового шламохранилища г. Березники (Пермский край). Установлено, что бактериальное сообщество в исследуемом биотопе сформировано 7 филумами: Firmicutes, Proteobacteria, Bacteroidetes, Acidobacteria, Verrucomicrobia, Acidobacteria, Actinobacteria и Candidatus Saccharibacteria, среди которых доминирующими являются Proteobacteria и Firmicures. Появление представителей семейства Cellulomonadaceae в грунте старой карты свидетельствует о восстановлении территорий. Показано, что изученные среды отличаются крайне низким α- разнообразием и выравненностью, и максимальный индекс Шеннона, рассчитанный для микробного сообщества сред содового шламохранилища, не превышает 1,86. 2.Показано, что на поверхности грунта старой карты 73% гидролитических бактерий составляли протеолитики, а на глубине 10 см 43% приходилось на долю целлюлолитиков. Подавляющее содержание липолитиков отмечено в содовом шламе и поверхностных техногенных образованиях новой карты содового шламохранилища. Максимальное количество алкалофильных гетеротрофных культивируемых бактерий достигало 8,9×107 КОЕ/г в образцах старой карты содового шламохранилища. 3.Сочетание двух способов выделения чистых культур бактерий-гидролитиков из высокоминерализованной щелочной среды, таких как выделение на среде с селективными субстратами в отсутствие экстремальных условий (рН 8) и на полноценной среде с рН 11 без селективных субстратов, позволило получить обширный материал для скрининга гидролитических активностей среди галоалкалотолерантных бактерий. 4.Выделены и идентифицированы культуры, проявляющие активность гидролитических ферментов (амилазы, липазы, протеазы, целлюлазы). Изолированы наиболее перспективные штаммы, обладающие как внеклеточными так и связанными с клетками активностями амилазы (Ensifer morelensis, 30,32 мкмоль/(л·мин); Paenisporasarcinaquisquiliarum,20,03мкмоль/(мг·мин);Paenarthrobacter nitroquajacolicus 14,7 мкмоль/(л·мин) и 8,65 мкмоль/(мг·мин)), липазы (Pseudomonas peli, 0,83 мкмоль/(л·мин) и 2,97 мкмоль/(мг·мин)), протеазы (Arthrobacter halodurans, 12 мм; Micrococcus aloeverae, 10 мм) и целлюлазы (Microbacterium pygmaeum, 0,49 ммоль/(л·сут); Lisobacter soli, 0,47 ммоль/(л·сут); Bacillus indicus, 0,7 ммоль/(мг·сут)). Наибольшую активность амилазы у культур, полученных на среде с рН 11 и 8, отмечали при рН 10 и 6 соответственно, тогда как удельная активность внеклеточной липазы изолятов P. peli, выделенных при рН 8, была наибольшей при рН 11. 5.В результате экспериментов по оптимизации среды культивирования перспективного в биотехнологическом отношении штамма Pseudomonas peli 3-T – продуцента липазы, был скорректирован ее состав, обеспечивающий получение максимального количества активной биомассы. В качестве основы предложена среда Пфеннига, источник углерода – глицерин (0,5%), источник азота – мочевина (0,03%). Активность липазы на оптимизированной среде культивирования составляла 1,26 мкмоль/мин/л, урожай биомассы 6,9 г/л, удельная скорость роста в логарифмической фазе 0,08 ч-1, экономический коэффициент потребления субстрата 138%. 6.Изучены морфологические и физиолого-биохимические особенности факультативного алкалофила Bacillus aequororis в условиях повышенной минерализации и широком диапазоне рН среды. Показано, что продуцент амилазы B. aequororis 5-ДБ адаптирован к экстремальным условиям и способен к активному метаболизму в широком диапазоне рН (5–11), а сочетание рН 11 с 50 г/л хлорида натрия в среде обеспечивает наибольшую амилазную и липазную активность этого штамма. Установлено, что морфология клеток алкалофильного B. aequororis 5-ДБ менее подвержена изменениям в среде с высокой концентрацией соли (50 г/л), чем нейтрофильного B. subtilis АТСС 6633.