Гены CLE в развитии картофеля

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
В главе проведен анализ научной литературы, посвященной, прежде всего, развитию
клубня у картофеля – видоизмененного
подземного побега, выполняющего
функцию вегетативного размножения.
Описаныструктурныеизменения,
происходящие в растении, а также
ключевыегены,вовлеченныев
регуляциюклубнеобразованияв
зависимостиотфотопериода,
температуры и количества азота в
среде. Также разобраны основные
функции пептидных гормонов CLE,
такие как поддержание меристем
побега и корня, регуляция делений
клетоккамбия,контрольнад
дифференцировкой проводящих тканей
и ответ на условия окружающей среды
(Рис. 1).

Рис.1. Некоторые функции пептидов
CLE в развитии растений.
Пептиды CLV3 и CLE40 участвуют в
поддержании апикальных меристем
побега и корня, соответственно. CLE14 вовлечен в формирование корневых волосков. У
бобовых в присутствии азота и при образовании азотфиксирующих клубеньков
экспрессируются гены CLE-RS, после чего кодируемые ими пептиды поступают по ксилеме в
листья, где индуцируют образование цитокинина, который подавляет дальнейшее образование
клубеньков. При дефиците нитрата образуется пептид CLE3, который локально подавляет
образование боковых корней. При нехватке воды начинается экспрессия гена CLE25, пептид
CLE25 поступает по ксилеме в листья и вызывает закрытие устьиц. Также, пептид CLE25
вовлечен в дифференцировку флоэмы, в развитии которой участвует еще один пептид CLE,
CLE45. Закрытие устьиц, а также их образование, контролируют пептиды CLE9/10.
Пролиферацию камбия и дифференцировку ксилемы регулируют пептиды CLE, относящиеся к
небольшой группе TDIF.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растительный материал и условия выращивания растений
В исследовании использован картофель Solanum tuberosum сорта Дезире, любезно
предоставленный Всероссийским институтом генетических ресурсов растений имени Н.И.
Вавилова. Для поддержания картофеля в условиях in vitro растения выращивали на среде
Мурасиге-Скуга (MS) (Murashige and Skoog, 1962) c 10 г/л сахарозы при температуре 23 оС и
фотопериоде 16 часов день/ 8 часов ночь. Для изучения влияния азота на экспрессию и
активность промоторов генов CLE применяли модифицированную среду Мурасиге-Скуга с 10
г/л сахарозы, в качестве источника азота содержащую 10мМ KNO3 и NH4Cl; в среде без азота
вместо них использовали 10 мМ KCl, концентрации всех остальных элементов были урезаны
вдвое.
В эксперименте по изучению влияния нехватки воды на экспрессию генов CLE растения
картофеля, выращенные в условиях in vitro, аккуратно извлекали из среды, промывали и на
сутки оставляли в дистиллированной воде; далее часть растений извлекали из воды на 4 часа.
Штаммы микроорганизмов
В работе использовали бактерии Escherichia coli (штамм Top10), Agrobacterium
tumefaciens (штамм AGL1), Agrobacterium rhizogenes (штамм Arqua), а также дрожжи
Saccharomyces cerevisiae (штамм Y2H Gold).
Анализ последовательностей
Поиск генов CLE производили в геномных сборках семи видов картофеля (S. tuberosum
group Phureja (GCA_009849755.1), S. bukasovii Juz. et Rybin. (GCA_009849815.1), S. verrucosum
Schltdl. (GCA_900185145.1), S. commersonii Dunal. (GCA_001239805.1), S. curtilobum Juz. et Buk.
(GCA_009849645.1), S. juzepczukii Juz. et Buk. (GCA_009849685.1), S. ajanhuiri Juz. et Buk.
(GCA_009849805.1)) с использованием алгоритмов BLASTP, BLASTN или TBLASTN баз
данныхSpudDB(http://solanaceae.plantbiology.msu.edu/)иNCBI
(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)понуклеотиднымиаминокислотным
последовательностям генов и белков CLE Arabidopsis thaliana и томата. Филогенетические
деревья были построены на основании выравнивания аминокислотных последовательностей
белков CLE с помощью алгоритма Muscle из программы MEGA7 (https://www.megasoftware.net/)
(Kumar et al., 2016) методом ближайшего соседа (Saitou и Nei, 1987) со стандартными
настройками и бутстрепом 1000 (Felsenstein, 1985). Для визуализации доменов CLE была
использована программа МЕМЕ (http://meme-suite.org/). Анализ последовательностей ДНК
осуществляли с помощью программ ApE (https://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/), Vector
NTI 10 (Thermo Scientific), SnapGENE (https://www.snapgene.com/), UGENE (http://ugene.net/ru/) и
MEGA7.
Анализ данных секвенирования РНК
Для оценки накопления транскриптов генов StCLE использовались данные
секвенирования РНК картофеля S. tuberosum group Phureja, полученные из проекта NCBI
PRJEB2430. Контроль качества ридов осуществляли в программе FASTQC (v. 0.11.5)
(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/).Дляфильтрацииридовот
последовательностей митохондриальной, пластидной и рибосомальной ДНК и технических
последовательностей использовали программу bbduk из набора программ bbtools (v. 37.23)
(https://jgi.doe.gov/data-and-tools/bbtools/). Значения TPM (transcripts per million) для генов StCLEs
для различных тканей были посчитаны с помощью алгоритма kallisto (Bray et al., 2016). В
качестве референса использовали сборку транскриптома картофеля S. tuberosum group Phureja
DM_1-3_516_R44 v6.1 из базы данных SpudDB (http://solanaceae.plantbiology.msu.edu). Для
построения тепловой карты экспрессии генов картофеля использовали функцию heatmap.2 из
пакета R (http://www.r-project.org/).
Количественный анализ экспрессии генов
РНК выделяли с помощью реагента Trizol (Invitrogen). ДНКазную обработку проводили с
помощью набора реактивов RapidOut DNA Removal Kit (Thermo Scientific, США). Для
постановки обратной транскрипции использовали набор реактивов RevertAid Reverse
Transcriptase (Thermo Scientific, США). Для ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) использовали
набор реагентов для проведения ПЦР-РВ в присутствии красителя Eva Green (Синтол, Россия).
Обработку результатов проводили с помощью метода 2-ΔΔСT (Livak and Schmittigen, 2001).
Данные количественной оценки экспрессии генов представляли в относительных единицах,
рассчитанных при сравнении с уровнем экспрессии референсного гена убиквитина.
Статистическую обработку полученных результатов, а также построение графиков
осуществляли в программах R или Microsoft Excel.
Выделение ДНК и ПЦР
Выделение ДНК из растений проводили с помощью метода с применением
цетилтриметиламмоний бромида (ЦТАБ) (Murray, Thompson, 1980). Выделение плазмидной
ДНК проводили с помощью набора реактивов и колонок Plasmid Miniprep Kit (Евроген, Россия).
Из геля фрагменты ДНК выделяли с помощью набора реактивов и колонок Cleanup Mini
(Евроген, Россия).
Реакции ПЦР для генотипирования растений и проверки наличия вставки в вектор
проводили с Taq-полимеразой (Евроген, Россия). Для амплификации генов, предназначенных
для конструирования векторов, вместо Taq-полимеразы использовали высокоточную
полимеразу Phusion High-Fidelity DNA polymerase (Thermo Scientific, США). Для визуализации
результатов ПЦР использовали электрофорез в 1% агарозном геле. В гель для визуализации
ДНК добавляли 0.1% интеркалирующего красителя – бромистого этидия или SYBR Safe
(Invitrogen, США).
Конструирование векторов
Для клонирования последовательностей ДНК использовали систему Gateway (Invitrogen,
США). ПЦР-фрагменты, полученные при амплификации геномной ДНК картофеля, встраивали
в вектора ввода с помощью смеси вирусных рекомбиназ BP-клоназы (Invitrogen) с дальнейшим
переклонированием в вектора назначения с помощью смеси вирусных рекомбиназ LR-клоназы
(Invitrogen, США). Постановку ВР- и LR-клоназных реакций проводили по протоколу
производителя.
Агробактериальная трансформация картофеля
Для получения растений с трансгенными корнями применяли трансформацию A.
rhizogenes. Стебель двухузлового черенка надрезали скальпелем и наносили на срез культуру A.
rhizogenes. Далее кокультивировали растения с бактериями 48 часов на среде MS, после чего
пересаживали черенки на среду MS с добавлением цефотаксима (500 mg/L) для устранения
бактерий.
Для получения полностью трансгенных растений картофеля проводили трансформацию
листовых эксплантов с помощью A. tumefaciens по протоколу, описанному в диссертации на
соискание ученой степени кандидата биологических наук Колачевской О.О. (2015).
Анализ активности репортерных белков
Детекцию активности репортерного гена GUS (Glucuronidase) осуществляли с помощью
субстрата X-Gluc (Sigma-Aldrich, США). Фиксацию образцов с репортерным геном GFP (Green
Fluorescent Protein) проводили по методике, описанной Ilina et al., 2018, детекцию активности
GFP проводили в синем свете (длина волны 483 нм). Работа по приготовлению и анализу срезов
была проведена в ресурсном центре СПбГУ «Развитие молекулярных и клеточных технологий».
Дрожжевая одногибридная система
Для изучения взаимодействия ДНК-белок использовали метод дрожжевой
одногибридной системы. Трансформацию дрожжей проводили по методу, описанному Gietz и
Schiestl (2007). Эксперименты с использованием дрожжевой одногибридной системы проводили
согласно Davies (2013).

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Анализ последовательностей и экспрессии генов CLE у картофеля.
Ранее, Goad с соавторами обнаружили 21 ген, предположительно кодирующий пептиды
CLE, в геноме картофеля Solanum tuberosum group Phureja (StCLE) (Goad et al., 2016). С
помощью баз данных SpudDB и NCBI по гомологии с генами резуховидки и томата в геноме
картофеля S. tuberosum group Phureja DM-1-3 516R44 нами был идентифицирован 41 ген CLE,
среди которых двадцать не упоминались в работе Goad с соавторами. Мы также произвели
поиск генов CLE у других видов картофеля – трех диких видов (S. bukasovii Juz. et Rybin., S.
verrucosum Schltdl., S. commersonii Dunal.) и трех культурных (S. curtilobum Juz. et Buk., S.
juzepczukii Juz. et Buk., S. ajanhuiri Juz. et Buk.). Мы выявили 42 гена, которые присутствуют
почти у всех проанализированных видов картофеля, однако ген, названный нами CLE42, не
найден в геноме S. tuberosum group Phureja, хотя присутствует у всех остальных
проанализированных нами видов картофеля (Ганчева и др., 2021). Дикий вид S. commersonii, в
природе растущий вне ареалов произрастания культурных видов картофеля (Юзепчук, Букасов,
1929), демонстрирует наибольшие отличия последовательностей белков CLE от других
изученных видов картофеля.
Из литературных данных известно, что пептиды CLE образуются из более крупного
предшественника, содержащего сигнальный домен на N-конце, вариабельный домен и CLE
домен на С-конце, который выщепляется, претерпевает модификации и становится зрелым
пептидом CLE. Мы обнаружили, что, как и у резуховидки и томата (Zhang et al., 2014; Gancheva
et al., 2021), у картофеля все гены CLE содержат только один домен CLE. Консенсусная
последовательность домена CLE картофеля отличается от консенсусных последовательностей
доменов CLE резуховидки и томата, но также содержит 6 наиболее консервативных
аминокислот (R1, P4, G6, P7, P9 и H11) (Рис. 2А).

Рис.2.АнализпоследовательностейбелковCLEкартофеля.А-Консенсусные
последовательности CLE доменов A. thaliana, S. lycopersicum и S. tuberosum построенные в
программе МЕМЕ. Б – филогенетическое дерево семейств белков A. thaliana (зеленые
треугольники), S. lycopersicum (красные кружки) и S. tuberosum (оранжевые квадраты).

Мы провели анализ экспрессии генов StCLE в апексе побега, цветке, листе, черешке,
стебле, столоне, клубне (молодом и зрелом) и корне картофеля S. tuberosum group Phureja,
используя данные по транскриптому из базы данных NCBI (Рис. 3). Четырнадцать генов
(StCLE2, -5, -10, -15, -18, -25, -27, -29, -32, -34, -35, -38, -40 и -41) были исключены из схемы, так
как их транскрипты не были обнаружены во всех проанализированных тканях. Двенадцать
генов StCLE (StCLE3, -4, -6, -11, -14, -20, -21, -22, -24, -26, -31 и -36) демонстрируют низкий
уровень экспрессии или отсутствие экспрессии в большинстве проанализированных тканей
картофеля. Пять других генов (StCLE9, -12, -13, -23 и -30), наоборот, экспрессируются на
высоком уровне почти во всех тканях растения. Десять генов (StCLE1, -7, -8, -16, -17, -19, -28, –
33, -37 и-39) характеризуются тканеспецифичной экспрессией – так, ген StCLE8 экспрессируется
на высоком уровне в апексе, столоне, клубне и корне, но имеет низкий уровень экспрессии в
цветке, листе, черешке и стебле.

Рис.3. Log2 значения ТPM (Transcripts Per Million) для генов CLE картофеля. Серым цветом
обозначены ТPM равные 0.

Поиск генов CLE участвующих в ответе на изменение содержание азота в среде.
1. Поиск гомологов генов CLE резуховидки, участвующих в ответе на азот.
Для картофеля содержание азота в среде является одним из факторов, регулирующим
развитие клубня: его избыток негативно сказывается на развитии клубней (Ewing, 1995). С
помощью филогенетического анализа мы выявили у картофеля предполагаемые гомологи генов
резуховидки AtCLE1-7, которые вовлечены в ответ на азот – StCLE4, -5, -10, -11, -24, -25, -34, -41
(Рис. 2Б).

2. Анализ экспрессии генов CLE в ответе на изменение содержание азота в среде.
На следующем этапе мы проанализировали экспрессию генов StCLE в корнях растений,
растущих на средах с азотом и без него. Количественный анализ экспрессии генов с помощью
ПЦР-РВ показал, что уровни экспрессии генов StCLE4 и StCLE10 значимо снижаются при
пересадке растений со среды с азотом на среду без азота и возрастают при пересадке со среды
без азота на среду с азотом (Рис. 4, 5). Уровень экспрессии гена StCLE5 значимо изменялся
только при пересадке растений со среды без азота на среду с азотом (Рис. 5).
Рис. 4. Относительный уровень экспрессии
генов StCLE4 и StCLE10 при пересадке
растений со среды с азота на среду без
азота. **, p<0,01. Рис.5. Относительный уровень экспрессии геновStCLE4, StCLE5 и StCLE10 припересадке растений со среды с азота на среду без азота. **, p<0,01; *, p<0,05. 3. Анализ активности промоторов генов StCLE4 и StCLE10 у картофеля. Для анализа активности промоторов генов StCLE4 и StCLE10 были выделены промоторные участки этих генов (3 и 1.7 тысячи нуклеотидов до старт-кодона, соответственно). Далее промоторные области генов StCLE4 и StCLE10 были помещены в вектор pBGWFS7 перед геном GUS, кодирующим фермент глюкуронидазу, который обуславливает синее окрашивание при взаимодействии со специфическим субстратом (Van den Eede et al., 1992). Мы трансформировали растения картофеля полученными конструкциями с помощью A. rhizоgenesдляполучениякомпозитныхрастенийстрансгеннымикорнями. Трансформированные растения выращивали на среде с азотом и без азота. Мы показали, что промоторы анализируемых генов более активны при росте растений на среде азотом (Рис. 6), что согласуется с данными об экспрессии генов StCLE4 и StCLE10 в присутствии азота в среде. AБ ВГ Рис. 6. Анализ активности промоторов генов StCLE4 (А, Б) и StCLE10 (В, Г) в корнях картофеля. А, В - Корни картофеля, растущего на среде с азотом (+N) и без азота (-N). Б, Г - Срезы корней картофеля, растущего на среде с азотом. Промоторы активны в проводящем цилиндре корня. Итак, анализ активности промоторов генов StCLE4 и StCLE10 в трансгенных корнях картофеля подтвердил наши данные об активации экспрессии этих генов в ответ на повышение концентрации азота. Активность промоторов обоих генов была выявлена в центральном цилиндре корня, предположительно – в проводящих тканях. Так как образование клубней зависит от содержания азота в среде, то имело смысл изучить вовлеченность регуляторов клубнеобразования в азотный сигналинг. В работе Sharma et al. 2016 был проведен транскриптом столонов картофеля, в которых была индуцирована экспрессия гена BEL5, кодирующего транскрипционный фактор (ТФ), стимулирующий клубнеобразование. В случае экспрессии BEL5 происходило накопление транскриптов большого количества генов, в том числе StCLE4, в промоторной области которого обнаружены сайты посадки BEL5 - тандемные последовательности TGAC. 4. Проверка взаимодействия ТФ BEL5 с промоторной областью гена StCLE4. Для проверки предположения о том, что ТФ BEL5 непосредственно регулирует транскрипцию гена StCLE4, мы использовали метод дрожжевой одногибридной системы (Yeast One-Hybrid Assay (Y1H)). Для ее проведения были созданы конструкции, несущие кодирующую последовательность StBEL5 и промоторные участки генов StCLE4 и StSP6A. В качестве положительного контроля использовали промотор гена StSP6A (promStSP6A), взаимодействие которого с ТФ BEL5 было показано с помощью метода сдвига электрофоретической подвижности (EMSA) (Sharma et al., 2016). В качестве отрицательных контролей использовались плазмиды pDEST22 и pHisLeu без вставок. Внашемэкспериментебыло подтверждено взаимодействие ТФ StBEL5 с промотором StSP6A, однако взаимодействия StBEL5 с промоторной областью StCLE4 не было обнаружено (Рис. 7). Таким образом, исходя из результатов нашего анализа, ТФ StBEL5, вероятно, напрямую не регулирует экспрессию гена StCLE4. Рис. 7. Проверка взаимодействия ТФ BEL5 с промоторной областью гена StCLE4 (promStCLE4) с помощью Y1H. Дрожжи выращивали на средах DDO и TDO с различными концентрациями ингибитора биосинтеза гистидина - 3-Amino-1,2,4- triazole (3-AT) - 2мМ, 5мМ и 10мМ. Поиск генов CLE участвующих в ответе на нехватку воды. Нехватка воды у картофеля приводит к уменьшению роста побегов, урожая клубней – в связи с задержкой инициирования клубней, снижению количества и веса клубней. Мы обнаружили ген, экспрессия которого ассоциирована с нехваткой воды у картофеля: экспрессия StCLE23 возрастала в 10 раз в условиях дефицита воды (Рис. 8). Рис. 8. Относительный уровень экспрессии гена StCLE23 в условиях дефицита воды. *, p<0,05. Поиск генов CLE участвующих в утолщении клубня. 1. Поиск у картофеля гомологов генов CLE резуховидки, участвующих в росте утолщением. При анализе последовательностей генов StCLE у картофеля были выявлены гомологи генов AtCLE41 и AtCLE44 резуховидки, участвующих в росте утолщением, в числе которых ген StCLE8. CLE-домен пептида StCLE8 оказался идентичен пептиду TDIF резуховидки, который является продуктом генов AtCLE41 и AtCLE44. В настоящее время имеются данные об участии пептидов группы TDIF в утолщении побегов и корней, в частности – при формировании стволов древесных растений (Yue et al., 2020) и при развитии запасающих корней (Gancheva et al., 2016). Также, по транскриптомным данным мы обнаружили накопление транскриптов гена StCLE8 в ходе развития клубня (Рис. 3). В связи с этим, мы предположили, что пептид StCLE8 может участвовать в регуляции роста утолщением при формировании клубня картофеля. 2. Анализ активности промотора гена StCLE8 у картофеля. Для анализа активности промотора гена StCLE8 была выделена промоторная область этого гена в ~1800 нуклеотидов. Мы поместили эту промоторную область в вектор pHm43GW перед геном, кодирующим зеленый флуоресцентный белок (GFP) с сигналом ядерной локализации. Таким образом, в клетках, в которых активен промотор гена StCLE8, мы видели флуоресцирующие зеленым ядра. Мы обнаружили активность промотора гена StCLE8 и в клубнях, и в столонах картофеля (Рис. 9). В столонах сигнал GFP детектируется в клетках, сопровождающих сосуды ксилемы, а в клубне - в клетках перимедуллярной зоны и в клетках, находящихся на периферии перимедуллярной зоны. Согласно литературным данным, основную роль в формировании клубня картофеля играет перимедуллярная зона, деления в которой продолжаются до тех пор, пока клубень не достигнет своего окончательного размера (Xu et al., 1998). Гомолог StCLE8 у резуховидки выполняет роль регулятора делений клеток камбия - меристемы, обеспечивающей рост утолщением. Обнаружение активности промотора гена StCLE8 в клетках перимедуллярной зоны клубня картофеля позволяет предположить, что пептид StCLE8 мог взять на себя функцию регулятора делений этой зоны. Рис. 9. Анализ активности промотора гена StCLE8 в столоне и клубне трансгенных растений картофеля. А – Продольный срез столона картофеля. Б - Поперечный срез клубня картофеля. Стрелками указаны ядра, в которых детектирован сигнал GFP. 4. Изучение влияния измененного уровня экспрессии гена StCLE8 на развитие картофеля. Для изучения функций гена StCLE8 его поместили в вектор pK7WG2D под контроль конститутивного промотора 35S вируса мозаики цветной капусты. Такой промотор обеспечивает возрастание экспрессии находящихся под ним генов в сотни раз во всех трансформированных тканях растения. При трансформации картофеля штаммом A. tumefaciens, несущим такую конструкцию, были получены растения со сверхэкспрессией StCLE8: наиболее высокие уровни экспрессии StCLE8 демонстрировали растения под номерами 8#1, 8#4 и 8#27 (Рис. 10). StCLE8 Рис. 10. Относительные уровни экспрессиигенаStCLE8в растениях,несущихвставку 35S::StCLE8 (8# номер растения) по сравнению с экспрессией в контрольныхрастениях.В качестве материала были взяты верхушкирастений~1см, растущих in vitro. Все растения со сверхэкспрессией StCLE8 демонстрировали разрастание проводящих пучков в побеге (Рис. 11), как это было ранее показано при сверхэкспрессии генов, кодирующих CLE пептиды группы TDIF, на резуховидке (Smit et al., 2020; Etchells и Turner, 2010) и редисе (Gancheva et al., 2016; Ганчева и др., 2018). Пучки разрастаются из-за активных делений клеток камбия, деления которых при сверхэкспрессии StCLE8 происходят неупорядоченно, в сравнении с четко ориентированными периклинальными делениями клеток камбия в контроле. Как и у резуховидки и редиса, у картофеля видимые изменения при сверхэкспрессии гена, кодирующего пептид TDIF, коснулись только проводящих пучков, что вероятно связано с рецепторами этих пептидов, которые расположены на мембранах клеток камбия. Также при сверхэкспрессии StCLE8 пропадают одревесневшие клетки паренхимы как в ксилеме, так и во флоэме; сходный эффект наблюдался на редисе при сверхэкспрессии гена RsCLE41, кодирующего пептид TDIF (Gancheva et al., 2016; Ганчева и др., 2018). Рис. 11. Разрастание проводящих пучков в стебле картофеля со сверхэкспрессией гена StCLE8 (регенерант 8#24) (Б) по сравнению с контролем (А). Проводящие пучки обведены голубой линией. с - сосуды, оп - одревесневшая паренхима, к - камбий. Срезы растений окрашены 1% сафранином. Общий вид растений со сверхэкспрессией StCLE8 также отличался от контроля (Рис. 12): трансгенные растения формировали нерассеченные темно-зеленые листья, характеризовались замедленным ростом и более поздним формированием клубней. Помимо этого, у трансгенных растений наблюдалось активное образование столонов и клубней в узлах, а длина междоузлий увеличивалась (Рис. 12, 13). Вместе с тем, масса клубней у растений со сверхэкспрессией гена StCLE8 была значимо меньше, чем у контрольных (Рис. 13). В клубнях трансгенных растений также было выявлено разрастание проводящих пучков (Рис. 14). В целом, можно заметить, что почти все события, происходящие при утолщении клубня, напоминают развитие проводящего пучка со сверхэкспресией StCLE8 – неупорядоченные деления клеток и отсутствие одревесневшей паренхимы. АБ 5 см5 см Рис. 12. Внешний вид контрольного растения (А) и растения со сверхэкспрессией гена StCLE8 (регенерант 8#24) (Б). Рис. 13. Масса клубней и длина междоузлий контрольных растений и растений со сверхэкспрессией гена StCLE8 (StCLE8ое). ***, p<0,001. АБ Рис. 14. Формирующиеся проводящие пучки в перимедуллярной зоне клубня контрольного растения (А) и растения со сверхэкспрессией гена StCLE8 (Б). Итак, данные, полученные при анализе эффекта сверхэкспрессии гена StCLE8 на развитие картофеля, подтверждают наше предположение о роли этого гена как регулятора деления клеток камбия: сверхэкспрессия StCLE8 действительно вызывала разрастание проводящих пучков в стебле картофеля (в ~1,7 раз у регенеранта 8#24), связанное с увеличением активности камбия. Наличие активности промотора гена StCLE8, увеличение экспрессии гена StCLE8 в клубне, а также разрастание проводящих пучков в клубне со сверхэкспрессией StCLE8, позволяют предположить, что StCLE8 может быть участником образования такой структуры, как клубень, и даже, возможно, активировать деление клеток перимедуллярной зоны. Вместе с тем, полученные нами эффекты сверхэкспрессии StCLE8, такие как замедление развития растений и снижение массы клубня, свидетельствуют о том, что сверхэкспрессия этого гена в целом растении не является способом увеличения урожайности картофеля: вероятно, для получения ожидаемого эффекта требуется более точное воздействие, например, активация экспрессии StCLE8 в отдельных тканях клубня в результате помещения его под тканеспецифичный промотор (например, под промотор одного из генов, активных преимущественно в перимедуллярной зоне клубня). ЗАКЛЮЧЕНИЕ В этой работе мы изучали вовлеченность пептидов CLE в три процесса — регуляцию утолщения клубня картофеля, ответ на нехватку воды и на содержание азота в среде (Рис.15). В первую очередь, мы идентифицировали 42 гена картофеля, кодирующих пептиды CLE и присутствующих почти у всех проанализированных видов картофеля, как диких, так и культурных. Среди генов Solanum tuberosum StCLE мы выявили вероятных регуляторов ответа на изменение содержания азота (StCLE4 и StCLE10), ответа на дефицит воды (StCLE23) и регулятор утолщения клубня (StCLE8). Для гена StCLE8 было также проведено изучение эффекта сверхэкспрессии на развитие растений и формирование клубней. Выявленные отличия трансгенных растений со сверхэкспрессией StCLE8 от контроля подтверждают роль этого гена в контроле активности камбия и развитии проводящих пучков, а также свидетельствуют о том, что сверхэкспрессия StCLE8 на уровне целого растения не может быть использована как способ повышения урожайности картофеля. Рис. 15. Предполагаемая схемарегуляции развитияклубняу картофеля с помощью пептидов CLE. Пептиды CLE4иCLE10 образуются в ответ на наличие азота в среде и могутвлиятьна клубнеобразование. Пептид CLE8 участвует в утолщении клубня. ПептидCLE23 образуется в ответ на нехватку воды. ВЫВОДЫ 1. В геномах картофеля выявлено 42 гена CLE. В последовательностях белков CLE картофеля присутствует только один домен CLE. Консенсусная последовательность доменов CLE картофеля отличается от консенсусных последовательностей доменов CLE резуховидки и томата, но также демонстрирует 6 наиболее консервативных аминокислот. 2. Промоторы генов Solanum tuberosum StCLE4 и StCLE10 активны в проводящих тканях корня картофеля, и их активность увеличивается в ответ на повышение уровня азота в среде. 3. Экспрессия гена StCLE23 возрастает в корне картофеля в условиях дефицита воды. 4. Ген StCLE8 экспрессируется в тканях клубня, ответственных за утолщение: проводящих пучках и перимедуллярной зоне. Его экспрессия возрастает при утолщении клубня. Сверхэкспрессия гена StCLE8 вызывает разрастание проводящих пучков и нарушение их упорядоченного строения, подавление одревеснения ксилемной и флоэмной паренхимы, образование столонов и клубней в узлах и снижение массы клубней. 5. Не выявлено взаимодействие транскрипционного фактора BEL5 с промоторной областью гена StCLE4.