«Характеристика кариотипа иммуностимулированных В-лимфоцитов больных хроническим лимфолейкозом»

Характеристика больных
В исследование включено 92 больных ХЛЛ, 65 мужчин и 27 женщин (соотношение
мужчины : женщины составляет 2,4:1) в возрасте от 30 до 86 лет (медиана возраста 58 лет),
которые в период с ноября 2015 по май 2019 года наблюдались в клинических подразделениях
ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России: консультативном гематологическом отделении
с дневным стационаром по проведению интенсивной высокодозной химиотерапии (зав.
отделением – к.м.н. Моисеева Т.Н.), отделении интенсивной высокодозной химиотерапии
лимфом с круглосуточным и дневным стационарами (зав. отделением – д.м.н. Звонков Е.Е.),
отделении интенсивной высокодозной химиотерапии гемобластозов с круглосуточным и
дневным стационарами (зав. отделением – к.м.н. Кравченко С.К.), отделении интенсивной
высокодозной химиотерапии гематологических заболеваний с круглосуточным и дневным
стационарами (зав. отделением – к.м.н. Грибанова Е.О.), отделении интенсивной высокодозной
химиотерапии гемобластозов и депрессий кроветворения с круглосуточным и дневным
стационарами (зав. отделением – к.м.н. Троицкая В.В.), а также в дневном стационаре
Московского городского гематологического центра (зав. отделением – д.м.н. Никитин Е.А.).
Диагноз ХЛЛ устанавливали на основании данных клинического анализа крови и
иммунофенотипического исследования (ИФТ) согласно рекомендациям Международной
рабочей группы по изучению ХЛЛ (iwCLL). ХЛЛ диагностировали при выявлении более 5000
моноклональных В-лимфоцитов в 1 мкл периферической крови и наличии В-клеточных
антигенов CD19, CD20, CD22, CD79b в сочетании с Т-клеточным маркером CD5 и CD23 на
поверхности опухолевых В-лимфоцитов. Стадии заболевания определяли по системе Binet.
Общий анализ крови, иммунохимическое исследование белков сыворотки крови и
иммунофенотипическое исследование крови выполнялось в централизованной клинико-
диагностическойлабораторииФГБУ«НМИЦ гематологии» Минздрава России(зав.
лабораторией–к.м.н.ДвирныкВ.Н.),мутационныйстатусгеновтяжелойцепи
иммуноглобулинов – в лаборатории молекулярной гематологии (исследование выполнено ст. н.с.,
к.б.н. Бидерман Б.В., зав. лабораторией – д.б.н. Судариков). 21 больному клинический анализ
крови и ИФТ крови проводили по месту жительства.
В лаборатории кариологии ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России всем больным
выполнялисьстандартноецитогенетическоеисследование(СЦИ)ифлуоресцентная
гибридизация in situ (FISH) (зав. лабораторией к.м.н. Обухова Т.Н.). 18 пациентам с
несбалансированнымиперестройкамибылапроведенамногоцветнаяфлуоресцентная
гибридизация in situ (mFISH), из них 6 пациентам выполнен многоцветный анализ хромосомных
сегментов (mBAND). Сравнительная геномная гибридизация выполнена на базе ФГБУ «НМИЦ
акушерства, гинекологии и перинатологии имени В.И. Кулакова» в рамках обучающего
семинара.
У 4 больных ХЛЛ синхронно протекал с другими гематологическими заболеваниями. У 2
больных выявлен ХЛЛ в сочетании с миелодиспластическим синдромом с трансформацией в
острый миелоидный лейкоз, у 2 больных – сочетание ХЛЛ и лимфомы маргинальной зоны. У
одного пациента в анамнезе отмечено состояние после полихимиотерапии по поводу лимфомы
Ходжкина.
На момент цитогенетического исследования стадия А определена у 23 (25%) больных,
стадия В – у 52 (56,5%) и стадия С – у 17 (18,5%) больных. Концентрация β2-микроглобулина в
сыворотке крови была определен у 37 (40,2%) пациентов, из них концентрация β2-
микроглобулина более 3,5 мг/л была определена у 19 пациентов. Исследование мутационного
статуса генов тяжелой цепи иммуноглобулинов (IGHV) проведено 63 больным, вариант без
мутаций генов IGHV определен у 48 (52,2%) больных. Иммунофенотипическое исследование
крови на наличие CD38 выполнено 62 больным, наличие антигена CD38 на поверхности
опухолевых В-лимфоцитов выявлено у 41 (44,6%) больного. Определение группы риска больных
ХЛЛ по международному прогностическому индексу (МПИ) было возможным для 31 больных
при наличии информации о всех лабораторных показателях: делеции 17р, мутационном статусе
генов IGHV, концентрации β2-микроглобулина. Группа низкого риска определена у 4, группа
промежуточного риска – у 9, группа высокого риска – у 13, группа очень высокого риска – у 5
больных. Данные клинических параметров представлены в таблице 1.
Таблица 1. Клинико-лабораторная характеристика больных ХЛЛ, включенных в
исследование.
ПараметрыКоличество больных, N (%)
Количество больных92
Пол:
мужчины65 (70,7)
женщины27 (29,3)
Медиана возраста,58 (30-86)
лет (диапозон)
Стадия ХЛЛ по Binet:
А23 (25,0)
B/C69 (75,0)
β2-микроглобулин (мг/л):
≤ 3,518 (19,6)
> 3,519 (20,6)
нет данных55 (59,8)
Мутационный статус генов
IGHV:
мутированный вариант15 (16,3)
немутированный вариант48 (52,2)
нет данных29 (31,5)
Иммунофенотипическое
исследование крови:
наличие CD3841 (44,6)
отсутствие CD3821 (22,8)
нет данных30 (32,6)
Группа риска по МПИ:
низкая4 (4,4)
промежуточная9 (9,8)
высокая13 (14,1)
очень высокая5 (5,4)
нет данных61 (66,3)

СЦИ и FISH-исследование были выполнены всем 92 больным: 49 больным до начала
терапии и 43 больным на этапе терапии, из них 36 больным в прогрессии заболевании и 4
больным на момент развития рецидива. Терапия больных ХЛЛ включала разные схемы лечения:
иммунохимиотерапию(FCR,FCR-lite,FR,R-CHOP),иммунотерапию(монотерапию
ритуксимабом и бендамустин с ритуксимабом), таргетными препаратами (ибрутиниб,
венетоклакс).
4 пациентам цитогенетическое исследование проводилось двукратно, 3 из них СЦИ
проводили до начала терапии и на момент прогрессии заболевания, одному пациенту – до начала
терапии и после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). Одному больному
исследование проводили троекратно: до лечения, после окончания курса химиотерапии и на
момент прогрессии заболевания. Таким образом, всего выполнено 97 исследований.
Материал исследования
Методом СЦИ с использованием DSP30 и интерлейкина-2 было проведено 97 серий
исследований. Для выполнения СЦИ культивировали клетки периферической крови в 44
(46,5%) исследованиях, мононуклеары периферической крови – в 8 (8,3%), одновременно
клетки периферической крови и мононуклеары – 24 (24,7%), клетки костного мозга – в 17
(17,2%), одновременно клетки костного мозга и мононуклеары (выделены из костного мозга) –
в 3 (3%), клетки биоптата лимфатического узла – в одном исследовании.
Методом СЦИ с использованием LPS и TPA было проведено 85 исследований. Для
выполнения СЦИ культивировали клетки периферической крови в 53 (62,4%) исследованиях,
одновременно клетки периферической крови и мононуклеары – в 19 (22,4%), клетки костного
мозга – в 11 (13,8%), клетки костного мозга и мононуклеары (выделены из костного мозга) – в
2 (2,3%) исследованиях.
Для проведения FISH-исследования в 93 случаях использовали мононуклеары,
выделенные из клеток периферической крови, и в 4 случаях – мононуклеары, выделенные из
клеток костного мозга.
Методы исследования
СЦИ с использованием DSP30 в сочетании с IL2 и FISH-исследование выполняли в 97
случаях (Рисунок 1). СЦИ с 2 комбинациями митогенов: DSP30 в сочетании с IL2 (DSP30+IL2) и
LPS с TPA (LPS+TPA) проводили в 85 случаях. Для каждого пациента проводили серию культур
(1-4) в зависимости от количества материала и целесообразности. На начальных этапах работы
проводилипараллельноекультивированиемононуклеарныхклетоксDSP30+IL2и
культивирование клеток периферической крови с LPS+TPA у каждого больного (1 и 3 серии). В
дальнейшем при достаточной клеточности образца проводили 4 серии культур: культивирование
клеток крови (костного мозга) и выделенных мононуклеарных клеток с DSP30+IL2 и LPS+TPA
(1, 2, 3, 4 серии). После анализа промежуточных результатов СЦИ культивировали только клетки
периферической крови (костный мозг, биоптат лимфоузла) с DSP30+IL2 и LPS+TPA (2 и 3
серии). Всего количество культур серии 1 составило 32, серии 2 – 89, серии 3 – 85, серии 4 – 21.
Взятие периферической крови, костного мозга проводилось в пробирки с гепарином
лития, биоптат лимфоузла – в пробирки с гепарином лития с транспортной средой (питательная
среда RPMI 1640 с гентамицином). Выделение мононуклеаров периферической крови и костного
мозга проводили на градиенте плотности 1,077 раствора Lympho Separation Medium (LSM, “ICN
Biomedicals”).
Для проведения СЦИ клеточный материал (кровь, костный мозг, мононуклеары, клетки
биоптата лимфоузла) из расчета 2 млн. ядросодержащих клеток на 10 мл среды RPMI 1640 c
добавлением эмбриональной телячьей сыворотки в соотношении 4:1, L-глутамина в конечной
концентрации 0,584 мг/мл, антибиотика гентамицина в конечной концентрации 0,28 мг/мл
культивировали с двумя комбинациями митогенов: (1) DSP30+IL2 – иммуностимулятором
деления олигонуклеотидом DSP30 в конечной концентрации 2 нмоль/мл (TibMolBiol, Германия)
и интерлейкином-2 (IL2, Sigma-Aldrich, США) в конечной концентрации 200 Ед/мл; (2) LPS+TPA
– стимулятором деления В-лимфоцитов липополисахаридом LPS E.coli (Sigma, США) в конечной
концентрации 0,01 мг/мл и ТРА в конечной концентрации 0,01 нг/мл (Sigma, США). Суспензию
клеток инкубировали при температуре 370С в течение 72 часов, последние 17 часов с
добавлением колцемида 0,15 мкг/мл. Затем проводили обработку гипотоническим раствором и
фиксацию клеток по стандартной методике. G-дифференциальную окраску хромосом выполняли
по методике Seabright с модификациями [Seabright M., 1971]. Изображение метафазных
пластинок получали с помощью платформы Metafer (MetaSystems, Германия). Хромосомный
анализ проводили с помощью программного обеспечения Ikaros.

Рисунок 1. Алгоритм цитогенетического исследования у больных ХЛЛ.
Всем больным проводилось FISH-исследование. Для выявления трисомии 12 и делеций
11q22, 13q14, 17p13 в работе использовали многоцветный зонд LSI p53 / LSI ATM and LSI
D13S319 / LSI 13q34 / CEP 12 Multi-color Probe производителя Abbott (“Vysis”, США с
добавлением LSI гибридизационного буфера.
У 7 больных ХЛЛ при выявлении в кариотипе транслокаций, затрагивающих локус
генов тяжелой цепи иммуноглобулинов (IGH), проводили дополнительное FISH-исследование
для подтверждения перестройки локуса 14q32/IGH c ДНК-зондом LSI IGH Dual Color Break
Apart Rearrangement Probe производителя Metasystems (Германия). У одного больного для
подтверждения частичной трисомии 12 и делеции длинного плеча хромосомы 5 были
проведены FISH-исследования с соответствующими ДНК-зондами XL MDM2 (12q15) XL
5q31/5q33/5p15 производителя Metasystems (Германия). Двум больным выполнено FISH-
исследование для подтверждения/исключения перестройки локуса гена BCL6/3q27 с ДНК-
зондом LSI BCL6 (ABR) Dual Color Break Apart Rearrangement Probe производителя Abbott
(США). 5 больным по результатам mFISH было проведено дополнительное FISH-исследование
для подтверждения перестройки локуса гена MYC с использованием зонда LSI IGH/MYC/CEP
8 Tri-color FISH Probe Kit производителя Abbott (США). 4 больным для исключения
транслокации t(11;14)(q13;q32) применялся зонд LSI IGH/CCND1 DF FISH Probe Kit
производителя Abbott (США). FISH-исследование проводили по протоколу фирмы-
производителя. Для каждого зонда анализировали по 200 интерфазных ядер с четкими
сигналами. Определены границы нормальных значений для каждой пробы многоцветного
зонда и других проб. Анализ препаратов проводили с помощью флуоресцентного микроскопа
Axioscope (Carl Zeiss, Германия) и программного обеспечения для анализа флуоресцентных
сигналов Isis (MetaSystems, Германия).
18пациентамсвыявленнымиприкариотипированиинесбалансированными
перестройками при наличии достаточного биоматериала была выполнена многоцветная
флуоресцентная гибридизация in situ (mFISH), из них 6 пациентам выполнен многоцветный
анализ хромосомных сегментов (mBAND). В качестве материала для проведения mFISH- и
mBAND-исследований использовали DSP30-стимулированную клеточную культуру. Реакцию
mFISH проводили с использованием 24-цветного зонда 24XCyte (MetaSystems, Германия).
Дальнейшиепроцедурымногоцветнойфлуоресцентнойгибридизациивыполнялив
соответствии с рекомендациями производителя.Для постановки реакции mBAND
использовались ДНК-зонды mBand XCyte (MetaSystems, Германия) к хромосомам 11, 12, 13.
Для визуализации и анализа результатов применяли программное обеспечение Isis
(MetaSystems, Германия). Результаты mFISH и mBAND оценивались в 2 до 20 метафаз, в
среднем в 10 метафазах.
Одному пациенту выполнена сравнительная геномная гибридизация (aCGH). Для
выполнения aCGH выделение ДНК из препарата мононуклеарных клеток, полученных ранее
для FISH-исследования, проводили с использованием набора innuPREP DNA/RNA MiniKit
(Analytik Jena, Германия). Микроматричный анализ был выполнен на оборудовании InnoScan
710 (Innopsys Inc., CША) с помощью микроматрицы высокой плотности CytoSure Constutional
v3 8х60К array (OGT, Великобритания). Референсная мужская ДНК для анализа была взята от
компании OGT (Великобритания). Определение вариаций числа копий ДНК (CNVs)
проводилось по данным измерения интенсивности сигнала с зондов от референсной и
исследуемой ДНК, гибридизованных на слайде. Данные были обработаны с помощью
программы CytoSureTM Interpret Software. Патогенные вариации числа копий ДНК были
оценены в клинической базе DECIPHER v11.0.
Результаты СЦИ, FISH, mFISH, mBAND, aCGH описывали согласно Международной
цитогеномной номенклатуре ISCN, 2020. В соответствии с Европейскими рекомендациями по
цитогеномному анализу гематологических новообразований при выявлении клональных
аберраций анализировали не менее 10 митозов [Rack K.A., 2019]. Кариотип описывали в
соответствии с Международной цитогеномной номенклатурой ISCN, 2020. Комплексный
кариотип определяли при выявлении любых 3 и более клональных хромосомных нарушений.
Статистические понятия и методы исследования
Статистическая обработка данных проводилась с использованием методов описательной
статистики, частотного, регрессионного анализа и событийного анализа. Работа выполнена
совместно с сотрудниками информационно-аналитического отдела ФГБУ «НМИЦ гематологии»
Минздрава России (зав. к.т.н. Куликов С.М.). Расчеты проводили с помощью программы для
статистической обработки данных SAS 9.4 и GraphPad Prism 6. Для оценки результатов
частотного анализа использовали критерий χ2 (хи-квадрат), для сравнения очень малых выборок,
в которых число случаев составляет меньше 10, применяли точный критерий Фишера. Для
парного сравнения количественных данных использовали критерий знаковых рангов Вилкоксона
(Уилкоксона), для попарного сравнения категориальных данных – критерий Мак-Немара.
Результаты регрессионного анализа оценивались с помощью коэффициента детерминации R2.
Лог-ранг критерий применяли для оценки статистической значимости различий в группах. При
анализе общей выживаемости стартовой точкой считалась дата проведения цитогенетического
анализа и датой последнего контакта считалась датой последнего визита к врачу или дата
последнего проведенного анализа. Различия считались достоверно значимыми при p < 0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Сравнительный анализ результатов СЦИ с использованием DSP30 в сочетании с IL2 и стандартной комбинации митогенов Всего выполнено 97 исследований с использованием при культивировании СpG- олигонуклеотида DSP30 в сочетании с IL2 (DSP30+IL2), из них в 26 случаях проведено параллельное культивирование клеток крови (костного мозга) и мононуклеарных клеток одного образца. В 85 исследованиях проводили СЦИ с использованием В-клеточных митогенов: LPS и TPA (LPS+TPA), из них в 21 случаяв параллельно культивировали клетки крови (костного мозга) и мононуклеаров. В сравнительный анализ были включены результаты культивирования клеток периферической крови и костного мозга с DSP30+IL2 и с LPS+TPA у 76 больных. При сравнении результатов культивирования с DSP30+IL2 биоматериала разного клеточного состава (кровь/костный мозг и мононуклеарные клетки) выявлены достоверные различия в митотической активности клеток (наличии делящихся клеток): среднее значение количества митозов при культивировании клеток крови/костного мозга и мононуклеаров составило 13,6 и 8,2, соответственно (р = 0,035), однако по количеству митозов с аберрациями результаты культивирования достоверно не различались (р = 0,382). Согласно Европейским рекомендациям по цитогеномному анализу гематологических новообразований при выявлении клональных аберраций должно быть проанализировано не менее 10 митозов. При культивировании мононуклеаров среднее количество митозов составило 8,2. В связи с этим, в дальнейшем при СЦИ фракция мононуклеарных клеток не использовалась. Анализ результатов культивирования биоматериала разного клеточного состава с LPS+TPA не выявил достоверных различий в митотической активности клеток, в количестве митозов с аберрациями и количестве выявленных аберраций, однако, также отмечалось снижение общего количества митозов и % митозов с аберрациями в культуре мононуклеарных клеток, что послужило основанием для использования при культивировании только клеток крови или костного мозга на дальнейших этапах исследования. Таблица 2. Результаты СЦИ с использованием DSP30+IL2 и LPS+TPA у больных ХЛЛ. ПоказателиDSP30+IL2LPS+TPAр Наличие митозов, (%)81,6 (62/76)85,5 (65/76)0,5348 Аберрантный кариотип, (%)82,3 (51/62)44,6 (29/65)<0,0001 %митозовсаберрациями,59,0 ± 4,923,0 ± 4,0<0,0001 среднее ± SE* количество аберраций,2,9 ± 0,41,5 ± 0,4<0,0001 среднее ± SE* * SE (standard error) – стандартная ошибка среднего значения Сравнительный анализ результатов параллельного культивирования клеток крови или костного мозга с двумя комбинациями митогенов с DSP30+IL2 и LPS+TPA показал достоверно высокую частоту выявления аберрантного кариотипа при специфической стимуляции DSP30 и IL2, в том числе количестве митозов с аберрациями и количестве выявленных аберраций (р<0,0001) (Таблица 2). Методом СЦИ с DSP30+IL2 митозы получены у 62 из 76 (81,6%) больных, из них аберрантный кариотип выявлен в 51 из 62 (82,3%) случаев. В среднем на кариотип больного количество митозов с аберрациями составило 59,3% и количество выявленных аберраций - 2,9. Аналогично, методом СЦИ с LPS+TPA митозы получены у 65 из 76 (85,5%) больных, из них аберрантный кариотип выявлен в 29 из 65 (44,6%) случаев. В среднем на кариотип больного количество митозов с аберрациями составило 23,0% и количество выявленных аберраций - 1,5. Частота характерных для ХЛЛ хромосомных нарушений при культивировании с DSP30+IL2 и LPS+TPA достоверно не различалась для делеции 11q22 – 30,6% и 16,9% (р = 0,107); для трисомии 12 – 12,9% и 6,2% (р = 0,194); для делеции 17р13 - 20,0% и 13,8% (р = 0,289). Делеция 13q14 достоверно чаще выявлялась в культуре DSP30+IL2 по сравнению с LPS+TPA – 16,1% и 4,6%, соответственно (р = 0,041), также комплексные нарушения кариотипа с ≥ 3 аберрациями – 40,0% и 18,5%, соответственно (р = 0,004) (Таблица 3). Таблица 3. Частота детекции хромосомных нарушений при культивировании с DSP30+IL2 и LPS+TPA у больных ХЛЛ. ХромосомныеDSP30+IL2,LPS+TPA,р нарушения с% (количество) случаев,% (количество) случаев, вовлечениемN=62N=65 11q2230,6 (19)16,9 (11)0,107 12q12,9 (8)6,2 (4)0,194 13q1416,1 (10)4,6 (3)0,041 17p1321,0 (13)13,8 (9)0,289 комплексный кариотип41,9 (26)18,5 (12)0,0004 (≥ 3 аберраций) Для графического изображения зависимости количества аберраций от способа культивирования с DSP30+IL2 и LPS+TPA использовались логарифмические шкалы по оси абсцисс и ординат, на которых значение «-3» соответствовало нулю - отсутствию аберраций (Рисунок 2). При анализе графика были выделены три области, при которых: 1) значения по оси абсцисс (количество аберраций в культуре DSP30+IL2) и ординат (количество аберраций в культуре LPS+TPA) были равными «-3», что соответствовало отсутствию выявленных аберраций в двух культурах DSP30+IL2 и LPS+TPA. В этой области значений было определено 10 случаев отсутствия хромосомных нарушений в двух культурах. 2)значения определялись по одной прямой (пунктирная линия проведена условно), что соответствовало случаям выявления хромосомных нарушений в двух культурах DSP30+IL2 и LPS+TPA. В этой области значений было определено 28 случаев выявления хромосомных нарушений в двух культурах. Исключением являлся один случай обнаружения хромосомного нарушения только в культуре LPS+TPA - на графике это соответствовало значению «-3» на оси абсцисс и «0» по оси ординат. 3)значения по оси ординат были равными «-3», а значению по оси абсцисс ≥ 0, что соответствовало случаям детекции хромосомных нарушений, выявленных только при культивировании с DSP30+IL2 (область под условно проведенной прямой линией). В этой области значений было определено 18 случаев хромосомных нарушений, выявленных только в культуре DSP30+IL2. Кроме того, у 5 больных с выявленными хромосомными нарушениями в культуре с DSP30+IL2 отсутствовали митозы в культуре LPS+TPA. Так была выделена группа с дополнительными хромосомными нарушениями, выявленными только при культивировании с DSP30+IL2 – 23 случая. Рисунок2.Графикзависимостиколичествадетектируемыхаберрацийотспособа культивирования с DSP30+IL2 и LPS+TPA. Группа дополнительно выявленных хромосомных нарушений в культуре DSP30+IL2 Для того, чтобы охарактеризовать группу с дополнительно выявленными хромосомными нарушениями (группа 1), проведено сравнение данной группы с группами больных с нормальным кариотипом (группа 2) и аберрантным кариотипом, определяемым одновременно в двух культурах DSP30+IL2 и LPS+TPA (группа 3). У 8 из 18 (44,4%) больных в культуре с LPS+TPA хромосомные аберрации были выявлены только в одной из 20 метафаз, что не позволяло их расценивать как клональные нарушения, при этом в культуре с DSP30+IL2 они обнаружены в среднем в 59,2% метафаз. В дополнительной группе одно хромосомное нарушение было выявлено у 7 из 23 (30,4%), два хромосомных нарушения – у 4 (17,4%) и комплексные нарушения кариотипа – у 12 (52,2%). В этой группе хромосомные нарушения с вовлечением локуса 11q22 были определены в 8 (34,8%), 12q – в 2 (8,7%), 13q14 – в 7 (30,4%), делеция 17p13 – в 4 (17,4%) случаях. Проведен анализ общей выживаемости (ОВ) в трех группах: с дополнительно выявленными аберрациями (N=21), с нормальным кариотипом (N=10) и аберрантным кариотипом (N=28) (Рисунок 3). Достоверно значимых различий ОВ в трех группах пациентов не выявлено (р = 0,286), однако обнаружена тенденция к снижению показателей ОВ в группе 3, и самые низкие показатели ОВ выявлены в группе 1. На сроке наблюдения 32 месяца ОВ больных с нормальным кариотипом составила 100%, с аберрантным кариотипом – 85,7%, в группе дополнительных хромосомных нарушений - 76,1%. В трех группах пациентов медиана не достигнута. Рисунок 3. ОВ в трех группах больных ХЛЛ с нормальным кариотипом, с аберрантным кариотипом и дополнительно выявленными хромосомными нарушениями в культуре DSP30+IL2. Частотный анализ, отражающий взаимосвязь трех групп с клинико-биологическими параметрами, показал, что по клиническим и биологическим характеристикам группа 1 занимает промежуточное положение между группами 2 и 3. Наиболее наглядно это отражает частотный анализ, проведенный по категориям: стадии по Binet, мутационный статус генов IGHV, статус заболевания на момент исследования. В группе 2 преобладали больные со стадией А (40%) и В (40%), с вариантом без мутаций генов IGHV (57,1%), которые были обследованы преимущественно до лечения (90%). Группу 3 в основном составили пациенты со стадией В (78,6%), с вариантом без мутаций генов IGHV (81,3%), более половины из которых были обследованы в прогрессии или рецидиве заболевания (56,5%). В группе 1 преобладали больные со стадией В (47,8%) и в равном количестве со стадией А (26,1%) и С (26,1%), с вариантом без мутаций генов IGHV (69,2%), из которых в прогрессии и рецидиве заболевания составили 43,5% больных. Анализ спектра и частоты встречаемости хромосомных аберраций у больных ХЛЛ до начала терапии и в прогрессии и рецидиве заболевания В группу больных до начала терапии было включено 49 больных, из них при СЦИ митозы получены у 39 из 49 (79,6%) больных. В группе больных с резистентным и рецидивирующим течением, включающей 43 пациента, при культивировании митозы получены у 38 из 43 (88,4%) больных. У 4 больных были выполнены повторные цитогенетические исследования как до терапии, так и в прогрессии на фоне лечения. Кариотип оценивался по результатам СЦИ с использованием при культивировании DSP30+IL2 биоматериала разного клеточного состава. Сравнительный анализ результатов СЦИ, проведенный у больных ХЛЛ до начала терапии и в прогрессии/рецидиве заболевания, показал достоверные различия в частоте выявления аберрантного кариотипа, 74,4% (29/39) и 94,7% (36/38), соответственно (р = 0,025) (Таблица 4). Таблица 4. Частота встречаемости хромосомных аномалий у больных ХЛЛ до начала терапии и в прогрессии/рецидиве заболевания. ХромосомныеЧастота выявления вЧастота выявления вр нарушениягруппе больных догруппе больных в начала терапии, %,прогрессии/рецидиве (количество) больныхзаболевания, %, N=39(количество) больных N=38 с вовлечением локуса 30,8 (12)31,6 (12)0,815 11q22 трисомия 1215,4 (6)13,2 (5)0,375 c вовлечением локуса 17,9 (7)15,8 (6)1,000 13q14 c вовлечением локуса 10,3 (4)31,6 (12)0,026 17p13 сбалансированные 15,4 (6)14,3 (6)1,000 транслокации несбалансированные 25,6 (10)45,2 (16)0,153 перестройки комплексный кариотип 30,8 (12)55,3 (21)0,039 (≥3 аберраций) с вовлечением локуса 30,8 (12)31,6 (12)0,815 11q22 При сравнении частоты детекции делеций в характерных точках разрыва 11q22, 13q14, 17p13 и трисомии 12 выявлены достоверные различия только по частоте выявления 17p13 и комплексныхнарушенийкариотипа.Вгруппахбольныхдоначалатерапииив прогрессии/рецидиве заболевания частота выявления хромосомных нарушений с вовлечением 17p13 составила 10,3% и 31,6% (р = 0,026) и комплексного кариотипа – 30,8% и 55,3%, соответственно (р = 0,039). Вгруппебольныхдоначалатерапиивыявленыхромосомныеаберрации: сбалансированные транслокации, в том числе с вовлечением генов IGH - t(2;14)(p14-15;q32), несбалансированные перестройки с участием локусов 3q27, 7q22, 8p23, 8q24, 11p14, 15q26, 22p13, делеции 1q31 и 3p13, 8q22, моносомия по хромосоме 12. У больных в прогрессии/рецидиве заболевания определены хромосомные нарушения: сбалансированные транслокации, в том числе c вовлечением генов IGH - t(8;14)(q24;q32), t(14;19)(q32;q13), несбалансированные перестройки с вовлечением локусов 2q31 и 2q37, 4p15-p16, 6p25, 6q27, 7p21-22, 9p11-p21, 12p13, 14q32, 16p13 , 19q13, 22q13, делеции 1q22, 1q23, 1q36, 1q42, 2р21 и 3q13, 4q34, 6q13-q14 и 6q21-22, 9p21-p22, 21q21, и моносомии по хромосомам Y, 1, 3, 4, 6, 8, 10, 11, 17, 18, 21, 22. В двух группах больных ХЛЛ выявлены повторяющиеся хромосомные нарушения: несбалансированные перестройки с вовлечением локусов 2q27-q31, 4q35, 15р13, 16q24 и 22q13, делеции 4q22-q23 и 14q21-q22, моносомии по хромосомам 4, 8, 10 и 18. По частоте выявления сбалансированных и несбалансированных перестроек две анализируемые группы достоверно не различались. Повторные СЦИ были выполнены 3 больным: до начала терапии и в прогрессии заболевания. До начала терапии у одного больного выявлена изолированная трисомия и у двух больных - комплексные нарушения кариотипа. В прогрессии ХЛЛ у 3 больных были выявлены дополнительные хромосомные аномалии – моносомии по хромосомам 8 и 17, делеция короткого плеча хромосомы 3, несбалансированные перестройки с вовлечением локусов 6q27, 9p11, что было связано с клональной эволюцией заболевания. Одному пациенту СЦИ было проведено перед началом терапии и после проведения трансплантации ГКС. Перед трансплантацией в кариотипе были выявлены комплексные нарушения кариотипа, после трансплантации определен нормальный кариотип. Сопоставление результатов СЦИ с использованием DSP30 в сочетании с IL2 и FISH- исследования Проанализированы результаты СЦИ с использованием при культивировании DSP30+IL2 и FISH-исследования у 92 больных. При культивировании с DSP30 и IL2 митозы получены в 77 из 92 (83,7%) случаях. Хромосомные аберрации выявлены у 65 из 77 (84,4%) больных. Хромосомные нарушения при FISH-исследовании были определены у 75 из 92 (81,5%), из них одна аберрация выявлена у 57 из 75 (76,0%), две аберрации - у 14 (18,7%), три аберрации - у 3 (4,0%) больных. Сравнение результатов СЦИ и FISH проводили у тех пациентов, у которых имелись митозы. Хромосомные нарушения с вовлечением 11q22 трисомия 12 с вовлечением 13q14 * с вовлечением 17р13 0%10%20%30%40% FISHСЦИ * достоверно значимые различия, р = 0,021 Рисунок 4. Частота характерных хромосомных аберраций, выявленных при СЦИ и FISH у пациентов с успешными результатами культивирования. При СЦИ и FISH частота хромосомных нарушений составила: 11q22 – 31,2% и 33,8%, трисомии 12q – 14,3% и 13,0%; 13q14 – 16,9% и 35,1%, 17p13 – 20,8% и 22,1%, соответственно (Рисунок 4). Сравнительный анализ результатов культивирования с DSP30+IL2 и FISH- исследования показал достоверно высокую частоту выявления делеции 13q14 при FISH, чем при СЦИ, 35,1% и 16,9%, соответственно (р = 0,021). Частота хромосомных аберраций с вовлечением 11q22 и 17p13, выявленных методами СЦИ и FISH, достоверно не различалась. Комплексные нарушения кариотипа при культивировании были выявлены у 33 из 77 (42,6%), при FISH-исследовании – у 3 из 92 (3,7%) больных. Сопоставимые различия были получены в выявлении комплексного кариотипа методом CЦИ и FISH - 42,6% и 4,1% (р<0,0001). У 17 из 77 (22,1%) больных выявленные при FISH делеции 13q14, 11q22 и 17p13 по результатам СЦИ сопровождались только сбалансированными или несбалансированными транслокациями в этих локусах: у 2 больных в кариотипе выявлены несбалансированные транслокации с вовлечением локуса 11q22; у 2 обнаружены сбалансированные транслокации и 3 больных несбалансированные транслокации с участием локуса 13q14, у 10 определены несбалансированные перестройки с вовлечением 17р. В 11 из 77 (14,3%) случаях при кариотипировании в разных цитогенетических клонах выявлены хромосомные аберрации – делеции, сбалансированные и несбалансированные транслокации с вовлечением локусов 13q14 и 17p13 (Рисунок 5). У одного больного с трисомией 12, выявленной при FISH-исследовании, одна из хромосом 12 была вовлечена в t(12;18)(q10;p10). У одного пациента при отсутствии трисомии по результатам FISH в культуре с DSP30+IL2 выявлена несбалансированная t(12;16)(q14;q23) – случай частичной трисомии 12 (наличие дополнительного длинного плеча хромосомы 12), подтвержденный при FISH с использованием ДНК-зонда к локусу гена MDM2/12q15. 50СЦИ количество больных del 11q22tri 12del 13q14del 17p13 делециянесбалансированные t сбалансированные t аберрантный кариотипнормальный кариотипнет митозов трисомия 12частичная трисомия 12моносомия Рисунок 5. Сопоставление результатов CЦИ с использованием DSP30+IL2 и FISH-исследования у больных ХЛЛ. Из 15 больных с отсутствием митозов при СЦИ хромосомные аберрации методом FISH выявлены у 13 (86,7%): одна аберрация выявлена у 10 (66,7%) и две аберрации – у 3 (20,0%). В данной группе выявлены делеция 11q22 в 2 случаях, делеция 13q14 – в 8 случаях, из них биаллельная делеция 13q14 – в 2 случаях, сочетание делеции 11q22 и трисомии 12 – в одном случае, сочетание делеции 11q22 и делеции 13q14 – в одном случае, сочетание делеции 13q14 и делеции 17р13 – в одном случае. Из 12 пациентов с нормальным кариотипом по результатам культивирования с DSP30+IL2 выявлены хромосомные аберрации методом FISH у 5 (41,7%): делеция 11q22 – 1 случай, делеция 13q14 – 4 случая. Из 17 случаев отсутствия хромосомных нарушений при FISH-исследовании были выявлены хромосомные нарушения в культуре с DSP30+IL2 в 8 (47,1%), среди них комплексные нарушения кариотипа (3 случая), транслокации с вовлечением генов IGH - t(6;14)(p12;q32) и t(14;19)(q32;q13) (2 случая), частичная трисомия 12q (1 случай), сбалансированная t(4;12)(p16;q13) (1 случай) и делеция 6q22 (1 случай). При выявлении аберрантного кариотипа методом FISH дополнительные хромосомные аберрации при культивировании были определены у 19, среди них комплексный кариотип выявлен у 15 больных. Дополнительные методы исследования (mFISH, mBAND, aCGH) В кариотипе у 7 из 77 (9,1%) больных выявлены сбалансированные транслокации, затрагивающие локус генов IGH (14q32). В 3 случаях выявлена транслокация t(14;19)(q32;q13), в остальных участвовали локусы партнерских хромосом: 8q24, 6p11, 9q13, 2p14. Во всех 7 случаев перестройка локуса гена IGH/14q32 подтверждена методом FISH. В18случаяхсвыявленнымиприкариотипированиинесбалансированными перестройками (в 12 из них в составе КК) проведено исследование методом mFISH, в 6 случаях из них дополнительно проведено исследование mBAND. По результатам mFISH в 12 случаях выявлен дополнительный хромосомный материал (2q, 3q, 4q, 7q, 8q, 9р, 12р, 12q, 20q); в 7 случаях несбалансированные транслокации сопровождались делециями (Хq, 8р, 10q, 13q, 16р, 17p). У 3 пациентоввыявленыдицентрическиехромосомы(3;4)(p10;p10),(11;17)(p15;p11.1), (12;17)(p13;p13).У2пациентовобнаруженысбалансированныеt(6;17)(q22;p13), t(11;12)(q14.1;q24), тогда как при СЦИ были определены делеции 6q22, 11q22, дериваты хромосом 12 и 17. В 5 случаях несбалансированных транслокаций с участием хромосомы 8 при mFISH выявлена дупликация 8q c увеличением копий гена MYC/8q24 по данным FISH. У 3 больных с транслокациями с вовлечением хромосомы 13 методом mBAND идентифицирован участок делеции - 13q14.1q22. Выявленные при СЦИ маркерные хромосомы определены с помощью mFISH как несбалансированные транслокации с участием ≥2 хромосом. По результатам mFISH и mBAND КК с ≥5 аберрациями выявлен дополнительно у 3 пациентов. По результатам mFISH и mBAND выделены две наиболее многочисленные группы: транслоцированные хромосомные дупликации без делеции хромосомных партнеров (6/26, 23,1%) и несбалансированные транслокации с делециями (12/26, 46,2%), которые были представлены в кариотипе дополнительным хромосомным материалом (add) или маркерными хромосомами. Не выявлено достоверных различий между группами с дупликациями хромосом с делецией или без нее (p<0,145). Остальные группы были небольшими и представлены дицентрическими хромосомами (3/26), сбалансированными транслокациями (3/26), инверсией (1/26), делециями (1/26). Каждая несбалансированная перестройка рассчитывалась как единичный случай (всего 26 случаев). У одного больного с делецией 13q, определяемой при СЦИ и FISH, были выявлены дополнительные хромосомные нарушения с помощью сравнительной геномной гибридизации (aCGH), по результатам которой были подтверждены делеция локуса 13q14 в двух аллелях и делеция региона 13q13.1q34 в одном аллеле, делеция локуса гена IGH - 14q32.33 и дополнительно выявлены дупликация региона 3q26.1q29 и делеция локуса 22q11.22. Таким образом, c помощью комбинации молекулярных (aCGH) и молекулярно-цитогенетических методов (СЦИ, FISH) выявлены интерстициальная делеция 13q14 в одном аллеле, несбалансированная транслокация t(3;13)(q26;q13) с делецией теломерного участка хромосомы 13 – региона 13q34 в другом аллеле, частичная делеция локуса гена IGH/14q32. Связь отдельных и комплексных нарушений кариотипа с клиническими и биологическими факторами прогноза В группе больных со сбалансированными транслокациями достоверной связи с возрастом, со стадией заболевания по Binet, мутационным статусом генов IGHV, концентрацией β2- микроглобулина, наличием CD38-положительных клеток, комплексными нарушениями кариотипа не выявлено. У пациентов с выявленными в кариотипе несбалансированными перестройками достоверно чаще была установлена стадия B или C по Binet (р = 0,006) и определен вариант без мутаций генов IGHV (р = 0,032). Несбалансированные нарушения достоверно чаще обнаруживались в составе комплексного кариотипа (р<0,001). В группе больных с комплексными нарушениями кариотипа выявлена достоверная взаимосвязь со стадией заболевания и мутационным статусом генов IGHV: достоверно чаще в группе больных с комплексным кариотипом диагностировали стадию B или С по Binet (р=0,025) и вариант без мутаций генов IGHV (р=0,045). Достоверной связи с возрастом, концентрацией β2- микроглобулина, наличием CD38-положительных клеток не выявлено. Анализ общей выживаемости в зависимости от наличия комплексного кариотипа Показано, что общая выживаемость (ОВ) больных с комплексными нарушениями кариотипа достоверно хуже, чем у больных без нарушений (р = 0,0232). На сроке наблюдения 32 месяца показатели ОВ больных с комплексными нарушениями кариотипа и без нарушений составили – 76,7% и 90,0% соответственно. В группе больных c комплексным кариотипом медиана выживаемости составила 24 месяца и в группе больных без комплексных нарушений кариотипа медиана не достигнута (Рисунок 6). Рисунок 6. ОВ в группе больных ХЛЛ с комплексными нарушениями кариотипа и без них. ВЫВОДЫ 1.Эффективность стандартного цитогенетического исследования у больных ХЛЛ достоверно выше при использовании олигонуклеотида DSP30 в сочетании с IL2, чем при использовании стандартных митогенов LPS и TPA: аберрантный кариотип выявлен у 82,9% и 44,6% больных, соответственно (р<0,0001). В культуре опухолевых клеток, стимулированных DSP30 с IL2, количество метафаз с хромосомными аберрациями и количество выявленных аберраций в среднем достоверно превышало таковые в культуре со стандартными митогенами. 2.Показано, что комплексные нарушения кариотипа ассоциированы с ухудшением общей выживаемости больных ХЛЛ (р=0,023): медиана общей выживаемости в группе больных с комплексными нарушениями кариотипа составила 24 месяца, тогда как в группе без них медиана не достигнута. Комплексный кариотип достоверно чаще выявлялся при культивировании с DSP30 и IL2, чем при культивировании с В-клеточными митогенами и при FISH-исследовании – 42,0%, 18,5% (р=0,0004) и 4,1% (р<0,0001), соответственно. 3.Частота выявления аберрантного кариотипа и комплексного кариотипа достоверно значимо увеличивается в прогрессии и рецидиве ХЛЛ по сравнению с частотой выявления до начала терапии - 94,7% и 74,4% (р = 0,025) и 55,3% и 30,8% (р = 0,039), соответственно. 4.Несбалансированные перестройки и комплексный кариотип достоверно чаще выявлялись у больных без мутаций генов IGHV и с продвинутыми стадиями по Binet. Несбалансированные перестройки достоверно чаще определялись в составе комплексного кариотипа (р<0,0001). 5. При сочетанном использовании стандартного цитогенетического исследования и FISH- исследования значительно увеличивается частота выявления хромосомных аберраций (90,2%). Кариотипирование с DSP30 и IL2 не заменяет FISH-исследование, но является необходимым методом, позволяющим дополнительно выявлять хромосомные аберрации: частичную трисомию 12 (1,3%), сбалансированные и несбалансированные транслокации, сопровождающиеся делециями в локусах 17р13/TP53, 13q14 и 11q22/АТМ по результатам FISH (22,1%), комплексные нарушения кариотипа (42,6%). ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Рекомендуется включить в протокол обследования больных ХЛЛ стандартное цитогенетическое исследование с использованием DSP30 и интерлейкина-2 и FISH-исследование до начала терапии и в прогрессии/рецидиве заболевания для выявления дополнительных параметров для стратификации больных на группы риска и выбора адекватной терапии.