Значение экспрессии рSTAT3, pAKT1, pSyk при диффузной В-крупноклеточной лимфоме

Исследования проведены в период с 2012 по 2018 гг. на базе Федерального
государственногобюджетногоучреждениянауки«Кировскийнаучно-
исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального
медико-биологическогоагентства»(ФГБУНКНИИГиПКФМБАРоссии,
директор – д-р.мед.наук. И. В. Парамонов).
В научную работу было включено 100 пациентов с впервые установленным
диагнозом ДВККЛ, получавших терапию 1 линии по схеме R-CHOP. Диагностику
заболевания проводили в соответствии с Классификацией опухолей кроветворной и
лимфоидной тканей Всемирной организации здравоохранения 2008-2017 гг. [H.
Swerdlow,2017].Дляпроведенияисследованийиспользовалипервичный
биологический материал, полученный до начала лечения. Характер и тяжесть
процесса оценивали ретроспективно с помощью врачей клинико-диагностического
отделения гематологии и химиотерапии по клиническим данным историй болезни и
амбулаторногонаблюдения,включающимжалобы,анамнез,физикальные,
лабораторные и инструментальные методы исследования (руководитель С. В.
Самарина).
Медиана (Ме) возраста обследованных составила 59 лет. Распределение
больных по полу было сопоставимым (49 – мужчин, 51 – женщина). У большей
части пациентов (59 из 100) в дебюте заболевания регистрировались В-симптомы, у
41 больного они отсутствовали. В 60% случаев болезнь диагностирована на
распространенных стадиях (III-IV), в 40% – на I-II стадиях. Стадирование ДВККЛ
проводили согласно классификации Ann Arbor. Общее состояние пациентов
оценивали по шкале ECOG (Eastern Cooperative Oncology Group) [И. В. Поддубная,
2018]. У подавляющей части больных (95 обследованных) соматический статус
соответствовал значениям 0-1 и 2 баллам.
Все обследуемые стратифицированы на 2 группы согласно бальной системе
оценки МПИ. Преобладали пациенты с низкими и промежуточно низкими
значениями прогностического индекса (группа 1, n=55), меньшую долю составили
больные с промежуточно высоким и высоким риском (группа 2, n=45). Полный
ответ на терапию 1 линии R-CHOP достигнут в 62 случаях, неудачи терапии
зарегистрированы у 38 пациентов. За период наблюдения летальный исход
констатирован у 35 обследуемых, продолжают наблюдение 65 больных.
В качестве материала для исследования использовали архивные образцы
(парафиновые блоки) лимфоузлов или других, вовлеченных в патологический
процесс органов, а также материал послеоперационных биопсий. Гистологическую и
иммуногистохимическую верификацию диагноза ДВККЛ выполняли врачи-
специалистылабораториипатоморфологии(заведующийлабораторией–
канд.мед.наук. Д. А. Дьяконов). Все препараты окрашивали гематоксилином и
эозином стандартным способом [Д. С. Саркисов, 1996]. С помощью световой
микроскопии в приготовленных срезах оценивали гистологическую структуру и
морфологиюклеток,входящихвсоставбиоптата,сидентификацией
морфологических вариантов заболевания.
Постановку иммуногистохимических (ИГХ) реакций осуществляли непрямым
пероксидазным методом по стандартной методике в соответствии с протоколом для
систем визуализации EnVISION (DAB+, «Dako»), с использованием широкой
диагностической панели антител. Для детекции рSTAT3, рАКТ1 и рSyk в
опухолевых клетках гистологические срезы инкубировали с соответствующими
моноклональными антителами. ИГХ подтип опухоли определяли на основании
алгоритма C. P. Hans. В 35 случаях установлен GCB-подтип ДВККЛ, в 65 – non-
GCB. У всех больных количественно оценивали экспрессию антигенов c-Myc,
BCL2 и р53 на опухолевых клетках. Подсчет доли опухолевых клеток,
экспрессирующих белки рSTAT3, рАКТ1 и рSyk в гистологических срезах
проводили морфометрическим способом, с помощью двойного «слепого» анализа
на световом микроскопе «AxioScope.A1» (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Германия) со
встроенной фото/видеокамерой и программным обеспечением анализа изображений.
Статистическуюобработкуданныхосуществлялисприменением
статистической программы IBM SPSS Statistics 26. В работе использовали
определение Ме с интерквартильным размахом [Q1-Q3], критерий хи-квадрат (χ2)
Пирсона, точный двусторонний критерий Фишера (F), критерий Манна-Уитни.
Пятилетнюю ОВ и БПВ анализировали по методу Каплана-Мейера с графическим
построением соответствующих кривых и расчетом логарифмического рангового
критерия(log-rank test). С целью выявления независимых факторов прогноза
ДВККЛ применяли метод регрессии Кокса. Оптимальный пороговый уровень
экспрессии для каждого из исследуемых биомаркеров устанавливали с помощью
ROC-анализа. Различия между показателями считали статистически значимыми при
p<0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Характеристика экспрессии pSTAT3, pАКТ1, рSyk и определение ее порогового уровня у больных ДВККЛ В опухолевом субстрате больных ДВККЛ определена ядерная локализация экспрессиибелковpSTAT3ирАКТ1.ПриизучениирSykвыявлен цитоплазматическийтипегораспределениявнеопластическихклетках (рисунок 1). а)б)в) Рисунок 1 – а) ядерная экспрессиия pSTAT3; б) ядерная экспрессиия рАКТ1; в) цитоплазматическая экспрессия рSyk Для всех биомаркеров были характерны выраженные колебания процентного содержания позитивных лимфоидных элементов в биоптатах. С помощью ROC-анализа установлено оптимальное пороговое значение относительного количества опухолевых клеток, экспрессирующих анализируемые белки (рисунок 2). Для pSTAT3 оно составило 68%, для рАКТ1 — 70%, для рSyk — 28%. р STAT3,р АКТ1,р Syk, порог 68%порог 70%порог 28% попопо Рисунок 2 - ROC-кривые для маркеров: pSTAT3 (а), рАКТ1 (б), pSyk (в) С учетом данных значений всех обследуемых разделили на 2 группы: первую составилипациентысдолейпозитивно-маркированныхВ-лимфоцитов, превышающей пороговый уровень (высокая или гиперэкспрессия), вторую - больные, у которых относительное число экспрессирующих клеток было ниже порогового значения (низкая экспрессия). Провели сопоставительный анализ с биологическими параметрами опухоли, а такжевыраженностью клинических проявлений заболевания. Взаимосвязь экспрессии pSTAT3, рАКТ1, pSyk с морфологией неопластических клеток, иммуногистохимическими подтипами опухоли, экспрессией онкобелков c-Myc, p53, BCL2 В результате анализа установлен ряд закономерностей, которые в основном были связаны с особенностями экспрессии биомаркеров рSTAT3 и рАКТ1 (рисунок 3). Выявлено достоверное преобладание гиперэкспрессии рSTAT3 у пациентов с non-GCB вариантом ДВККЛ по сравнению с обследуемыми, имевшими GCB подтип заболевания (р=0,020; ОR=2,7; 95% CI=1,03-2,65). Схожие результаты получены при исследовании рАКТ1. Низкая выраженность данного маркера в 1,7 разачащевыявляласьприкрупноклеточнойлимфомегерминального происхождения, чем при non-GCB варианте патологического процесса. Напротив, гиперэкспрессия рАКТ1 статистически значимо превалировала у пациентов с non-GCB подтипом заболевания (р=0,003; ОR=3,9; 95% CI=1,55-9,95). гиперэкспрессия pSTAT3низкая экспрессия pSTAT3гиперэкспрессия pАКТ1низкая экспрессия pАКТ1 62%63% 77% р=0,020р=0,003 38%54% 37% 46% 23% non-GCBGCBnon-GCBGCB Рисунок 3 - Распределение вариантов экспрессии рSTAT3 и рАКТ1 в группах пациентов с разными ИГХ подтипами ДВККЛ На основании полученных данных можно заключить, что высокий уровень экспрессии биомаркеров pSTAT3, рАКТ1 ассоциируется с прогностически неблагоприятным non-GCB подтипом ДВККЛ. При анализе pSyk межгрупповых различий не обнаружено. Изучена возможная взаимосвязь исследуемых молекул сигнальных путей с характером экспрессии белков c-Myc, р53 и BCL2 (таблица 1). Установлено, что надпороговая экспрессия pSTAT3 почти в 2 раза чаще определялась в группе пациентов с уровнем c-Myc≥40%, чем у больных с более низкой степенью выраженности данного онкобелка (р=0,015; ОR=3,9; 95% CI=1,33-11,8). Частота встречаемости гиперэкспрессии pSTAT3 была значительно выше у больных с р53-позитивным статусом, чем у обследуемых с низкой экспрессией р53 (р=0,010; ОR=2,8; 95% CI=1,1-2,4). При изучении рАКТ1 определено, что его высокая экспрессия достоверно чаще регистрировалась в группе пациентов с уровнем c-Myc≥40% в сравнении с больными, имевшими экспрессию c-Myc<40% (р=0,014; ОR=3,8; 95% CI=1,39-10,5). Гиперэкспрессия биомаркера в 1,9 раза чаще встречалась у обследуемых с относительнымсодержаниемр53-позитивныхопухолевыхклетокв биоптатах ≥30%, чем в группе пациентов с подпороговым уровнем р53 (р=0,008; ОR=3,0; 95% CI=1,33-7,01). Таблица 1 - Ассоциация рSTAT3, рАКТ1 с экспрессией белков с-Myc, р53 и BCL2 ОнкомаркерыЭкспрессия pSTAT3рЭкспрессия pАКТ1р ВысокаяНизкаяВысокаяНизкая n=53,n=47,n=43,n=57, абс.(%)абс.(%)абс.(%)абс.(%) 17 (77,3) 5 (22,7)15 (68,2) 7 (31,8) ≥40% c-Myc0,015*0,014* <40%36 (46,2)42 (53,8)28 (35,9)50 (64,1) ≥30%34 (65,4)18 (34,6)29 (55,8)23 (44,2) р530,010*0,008* <30%19 (39,6)29 (60,4)14 (29,2)34 (70,8) ≥50%32 (52,5)29 (47,5)25 (40,9)36 (59,1) BCL20,8920,610 <50%21 (53,8)18 (46,2)18 (46,2)21 (53,8) *- различия показателей статистически значимы (р<0,05) Таким образом, установлена ассоциация между гиперэкспрессией биомаркеров рSTAT3, рАКТ1 и высоким содержанием в опухолевых клетках транскрипционных факторов с-Myc и р53. Ассоциации pSTAT3, рАКТ1, pSyk с экспрессией BCL2, а также морфологией опухолевых клеток не установлено. Взаимосвязь экспрессии pSTAT3, рАКТ1, pSyk с клинико-лабораторными характеристиками заболевания Проанализированхарактерраспределениявариантовэкспрессии биомаркеров pSTAT3, рАКТ1, pSyk в группах пациентов с различной выраженностью проявлений патологического процесса. При этом наиболее значимые закономерности обнаружены для белка рАКТ1. Установлено, что низкая экспрессия данного маркера достоверно чаще встречалась среди больных, у которых ДВККЛ была выявлена на I и II стадиях (рисунок 4). Напротив, гиперэкспрессия белка преобладала у пациентов с III-IV стадиями заболевания (р=0,011; OR=0,3; 95% CI=1,11-3,38). Высокая экспрессия рАКТ1 значительно чаще выявлялась у обследуемых с МПИ˃2 баллов, по сравнению с больными, имевшими низкие значения этого показателя (р=0,007; OR=3,0; 95% CI=1,34-6,96). рАКТ1≥70%pАКТ1<70%рАКТ1≥70%pАКТ1<70% 69% 72% 58% р=0,01153%р=0,007 47%42% 31% 28% I-II стадияIII-IV стадияМПИ≤2МПИ˃2 Рисунок 4 - Ассоциация экспрессии рАКТ1 со стадиями заболевания и МПИ Выявлена взаимосвязь экспрессии рSTAT3 с уровнем лактатдегидрогеназы (ЛДГ)всывороткекровибольныхДВККЛ.Частотавстречаемости гиперэкспрессии белка достоверно выше у пациентов с высокой концентрацией фермента, чем у обследуемых с уровнем ЛДГ, соответствующим норме (р=0,033; OR=2,5; 95% CI=1,07-6,01). Для белков рАКТ1 и рSTAT3 отмечено, что их надпороговый уровень экспрессии преобладал в группе пациентов с частичным ответом, рецидивом или прогрессией заболевания, в сравнении с больными, достигшими полной ремиссии (р=0,019; ОR=2,7; 95% CI=1,17-6,16 и р=0,045; OR=2,3; 95% CI=1,01-5,38, соответственно; рисунок 5). рАКТ1≥70%pАКТ1<70%pSTAT3≥68%pSTAT3<68% р=0,04565% р=0,01966% 58%55% 42%45% 34%34% Полный ответПрогрессияПолный ответПрогрессия Рисунок 5 - Связь экспрессии рАКТ1 и рSTAT3 с ответом на лечение Таким образом, получены результаты, указывающие на взаимосвязь гиперэкспрессиибиомаркеровpSTAT3иpAKT1спрогностически неблагоприятными клинико-лабораторными характеристиками ДВККЛ. При изучении pSyk такой зависимости не обнаружено. Ассоциация монотипической экспрессии рSTAT3, рАКТ1, рSyk с общей и беспрогрессивной выживаемостью больных ДВККЛ В ходе исследования выявлена достоверная взаимосвязь экспрессии белка рSTAT3 с выживаемостью больных ДВККЛ, получавших лечение по протоколу R-CHOP (рисунок 6). Установлено, что 5-летняя ОВ в группе больных с гиперэкспрессией рSTAT3 соответствовала 54,7% (Ме=50 мес.) против 76,6% (Ме не достигнута) – с низкой экспрессией белка. У пациентов с высокой экспрессией маркера риск летального исхода был в 2,4 раза выше, чем у обследуемых с подпороговым уровнем рSTAT3 (p=0,015; HR=2,4; 95% CI=1,15-4,87). 76,6% n=47 72,3%, n=47 54,7%, n=5352,8% n=53 р=0,015р=0,011 а)б) Рисунок 6 – ОВ (а) и БПВ (б) больных ДВККЛ в зависимости от экспрессии рSTAT3 Значение БПВ у больных с гиперэкспрессией рSTAT3 было в 1,4 раза ниже по сравнению с группой обследуемых, имевших низкую степень выраженности биомаркера в опухолевой ткани: 52,8% (Ме=42 мес.) и 72,3% (Ме недостигнута), соответственно. Риск рецидива и/или рефрактерности к терапии в случаях с высокой выраженностью рSTAT3 был в 2,2 раза выше по отношению к пациентам с подпороговым уровнем его экспрессии (p=0,011; HR=2,2; 95% CI=1,14-4,41). Значимые межгрупповые различия установлены при оценке 5-летней ОВ в группах обследуемых с дифференцированной экспрессией рАКТ1 (рисунок 7). Показатели ОВ статистически значимо отличались в группах больных с высокой и низкой экспрессией маркера: 41,2% (Ме=21 мес.) и 82,5% (Ме не достигнута), соответственно). Риск наступления летального исхода у лиц с гиперэкспрессией рАКТ1 был в 5,7 раза выше, по сравнению с группой пациентов, у которых зарегистрированнизкийуровеньегоэкспрессии(p<0,001;HR=5,7; 95% CI=2,65-12,49). 65,1% , n=43 82,5%, n=43 39,7% , n=57 41,2% , n=57 р=0,003 р<0,001б) а) Рисунок 7 - ОВ (а) и БПВ (б) больных ДВККЛ в зависимости от экспрессии рАКТ1 В группе обследуемых с надпороговым уровнем экспрессии рАКТ1 показательБПВсоответствовал39,7%(Ме=41мес.)против65,1% (Ме не достигнута) у больных с низкой выраженностью маркера. При этом вероятность развития рецидива/прогрессии ДВККЛ у пациентов с гиперэкспрессией белка была в 2,7 раза выше (p=0,003; HR=2,7; 95% CI=1,42-5,33). Приведенные результаты свидетельствуют о том, что биомаркеры рАКТ1 и рSTAT3 являются предикторами неблагоприятного течения ДВККЛ. Статистически значимой ассоциации дифференцированной экспрессии рSyk с ОВ и БПВ не выявлено. Ассоциация сочетанной экспрессии рSTAT3, рАКТ1, рSyk с общей и беспрогрессивной выживаемостью больных ДВККЛ Изучено возможное влияние сочетанной экспрессии рSTAT3 и рАКТ1 на течение ДВККЛ. Самые низкие показатели 5-летней ОВ были характерны для сочетанной гиперэкспрессии указанных биомаркеров (рисунок 8). Наличие у пациентов такой комбинации увеличивало риск летального исхода в 5 раз, по сравнению с больными, имевшими другие варианты их совместной экспрессии. Напротив, наиболее высокая общая выживаемость (85%) зарегистрирована в случаях с одновременно низкой выраженностью указанных маркеров (р=0,001; HR=5,2; 95% CI=2,61-10,22). 85%, n=3474%, n=13 72%, n=25 77%, n=34 69%, n=13 64%, n=25 39%, n=28 32%, n=28 а)р=0,001б)р<0,001 Рисунок 8 – ОВ (а) и БПВ (б) выживаемость больных с различным сочетанием экспрессии рSTAT3 и рАКТ1 Схожие результаты получены при исследовании БПВ. Этот показатель в группе больных с сочетанной гиперэкспрессией рSTAT3 и рАКТ1 соответствовал 39% (Ме=17 мес.) и значительно превышал таковой у обследуемых с одновременно низкой выраженностью маркеров – 77% (Ме не достигнута). При этом риск наступления рецидива/прогрессии заболевания был выше в 3,5 раза по сравнению с другими комбинациями (р<0,001; HR=3,5; 95% CI=1,76-6,51). При изучении коэкспрессии рSTAT3 и рSyk наиболее низкая ОВ и БПВ зарегистрирована у обследованных с одновременной гиперэкспрессией указанных белков (рисунок 9). При данном сочетании маркеров вероятность наступления неблагоприятного события у пациентов при ОВ увеличивалась в 2,9 раза (р=0,003; HR=2,9; 95% CI=1,43-5,85), а при БПВ – в 2,3 раза (р=0,021; HR=2,3; 95% CI=1,14- 4,87) по сравнению с другими вариантами их совместной экспрессии. Проанализирована взаимосвязь экспрессии рАКТ1 и рSyk (рисунок 10). Наиболее высокая ОВ (90,2%; Ме не достигнута) зафиксирована в группе больных с одновременно низкой экспрессией указанных белков. 83%, n=2979%, n=29 63%, n=16 68%, n=3850%, n=38 63%, n=16 29%, n=1741%, n=17 а) р=0,003б)р=0,021 Рисунок 9 – ОВ (а) и БПВ (б) выживаемость больных с различным сочетанием экспрессии рSTAT3 и рSyk Данные статистически значимо отличались у пациентов с гиперэкспрессией обоих маркеров (ОВ=26,7%; Ме=10 мес.; р<0,001; HR=5,2; 95% CI=2,49-10,9). При оценке БПВ значение этого показателя в группе лиц с одновременной гиперэкспрессией рАКТ1 и рSyk соответствовало 40% (Ме=14 мес.) против 78,1% (Ме не достигнута) у обследуемых с подпороговым уровнем экспрессии белков (р=0,002; HR=3,3; 95% CI=1,54-7,30). 90,2%, n=41 78,1%, n=41 52%, n=29 60%, n=15 53%, n=15 55%, n=29 40%, n=15 26,7%, n=15 р<0,001р=0,002 а)б) Рисунок 10 – ОВ (а) и БПВ (б) выживаемость больных с различным сочетанием экспрессии рАКТ1 и рSyk Таким образом, установлено, что сочетанная гиперэкспрессия изученных биомаркеров оказывает более неблагоприятное влияние на прогноз заболевания по сравнению с их изолированной экспрессией. Это указывает на наличие тесной связи в функционировании различных сигнальных путей и существование синергических и модулирующих эффектов в отношении течения заболевания. Регрессионный анализ Кокса По результатам однофакторного анализа показателями, негативно влияющими на ОВ больных ДВККЛ, являлись: МПИ˃2, non-GCB подтип заболевания, экспрессия рSTAT3≥68%, рАКТ1≥70%, c-Myc≥40% и р53≥30%. Вероятность наступления неблагоприятного события при рSTAT3 ≥68% была в 2,4 раза выше, чем у обследуемых с низким уровнем экспрессии биомаркера (р=0,019). При гиперэкспрессии рАКТ1 риск развития летального исхода увеличивался в 5,7 раза в сравнении с пациентами, имевшими подпороговый уровень его выраженности (р<0,001). Факторами, значимо влияющими на БПВ больных, стали значение МПИ˃2, экспрессия рSTAT3 ≥68% и рАКТ1 ≥70%. При гиперэкспрессии рSTAT3 и рАКТ1 риск неблагоприятного события увеличивался в 2,2 (р=0,019) и 2,7 (р=0,003) раза, соответственно, по сравнению с пациентами, имевшими низкий уровень экспрессии маркеров. В результате многофакторного анализанезависимое неблагоприятное прогностическое значение в отношении ОВ установлено только для МПИ>2, а
также высокой экспрессии c-Myc и рАКТ1. В отношении БПВ – для МПИ>2 и
рАКТ1≥70% (таблица 2). Выявлено, что больные с гиперэкспрессией рАКТ1 имели
значительно более высокий риск летального исхода, а также рецидива/прогрессии
заболевания, чем пациенты с подпороговым уровнем выраженности белка
(р=0,016; HR=2,9 и р=0,031; HR=2,1, соответственно).
Таблица 2 – Результаты многофакторного регрессионного анализа Кокса
предикторов общей и беспрогрессивной выживаемости
ПараметрОВБПВ
HR95% CIpHR95% CIp
МПИ>24,01,79-8,530,001*4,82,28-10,32 0,001*
ИГХ подтип (non-GCB)1,90,83-4,580,125—
Продолжение таблицы 2

Экспрессия рSTAT31,00,44-2,420,9361,90,99-3,930,051
≥68%
Экспрессия рАКТ12,91,21-6,860,016*2,11,07-4,110,031*
≥70%
Экспрессия c-Myc ≥40%3,01,43-6,450,004*—
Экспрессия р53≥30%2,30,96-5,290,062—
*- различия показателей статистически значимы (р<0,05) Таким образом, биомаркер рАКТ1 является независимым фактором прогноза теченияДВККЛ.БелокрSTAT3неподтвердилсамостоятельного прогностического значения при этой патологии. Ассоциации экспрессии рSyk с течением заболевания в нашем исследовании не установлено. ВЫВОДЫ 1. Определены прогностически значимые пороговые уровни монотипической экспрессии биомаркеров pSTAT3 и pAKT1. Значения показателей >68% для
pSTAT3 и >70% для pAKT1 определяют неблагоприятный прогноз течения
заболевания.
2. Надпороговые значения экспрессии pSTAT3 и pAKT1 ассоциированы с
неблагоприятными клинико-биологическими характеристиками ДВККЛ:
распространеннымистадиями,повышеннойконцентрациейЛДГ,
значениями МПИ>2, non-GCB подтипом опухоли, гиперэкспрессией
онкобелков c-Myc, р53. Взаимосвязи указанных сигнальных молекул с
экспрессией белка BCL2, а также морфологией опухолевых клеток не
выявлено.
3. Биомаркер рАКТ1 является независимым фактором прогноза течения
ДВККЛ. Его гиперэкспрессия ассоциирована с увеличением риска
летального исхода и рецидивирующих/резистентных форм заболевания в
5,7 и 2,7 раза, соответственно.
4. Наиболее неблагоприятными в отношении прогноза ДВККЛ являются
комбинации сочетанной гиперэкспрессии изученных белков.
5. Ассоциации экспрессии белка рSyk с течением ДВККЛ не установлено.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Целесообразно включить в диагностическую панель определение уровня
экспрессии маркеров pSTAT3, pAKT1 в качестве дополнительного критерия
дляпрогнозированиянеблагоприятноготеченияДВККЛвдебюте
заболевания.
2. Для выявления групп высокого риска у пациентов с ДВККЛ, требующих
интенсификации лечения, рекомендуется исследование наличия/отсутствия
сочетанной гиперэкспрессии белков pSTAT3 и pAKT1в опухолевых клетках.