Список сокращений и условных обозначений………………………………………………….. 5
ВВЕДЕНИЕ ……………………………………………………………………………………………………….. 6
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ………………………………………………………………….. 14
1.1. Внеклеточная ДНК ………………………………………………………………………………….. 14
1.1.1. ВкДНК в биологических жидкостях человека ……………………………………….. 14
1.1.2. Формы вкДНК в кровотоке …………………………………………………………………… 16
1.1.3. ВкДНК при патологии ………………………………………………………………………….. 18
1.1.4. ВкДНК в крови онкобольных ……………………………………………………………….. 19
1.1.5. ГЦ-обогащенность вкДНК ……………………………………………………………………. 25
1.1.6. ВкДНК как DAMPs ………………………………………………………………………………. 25
1.2. ДНК-сенсоры ………………………………………………………………………………………….. 26
1.2.1. Toll-подобные рецепторы ……………………………………………………………………… 27
1.2.1.1. TLR9………………………………………………………………………………………………….. 31
1.2.1.2. TLR9 в контексте онкологических заболеваний ………………………………….. 33
1.2.1.3. NF-kB как стимулируемый TLR9 ядерный фактор ……………………………… 36
1.2.2. AIM2-подобные рецепторы …………………………………………………………………… 37
1.2.2.1. AIM2 …………………………………………………………………………………………………. 37
1.2.2.2. AIM2 в раковой клетке ………………………………………………………………………. 38
1.3. Методы подавления активности генов изучаемых ДНК-сенсоров …………….. 39
1.3.1. CRISPR/Cas9 ………………………………………………………………………………………… 39
1.3.1.1. Механизм CRISPR/Cas9 ……………………………………………………………………… 39
1.3.1.2. Использование технологии CRISPR / Cas9 в исследованиях биологии раковой
клетки и ДНК-сенсоров AIM2 и TLR9 ……………………………………………………………. 40
1.3.2. РНК-интерференция ……………………………………………………………………………… 42
1.3.2.1. Биологическая роль РНК-интерференции в живых организмах …………… 42
1.3.2.2. РНК-интерференция как метод целенаправленного подавления активности
конкретных генов ………………………………………………………………………………………….. 43
1.3.2.3. Механизм РНК-интерференции ………………………………………………………….. 44
1.3.2.4. РНК-интерференция применительно к раковым клеткам. ……………………. 46
1.4. Заключение по данным литературы …………………………………………………………. 47
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ …………………………………………………………… 49
2.1. Сбор образцов крови и выделение гДНК и вкДНК …………………………………… 49
2.2. Нерадиоактивная количественная гибридизация ……………………………………… 49
2.3. Культивирование клеток MCF7 ……………………………………………………………….. 51
2.4. Модельные вкДНК ………………………………………………………………………………….. 51
2.4.1. Получение ГЦ-богатых вставок и модификация исходных плазмид ………. 53
2.5. Флуоресцентная микроскопия …………………………………………………………………. 54
2.6. ПЦР в реальном времени …………………………………………………………………………. 55
2.7. РНК-интерференция ………………………………………………………………………………… 57
2.8. Экспериментальный нокаут генов при помощи технологии CRISPR/Cas9 … 58
2.8.1. Нокаутирование клеток MCF7 по гену TLR9 …………………………………………. 58
2.8.1.1. Подготовка плазмид …………………………………………………………………………… 58
2.8.1.2. Трансфекция в клетки MCF7 и отбор клонов ………………………………………. 60
2.8.2. Нокаутирование клеток MCF7 по гену AIM2 ………………………………………… 61
2.8.2.1. Подготовка плазмид …………………………………………………………………………… 61
2.8.2.2. Выбор наиболее эффективной направляющей РНК …………………………….. 63
2.8.2.3. Трансфекция в клетки MCF7 и отбор клонов ………………………………………. 63
2.9. Определение уровня 8-oxodG ………………………………………………………………….. 64
2.10. Определение уровня АФК ……………………………………………………………………… 64
2.11. Метод ДНК-комет …………………………………………………………………………………. 65
2.12. Проточная цитофлуориметрия ……………………………………………………………….. 66
2.13. Статистическая обработка ……………………………………………………………………… 66
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ………………………………………………… 67
3.1. Сравнение уровня вкДНК и содержания в ней рДНК у больных РМЖ и у здоровой
контрольной группы………………………………………………………………………………………. 67
3.2. Проникновение ГЦ-богатых модельных вкДНК в клетку MCF7 ……………….. 72
3.2.1. Способность ГЦ-богатых последовательностей вкДНК проникать в клетки MCF7
……………………………………………………………………………………………………………………… 72
3.2.2. Проникновение вкДНК в клетки MCF7 в условиях дополнительного
окислительного стресса …………………………………………………………………………………. 75
3.2.3. Оценка уровня АФК в MCF7 после внесения модельных ГЦ-богатых вкДНК
……………………………………………………………………………………………………………………… 79
3.2.4. Оценка уровня экспрессии NOX4………………………………………………………….. 82
3.2.5 Уровень и локализация 8-oxodG в клетках MCF7 после воздействия вкДНК87
3.2.6. Изменение биогенеза рибосом в клетках MCF7 после внесения ГЦ-богатых
модельных вкДНК, содержащих в своем составе рДНК………………………………….. 92
3.2.7. Оценка уровня 8-oxodG в используемых модельных вкДНК. …………………. 93
3.3. Формирование адаптивного ответа и повышение выживаемости клеток MCF7 под
воздействием ГЦ-богатых модельных вкДНК ………………………………………………… 96
3.3.1. Повреждение ДНК в клетках MCF7 и последующая репарация ДНК при внесении
вкДНК в среду……………………………………………………………………………………………….. 97
3.3.1.1. Оценка уровня повреждений ДНК в клетках MCF7 после повторного внесения
модельных вкДНК ……………………………………………………………………………………….. 101
3.3.2. Остановка клеточного цикла в MCF7 при внесении ГЦ-богатой вкДНК в среду
……………………………………………………………………………………………………………………. 103
3.3.3. Изменение экспрессии генов, участвующих в репарации клетки, про – и
антиапоптотических генов и генов, влияющих на выживаемость клеток MCF7 при
действии ГЦ-богатой вкДНК ……………………………………………………………………….. 105
3.3.4. Активация транскрипционного фактора NF-kB при внесении модельных ГЦ-
богатых вкДНК ……………………………………………………………………………………………. 108
3.3.5. Активация фактора транскрипции STAT3 при взаимодействии клеток MCF7 с ГЦ-
богатой вкДНК …………………………………………………………………………………………….. 111
3.4. Изучение роли ДНК-сенсоров TLR9 и AIM2 в реализации биологической активности
вкДНК в отношении клеток MCF7 ……………………………………………………………….. 113
3.4.1. Исследование взаимозависимости ДНК-сенсоров TLR9 и AIM2 ………….. 113
3.4.2. Изменение уровня экспрессии ДНК-сенсоров при внесении ГЦ-богатой модельной
вкДНК …………………………………………………………………………………………………………. 115
3.4.3. Исследование взаимозависимости экспрессии ДНК-сенсоров TLR9 и AIM2 с
использованием метода РНК-интерференции ……………………………………………….. 120
3.4.4. Исследование роли ДНК-сенсоров TLR9 и AIM2 в реализации действия вкДНК на
клетки MCF7 при экспериментальном нокауте с применением технологии CRISPR/Cas9
……………………………………………………………………………………………………………………. 122
3.4.4.1. Изменения уровня транскрипционной активности генов TLR9 и AIM2 и
экспрессии белков ДНК-сенсоров в культурах MCF7, нокаутированных по TLR9 и AIM2
……………………………………………………………………………………………………………………. 122
3.4.4.2. Изменения уровня транскрипционной активности некоторых онкогенов и генов
репарации в культурах MCF7, нокаутированных по TLR9 и AIM2 …………………. 123
3.4.4.3. Изменения транскрипционной активности про- и анти-апоптотических генов и
экспрессий соответствующих белков в клетках, нокаутированных по TLR9 и AIM2
……………………………………………………………………………………………………………………. 125
3.4.4.4. Изменения транскрипционной активности генов нуклеарных факторов NF-kB,
STAT3 и STAT6, а также гена адаптерного белка MyD88 и экспрессии соответствующих
белков в клетках, нокаутированных по TLR9 и AIM2…………………………………….. 128
3.4.4.5. Изменения транскрипционной активности генов маркеров оксидативного стресса
и гипоксии, а также уровень экспрессии соответствующих белков в клетках,
нокаутированных по TLR9 и AIM2 ……………………………………………………………….. 130
3.4.4.6 Изменения транскрипционной активности генов провоспалительных цитокинов и
металлопротеиназ в клетках, нокаутированных по TLR9 и AIM2 …………………… 132
ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………………………………………………………… 133
ВЫВОДЫ ………………………………………………………………………………………………………. 135
Применение научных результатов и выводов ………………………………………………. 136
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ АВТОРОМ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ …………………………………………………. 140
Список сокращений и условных обозначений
АФК – активные формы кислорода
вкДНК (cfDNA) – внеклеточная ДНК
вк-рДНК – рибосомная ДНК в составе внеклеточной
гДНК (gDNA) – геномная ДНК
г-рДНК – рибосомная ДНК в составе геномной
ГЦ – гуанин-цитозин
дцДНК – двуцепочечная ДНК
миРНК (siRNA) – малая интерферирующая РНК
мРНК – матричная РНК
МЯ – микроядра
ПЦР-РВ – полимеразно-цепная реакция в реальном времени
рДНК (rDNA) – рибосомная ДНК
РМЖ – рак молочной железы
ЭПР – эндоплазматический ретикулум
ALR (AIM2-like receptors) – AIM2-подобные рецепторы
CRISPR – короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные кластерами
(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)
ctDNA – циркулирующая опухолевая ДНК
DAMP – молекулярный фрагмент, ассоциированный с повреждениями (damage-
associated molecular pattern)
DDR – ответ на повреждения ДНК (DNA damage response)
NETs – внеклеточные ловушки нейтрофилов (Neutrophil extracellular traps)
PAMP – патоген-ассоциированный молекулярный фрагмент (Pathogen-associated
molecular pattern)
PRR – рецепторы распознавания образов (Pattern recognition receptors)
RICS – комплекс сайленсинга, индуцированный РНК (RNA-induced silencing complex)
RLR – RIG-I-подобные рецепторы (RIG-I-like receptors)
shRNA – короткая шпилечная РНК (small hairpin RNA, short hairpin RNA)
TLRs – Toll-подобные рецепторы (Toll-like receptors)
TNBC – трижды негативный рак молочной железы (Triple-negative breast cancer)
NLR – Nod-подобные рецепторы (Nod-like receptors)

В первой части обзора излагается информации о происхождении, формах внеклеточной ДНК, изменении ее характеристик и роли при патологии. Вторая часть обзора посвящена ДНК-сенсорам (главным образом, TLR9 и AIM2). Третья часть посвящена обзору механизма CRISPR/Cas9 и РНК-интерференции. Представленная в литобзоре информация резюмирована в заключении по литературным данным.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материалы исследования
том числе в 6 статьях (3 из них в WoS и Scopus), опубликованных в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ для соискателей ученой степени кандидата
представлены в 12 печатных работах, в
биологических наук
Сбор образцов крови осуществлялся из периферической вены в асептических условиях с соблюдением этических норм. В качестве доноров выступили 68 женщин, больных РМЖ (средний возраст 49,7 ± 14,7лет) и 76 здоровых женщин без
онкологических заболеваний (средний возраст 46,5 ± 17,5 лет).
Клетки MCF7 (ER/PR-положительная клеточная линия РМЖ)
культивировались в среде DMEM («Панэко», Москва), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина с добавлением антибиотиков (пеницилин, стрептомицин). Культивирование проходило при 37°C в увлажненной атмосфере с содержанием CO2 5%.
Методы исследования
Выделение гДНК и вкДНК из образцов крови осуществлялось после
центрифугирования образца из фракций, содержащих лейкоциты и плазму,
соответственно. Выделение проходило по стандартной методике. Концентрация
гДНК и вкДНК определялась флуориметрически.
Нерадиоактивная количественная гибридизация для определения содержания рибосомного повтора в полученных образцах ДНК проводилась по стандартной методике.
Модельные вкДНК использовались следующие: pBR322-rDNA (содержит последовательность рДНК с 73% ГЦ в составе, соответствующей участку 515 – 5321 рДНК человека), pEGFP-rDNA (содержит вставку, соответствующую участку 601 – 1021 рДНК, 91.9% ГЦ, а также маркерный ген EGFP), pEGFP-Gn (содержит вставку с содержанием ГЦ 73,6%, а также маркерный ген EGFP). В качестве контроля были использованы коммерчески доступные векторы pEGFP и pBR322.
Флуоресцентная микроскопия использовалась для визуализации расположения как модельных вкДНК, меченых флуоресцирующими маркерами, так и некоторых белков. Иммунохимическая окраска проводилась по стандартной методике. Ядра клеток окрашивали при помощи DAPI.
Выделение мРНК проводилось с использованием набора реагентов YellowSolve («Клоноген», Россия) в соответствии с рекомендациями производителя и последующей хлороформ-фенольной экстракцией. ПЦР-РВ проводилась при помощи прибора StepOnePlus (Applied Biosystems, США). В качестве референсного выступил ген TBP.
РНК-интерференция проводилась при помощи соответствующих целевым генам плазмид: pK-AIM2(1) и pK-AIM2(2) для подавления AIM2, pK-TL9(1) и pK- TL9(2) для подавления TLR9. В качестве отрицательного контроля была использована плазмида pK. После трансфекции плазмид в клетку эффективность нокдауна определялась методом ПЦР-РВ с использованием соответствующих AIM2 и TLR9 праймеров.
Для экспериментального нокаута генов AIM2 и TLR9 при помощи технологии CRISPR/Cas9 направляющие РНК были подобраны с помощью сервиса CRISPR DESIGN (http://crispr.mit.edu/). После трансфекции созданных плазмид в клетки MCF7 был проведен отбор клонов. Эффективность экспериментального нокаута подтверждалась отсутствием транскрипционной активности целевых генов.
Для определения уровня АФК в клетках был использован краситель H2DCFH- DA. Флуоресценцию DCF анализировали на приборе EnSpire (Perkin Elmer, Финляндия).
Оценка количества двунитевых разрывов ДНК в ядрах клеток оценивалась методом ДНК-комет (по стандартной методике) с использованием пакета программ СometScore v. 1.5 (TriTek Corp., http://tritekcorp.com). В качестве основной характеристики использовался момент хвоста кометы (произведение длины
«хвоста» кометы и процента ДНК в «хвосте»).
Проточная цитофлуориметрия проводилась по стандартной методике при
помощи прибора CyFlow Space (Partec, Германия).
Статистическая обработка результатов проводила с использования
программ Statistica 6.0, Excel (Microsoft), StatGraph. Нулевая гипотеза об отсутствии различий между выборками была проверена при помощи U-критерия Манна Уитни. Различия между выборками считали достоверными при p<0,05. Оценку распределения осуществлялась с использованием теста Колмогорова-Смирнова. 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Сравнение уровня вкДНК и содержания в ней рДНК у больных РМЖ и у здоровой контрольной группы В ходе оценки концентрации вкДНК в плазме не было обнаружено достоверных отличий между группой больных РМЖ и контрольной группой без онкологической патологии. Методом нерадиоактивной количественной гибридизации с применением биотинилированных зондов был оценен уровень рДНК в составе вкДНК. Посчитан индекс R=вк-рДНК/г-рДНК, где вк-рДНК отражает содержание рДНК в составе вкДНК, а г-рДНК – в геномной ДНК. Медианные значения R в группе больных РМЖ была достоверно (p<10-9) выше (3,4 отн. единиц), чем в контрольной группе (0,8 отн. единиц). Показатель R в 87% выборки с РМЖ был выше показателей в контрольной группе. Таким образом, в крови больных РМЖ накапливаются фрагменты транскрибируемой области рибосомного повтора (рДНК), что объясняется меньшей подверженностью ГЦ- богатых фрагментов действию эндонуклеаз крови (рис. 1). Рисунок 1. Механизм накопления ГЦ-богатой вкДНК в плазме: выход в среду окисленной ДНК погибших клеток, уровень которой понижается под действием эндонуклеаз и в результате связывания антителами. Исследовано содержание маркера окисления 8-oxodG в вкДНК плазмы крови тех же групп. Содержание 8-oxodG в образцах вкДНК плазмы крови больных РМЖ значительно превышают таковое у контрольной группы. Так, медианные значения содержания 8-oxodG в составе вкДНК на 106 нуклеотидов у контрольной группы составило всего 46, в том время, как у группы с РМЖ – 418. В выборке больных РМЖ встречаются аномально высокие значения 8-oxodG в составе вкДНК (от 1000 до 4967 8-oxodG в составе вкДНК /106 нуклеотидов). Эту выборку с аномально высокими значениями 8-oxodG в составе вкДНК составила группа больных РМЖ с множественными метастазами разной локализации. Проникновение ГЦ-богатых модельных вкДНК в клетку MCF7 Для демонстрации проникновения модельных вкДНК в раковые клетки MCF7 были поставлены эксперименты с плазмидами, мечеными маркерами SpectrumGreen и SpectrumRed. Сигналы от зонда pBR322-rDNAred со вставкой рДНК в клетке более многочисленны, чем pBR322green, который имеет меньшее содержание ГЦ (рис. 2). Таким образом, показана не только способность плазмид проникать в клетки MCF7, но и различие степени проникновения от уровня ГЦ. Рисунок 2. Клетки MCF7 спустя 30 мин инкубации с плазмидами pBR322green (зеленые зерна) и pBR322-rDNAred (красные зерна). Флуоресцентная микроскопия. Увеличение х40. Проникновения вкДНК в клетки было подтверждено с использованием плазмиды, содержащей ген флуоресцирующего белка EGFP и его интактный промотор. Оценка экспрессии гена EGFP методом ПЦР-РВ показала, что плазмида pEGFP-rDNA накапливалась в клетках в значительно большем количестве, чем соответствующий вектор pEGFP, что объясняется различным содержанием ГЦ. Это было подтверждено анализом уровня белка EGFP в клетках методом проточной цитофлуориметрии. Экспрессия EGFP в клетки MCF7 визуализирована методом флуоресцентной микроскопии (рис. 3). Рисунок 3. Клетки MCF7 после инкубации в присутствии pEGFP-rDNA. Флуоресцентная микроскопия. Увеличение х40. Проникновение вкДНК в клетки MCF7 в условиях дополнительного окислительного стресса Подтверждена важная роль АФК в проникновении плазмиды в клетку. Для этого были поставлены эксперименты с плазмидами pEGFP-Gn и pEGFP с дополнительной индукцией синтеза АФК. Индукцию АФК стимулировали различными способами:  Введение в среду вместе с плазмидой Н2О2  Обработка плазмиды Н2О2 перед внесением в среду.  Добавление плазмид с облучением гамма-излучением в дозе 10 сГр. Проточная цитофлуориметрия и флуоресцентная микроскопия показали, что и у pEGFP-Gn, и у pEGFP при предварительном окислении увеличивается проникающая способность. Оценка уровня АФК в MCF7 после внесения модельных ГЦ-богатых вкДНК Флуоресцентная микроскопия с покраской H2DCFH-DA показала, что в клетке при добавлении ГЦ-богатых плазмид активируется синтез АФК (рис. 4). Активный синтез АФК происходит в первые минуты после добавления плазмид, но через полчаса уже снижается. Рисунок 4. Клетки MCF7 после обработки 5 мкм H2DCFH-DA и инкубации с pBR322-rDNAred (50 нг/мл) в течение 30 минут. Флуоресцентная микроскопия. Увеличение x40. Оценка уровня экспрессии NOX4 Исследована активность гена NOX4, который кодирует NADPH-оксидазы – основной источник АФК. Проточная цитофлуориметрия показала стремительный рост количества клеток с высоким содержанием белка NOX4. Плазмиды pEGFP- rDNA и pBR322-rDNA в меньшей степени стимулировали синтез NOX4, чем плазмиды без вставки рДНК. Оценка уровня мРНК NOX4 методом ПЦР-РВ подтвердила возрастание активности NOX4 после добавления плазмид в среду. Флуоресцентная микроскопия показала, что при внесении плазмид NOX4 экспрессируется и в цитоплазме, и в ядре, в то время как в контрольных клетках – у поверхности клеток и в цитоплазме. Такая картина наблюдалась как при внесении плазмид со вставкой рДНК, таки и при внесении pEGFP-Gn. Уровень и локализация 8-oxodG в клетках MCF7 после воздействия вкДНК Проанализировали уровень 8-oxodG в клетках при воздействии плазмид. Введение в среду плазмид с ГЦ-богатой вставкой (pEGFP-rDNA, pBR322-rDNA и pEGFP-Gn) вызывало увеличение количества клеток с высоким содержанием 8- oxodG в первые несколько часов инкубации, спустя сутки выраженного эффекта уже не наблюдалось. Плазмиды без вставки рДНК (pEGFP и pBR322) лишь незначительно повышали уровень 8-oxodG относительно контроля. Исследована локализация в клетках сигналов от 8-oxodG с меткой FITC. В клетках MCF7 без введения плазмиды в среду она совпадала с сигналами от митотрекера TMRM (выявляющего активно функционирующие митохондрии), но после инкубации MCF7 в течение 30 мин с плазмидой со вставкой рДНК в цитоплазме клетки сигналы FITC располагались не только в митохондриях, но и в виде ярких сгустков в различных местах цитоплазмы, что свидетельствует об окислении проходящих в клетку плазмид. Было замечено, что после обработки плазмидами pEGFP-rDNA и pBR322- rDNA сигналы 8-oxodG видны в ядре, особо ярко выражены в области ядрышка. Такая картина наблюдается примерно у половины клеток. Таким образом, плазмиды со вставкой рДНК проникают в цитоплазму клеток MCF7 и локализуются в области ядрышкового организатора, что может, в свою очередь, сказаться на биогенезе рибосом. Изменение биогенеза рибосом в клетках MCF7 после внесения ГЦ-богатых модельных вкДНК, содержащих в своем составе рДНК Чтобы подтвердить предположение об изменении биогенеза рибосом, провели оценку содержания 18s рРНК при помощи ПЦР в реальном времени. При инкубации MCF7 в присутствии pEGFP-rDNA и pBR322-rDNA в течение первых 2 часов увеличивалось содержание рРНК в клетках в 1,5-2 раза относительно контроля, но после инкубации в течение 72 часов уровень рДНК снижался. Плазмиды без вставок не демонстрировали такого эффекта. Это свидетельствует о способности фрагментов вкДНК проникать в ядро клетки, причем фрагменты рДНК могут конкурировать с рибосомными генами в ядре за необходимые для биогенеза рибосом факторы. Оценка уровня 8-oxodG в используемых модельных вкДНК Был проанализирован уровень 8-oxodG в самих плазмидах, выделенных из среды через некоторое время после внесения. Плазмиды pEGFP-rDNA, полученные после 1 часа инкубации с клетками MCF7, содержали 0,10 8-oxodG на одну молекулу-плазмиду. Вектор pEGFP после аналогичного эксперимента содержал 0,26 8-oxodG на одну молекулу. Подобные результаты были получены после трехчасовой инкубации с плазмидой pEGFP-Gn и соответствующим вектором. Высокий уровень окисления вставки rDNA и Gn может объяснять существенное усиление сигналов 8-oxodG в течение первых часов инкубации c MCF7. Этим же объясняется и большая способность к проникновению в клетку плазмид, содержащих вставку rDNA и Gn, по сравнению с векторами. Таким образом, можно обозначить следующую последовательность событий, предшествующих проникновению модельных вкДНК в клетку MCF7: 1. ВкДНК приближается к клетке. 2. Происходит активная генерация АФК в месте контакта вкДНК с клеткой. 3. Происходит окисление ГЦ-пар вкДНК (причем уровень окисления зависит от ГЦ-обогащенности вкДНК). 4. Окисленная вкДНК проникает в клетки, после чего уже возможна дальнейшая экспрессия генов, содержащихся во фрагменте (при наличии промотора). Формирование адаптивного ответа и повышение выживаемости клеток MCF7 под воздействием ГЦ-богатых модельных вкДНК Ранее уже выдвигалось предположение, что при химиотерапии или лучевой терапии, высвобождение окисленной ДНК умирающих раковых клеток может способствовать дальнейшей резистентности выживших раковых клеток (Glebova K. et al., 2015). Причем опухолевые клетки более чувствительны к окисленной ДНК. Повреждение ДНК в клетках MCF7 и последующая репарация ДНК при внесении вкДНК в среду Уровень повреждения ДНК в ядрах клеток линии MCF7 был оценен методом ДНК-комет. После инкубации в течение 30 минут с плазмидой pEGFP-Gn большая часть ядер клеток на препарате образовала «хвосты» из ДНК c многочисленными разрывами. Но уже спустя 45 минут после внесения плазмид в среду число разрывов начинает существенно падать, а через 3 часа приближается к количеству разрывов в контроле (рис. 5). Вектор pEGFP также стимулировал разрывы, но менее выражено. Похожая картина наблюдалась и при внесении pBR322-rDNA, и соответствующего вектора. Изменение количества двуцепочечных разрывов ДНК после внесения pBR322-rDNA и pBR322 было подтверждено путем определения содержания гистона H2AX в ядрах. Присутствует еще один индикатор нестабильности генома и повреждения ДНК – увеличение количества микроядер в клетках. Причиной резкого возрастания количества разрывов, а затем снижения по мере инкубации с плазмидой являются репарационные процессы, активизирующиеся в ответ на повреждения под воздействием плазмиды. Оценка уровня повреждений ДНК в клетках MCF7 после повторного внесения модельных вкДНК При повторном введении pEGFP-Gn уже не происходит выраженных разрывов ДНК в большом количестве клеток, а значения момента хвоста кометы при повторном введении даже ниже, чем в контроле (рис. 5). Рисунок 5. Слева: Медианные значения момента хвоста кометы после инкубации клеток MCF7 c pEGFP-Gn и pEGFP в течение 30 мин, 45 мин и 3 ч. Справа: медианные значения момента хвоста кометы в экспериментах с повторным внесением плазмиды pEGFP-Gn в среду, в которую она уже ранее вносилась на 3 часа, и повторным внесением плазмиды pEGFP-Gn после замены среды на свежую и инкубации в течение 24 часов. Также приведены контроль (без добавления плазмиды) и положительный контроль (после 30 минут инкубации после первого внесения плазмиды pEGFP-Gn). Еще одно важное событие при развитии эффекта DDR – остановка клеточного цикла. При помощи проточной цитофлуориметрии с окраской антителами к белку- маркеру пролиферации KI-67 было показано снижение содержания KI-67 после добавления в среду pBR322-rDNA на 2 часа. Это говорит об остановке процессов пролиферации в клетках под воздействием ГЦ-богатой ДНК. Но уже после 48 часов инкубации с плазмидой количество клеток с высоким содержанием KI-67 поднимается выше уровня в контроле. При внесении плазмид происходит повышение уровня транскрипционной активности генов белков остановки клеточного цикла CDKN2A, CDKN1A, CCND1, TP53 и гена негативного регулятора супрессора опухоли p53 MDM2. – Таким образом, наблюдается реакция клетки на повреждения (DDR) в ответ на внесение ГЦ-богатой вкДНК, что является важным механизмом, обеспечивающим выживание раковой клетки. Оценка транскрипционной активности некоторых генов при внесении Результаты получены в ходе трех независимых экспериментов. * – p<0,01, непараметрический U-тест. Изменение экспрессии генов, участвующих в репарации клетки, про – и антиапоптотических генов и генов, влияющих на выживаемость клеток MCF7 при действии ГЦ-богатой вкДНК ПЦР-ВР показала изменение транскрипционной активности некоторых генов, влияющих на выживаемость клетки при внесении плазмид (табл. 1). Таблица 1. pBR322-rDNA и pBR322 на 2 часа и на 48 часов. pBR322-rDNA 48ч 3,1±0,1* 4,9±0,3* 2,5±0, 3* 2,1±0,3* 0,8±0,1* 1,8±0,1* 1,8±0,2* 0,7±0,1 2,4±0,2* 1,7±0,2* 1,4±0,1 1,5±0,1 1,8±0,4* 3,5±0,3* 2,5±0,2* 1,5±0,2* 1,6±0,1* pBR322 2ч 48ч 1,9±0,6* 4,2±0,5* 1,1±0,3 3,5±0,5* 1,2±0,3 2,3±0,3* 1,0±0,3 1,5±0,1* 1,2±0,2 4,0±0,4* 1,2±0,2 2,5±0,1* 1,8±0,2* 2,8±0,3* 1,3±0,2 0,9±0,3 0,3±0,1* 0,2±0,2* 0,7±0,1 0,3±0,1* 0,8±0,3 0,9±0,2 0,9±0,3 0,9±0,2 1,0±0,2 1,4±0,1 0,5±0,2 0,4±0,2 0,4±0,2 0,5±0,1 0,8±0,3 1,0±0,3 0,6±0,2 0,8±0,2 BRCA1 BCL2 BCL2A1 (Bfl-1/A1) BCL2L1 (BCL-X) BIRC3 (c-IAP1) BIRC2 (c-IAP2) MDM2 BAX BAD PMAIP1 (NOXA) AMBRA HIF1A VEGFA MTOR AKT1 AKT2 AKT3 2ч 2,2±0,1* 2,5±0,2* 2,8±0,2* 1,5±0,2* 2,0±0,1* 1,4±0,1 2,7±0,1* 0,3±0,2* 0,4±0,2* 0,6±0,1* 0,4±0,1* 4,3±0,2* 2,3±0,2* 9,4±0,5* 4,2±0,3* 3,6±0,3* 3,4±0,2* Методом проточной цитофлуориметрии был зафиксирован Активация транскрипционного фактора NF-kB при внесении модельных ГЦ- богатых вкДНК При помощи ПЦР-РВ зафиксировано увеличение в клетках MCF7 транскрипционной активности некоторых генов, которые входят в состав пути NF- kB, а также подконтрольных NF-kB генов цитокинов, хемокинов и связанных с ними рецепторов после внесения pBR322-rDNA и pBR322 в среду культивирования (табл. 2). Проточная цитофлуориметрия показала изменение содержания белка p65 семейства NF-kB под действием модельных вкДНК. После внесения в среду pBR322-rDNA количество клеток с высоким содержанием p65 возросло, а также увеличилось среднее содержание белка в клетках этой фракции. Добавление в среду pBR322 способствовало повышению среднего уровня белка во фракции с высоким содержанием белка, но на количестве клеток в ней сказалось незначительно. Визуализация NF-kB (p65) при помощи флуоресцентной микроскопии показала, что в контрольных клетках MCF7 он локализуется преимущественно в цитоплазме, а через 2 часа после внесения плазмиды pBR322-rDNA в среду культивирования MCF7 примерно у 70% клеток на препарате сигнал от NF-kB (p65) располагался в области ядра. Этот факт можно объяснить активацией NF-kB фрагментами рДНК. После воздействия вектора pBR322 перемещение сигналов NF-kB (p65) в ядро также зафиксировано, но в меньшей степени. Это свидетельствует об активации сигнального пути NF-kB, который играет важнейшую роль в развитии и прогрессии многих злокачественных опухолей, под действием модельных вкДНК. Таблица 2. Изменение уровня транскрипционной активности генов сигнального пути NF-kB, и других генов, находящихся под контролем NF-kB на уровне мРНК в клетках MCF7 после внесения в среду pBR322-rDNA или pBR322 относительно контроля. * – p<0,01, непараметрический U-тест. рост экспрессии белка PCNA, который участвует в эксцизионной репарации ДНК, после внесения в среду pBR322-rDNA на 2 и 48 часов. Соответствующий вектор без вставки демонстрировал менее выраженный эффект. pBR322-rDNA 2ч 48ч 2ч 1,1±0,1 1,2±0,1 0,8±0,2 0,8±0,2 0,8±0,3 1,0±0,3 3,2±0,3* 1,0±0,1 pBR322 48ч 1,5±0,3 1,3±0,2 0,8±0,4 2,1±0,3* 2,2±0,2* 1,3±0,3 5,3±0,4* 1,9±0,1* MAP4K4 MYD88 NFKB1 TIRAP RELA MAP3K1 IL10 IFNG 2,2±0,2* 2,5±0,2* 2,6±0,2* 2,0±0,2* 1,7±0,2* 1,3±0,2* 3,8±0,3* 2,3±0,3* 1,3±0,2 2,0±0,2* 1,9±0,2* 2,2±0,2* 2,1±0,2* 1,4±0,3* 1,5±0,1* 1,8±0,2* pBR322-rDNA 2ч 48ч pBR322 2ч 48ч IL6 1,4±0,3 IL8 0,9±0,2 TNFa 3,9±0,4* IL1B 0,4±0,1* 3,5±0,3* 3,4±0,4* 2,3±0,3* 1,6±0,2 1,0±0,3 0,7±0,2 1,1±0,2 0,6±0,3 0,8±0,2 0,6±0,4 0,5±0,3 1,4±0,4 Активация фактора транскрипции STAT3 при взаимодействии клеток MCF7 с ГЦ-богатой вкДНК STAT3 является одним из важных факторов, влияющих на устойчивость раковых клеток к терапии. В экспериментах с внесением плазмиды pBR322-rDNA на 2 и 48 часов возрастало количество мРНК генов STAT3 и STAT6, а также генов металлопротеиназ MMP2 и MMP7, транскрипция которых находится под контролем фактора STAT3 (табл. 3). Таблица 3. Оценка уровней транскрипционной активности генов семейства STAT. Результаты получены в ходе трех независимых экспериментов. * – p<0,01, непараметрический U-тест. 2ч STAT3 2,2±0,2* STAT6 1,3±0,2 MMP2 1,6±0,2 MMP7 1,7±0,1* pBR322-rDNA 48ч 1,6±0,1* 2,4±0,3* 1,1±0,2 1,8±0,2* 2ч 1,1±0,2 1,0±0,2 0,4±0,1 1,0±0,1 pBR322 48ч 2,0±0,2* 3,1±0,3* 0,3±0,1 2,6±0,2 Изучение роли ДНК-сенсоров TLR9 и AIM2 в реализации биологической активности вкДНК в отношении клеток MCF7 Показано, что уровень экспрессии TLR9 в клетках MCF7 зависит от времени культивирования. Причиной роста экспрессии TLR9 в MCF7 может служить накопление вкДНК в среде по мере культивирования, что и стимулирует экспрессию этого ДНК-сенсора. Параллельно с увеличением экспрессии TLR9 снижается экспрессия AIM2. Внесение модельных вкДНК оказывает стимулирующее воздействие на TLR9 (как на количество мРНК, так и на количество белка). При этом наблюдается снижение уровня экспрессии AIM2 и на уровне мРНК, и на уровне белка (рис.6). Причем, согласно результатам микроскопии, рост экспрессии TLR9 сопровождается перемещение из цитоплазмы в ядро AIM2, что, видимо, является одним из механизмов снижения ее активности. Рисунок 6. Результаты оценки экспрессии TLR9 методом ПЦР-РВ (1) и методом проточной цитофлуориметрии (2) при внесении в среду pBR322-rDNA или pBR322. Каждая точная на графиках – среднее значение, полученное в результате четырех независимых экспериментов. * – р<0,05. Исследование взаимозависимости экспрессии ДНК-сенсоров TLR9 и AIM2 с использованием метода РНК-интерференции Для более подробного изучения взаимозависимости экспрессии ДНК- сенсоров TLR9 и AIM2 был использован метод РНК-интерференции. Подавление экспрессии TLR9 способствует усилению экспрессии AIM2 и на уровне белка, и на уровне мРНК (рис. 7). При подавлении AIM2 выраженного влияния на TLR9 не наблюдается. При подавлении активности гена TLR9 при помощи РНК-интерференции снижалась и активация NF-kB. Рисунок 7. Результаты оценки экспрессии TLR9 и AIM2 на уровне мРНК (1) и на уровне белка по результатам проточной цитофлуориметрии (2) после подавления активности AIM2 или TLR9 посредством РНК-интерференции. * – p<0,01 относительно контроля (плазмида без вставки, столбцы «pK») по непараметрическому U-тесту. Исследование роли ДНК-сенсоров TLR9 и AIM2 в реализации действия вкДНК на клетки MCF7 при экспериментальном нокауте с применением технологии CRISPR/Cas9 Роль ДНК-сенсоров TLR9 и AIM2 в реализации действия вкДНК на клетки MCF7 была подтверждена в ходе экспериментов с клетками MCF7, нокаутированными по соответствующим генам при помощи технологии CRISPR/Cas9 (рис. 8 и 9). Рисунок 8. Транскрипционная активность некоторых генов, выраженная в относительных единицах, в нокаутированных культурах раковых клеток MCF7. * – p<0,01 по сравнению с интактными не нокаутированными клетками MCF7; + – p<0,01 по сравнению с контрольной культурой, в которую не была внесена плазмида. Рисунок 9. Транскрипционная активность некоторых генов, выраженная в относительных единицах, в нокаутированных культурах раковых клеток MCF7. * – p<0,01 по сравнению с интактными не нокаутированными клетками MCF7; + – p<0,01 по сравнению с контрольной культурой, в которую не была внесена плазмида. C применением технологии CRISPR/Cas9 было подтверждено существование механизма компенсации, при котором при «выключении» одного из исследуемых ДНК-сенсоров, повышается экспрессия других. ВЫВОДЫ 1. В крови больных раком молочной железы (РМЖ) накапливаютcя фрагменты транскрибируемой области рибосомного повтора (рДНК) и оксиленные фрагменты внеклеточной ДНК, при этом общая концентрация внеклеточной ДНК (вкДНК) не отличается от таковой в контрольной группе. Повышение уровня 8-oxodG в cоcтаве вкДНК при РМЖ увеличивается с тяжестью течения заболевания. 2. ГЦ-богатая вкДНК (рДНК) в составе плазмид проникает через цитоплазматическую мембрану MCF7 благодаря окислительной модификации оснований (8-oxodG). Окисленная вкДНК стимулирует генерацию свободных радикалов, обусловленную повышением экспрессии гена NOX4. Фрагменты рДНК в составе вкДНК могут конкурировать с рибосомными генами в ядре за необходимые для биогенеза рибосом факторы. 3. ГЦ-богатая вкДНК (рДНК) вызывает двунитевые разрывы ядерной ДНК в клетке MCF7, которые в течении 3 часов репарируются. Действие срабатывающего при этом ответа на повреждение ДНК продолжается в течение длительного времени. Эти механизмы продолжают работать и при повторном воздействии ГЦ-богатой вкДНК даже более, чем через 24 часа после первого воздействия. 4. При воздействии ГЦ-богатой вкДНК (рДНК) происходит усиление транскрипционной активности гена репарации BRCA1, антиапоптотических генов ( PCNA, 5. ), генов металлопротеиназ (MMP2, MMP7); проапоптотических генов ( белка BCL2, BCL2A1, BCL2L1, BIRC2, BIRC3 снижение экспрессии BAX, BID, BAD, NOXA, BBC3) и генов-супрессоров опухолей (HUWE1, AMBRA); увеличивается экспрессия факторов транскрипции NF-kB, STAT3 и STAT6. ГЦ-богатая вкДНК стимулирует сигнальные пути TLR9 / MYD88 / NF-kB, индуцируя повышенную экспрессию генов, ответственных за повышение жизнеспособности раковых клеток. ВкДНК (рДНК) воздействует на клетки MCF7 через ДНК-сенсоры TLR9 и AIM2. При возрастании экспрессии TLR9, отвечающего за запуск механизмов выживания клетки, снижается активность AIM2, активирующего механизмы клеточной гибели. При экспериментальном нокауте гена TLR9 или ингибировании экспресии гена TLR9 молекулами миРНК, рецептор AIM2 активизируется. 6. В присутствии ГЦ-богатой вкДНК (рДНК) в клетках, нокаутированных по одному из генов ДНК-сенсоров TLR9 и AIM2, снижается транскрипционная активность генов AKT1, BRCA1, BRCA2, NF-kB, MyD88, STAT3, STAT6, MMP2, MMP7, IL-6, IL-8, BCL2, что сопровождается снижением жизнеспособности раковых клеток MCF7. Применение научных результатов и выводов 1. Повышенное содержание 8-oxodG (выше 1000 /106 нуклеотидов) в составе внеклеточной ДНК у больных РМЖ может иметь ценность как маркер тяжелого течения заболевания. Повышение этого показателя может свидетельствовать о необходимости проверки пациента на предмет наличия метастазов. 2. При терапии онкологических заболеваний уместно рассмотреть применение веществ (антиоксидантов), препятствующих окислению вкДНК, что может снижать ее биологическую активность в отношении раковых клеток. 3. 4. ДНК-сенсор TLR9 является перспективной мишенью с точки зрения уменьшения взаимодействия клетки с ГЦ-богатой вкДНК. Подавление активности гена TLR9 можно рассматривать как способ снижения жизнеспособности раковых клеток in vivo.

Актуальность исследования
Интерес мировой науки к исследованиям внеклеточной ДНК (вкДНК) при
патологии продолжает расти. Несмотря на изученность вкДНК, в том числе, в контексте
онкологических заболеваний (главным образом, как диагностического маркера), до сих
пор в полной мере не яcно, как проявляется ее биологическая активность в отношении
раковых клеток. Концентрацию и состав вкДНК в крови рассматривают как один из
маркеров опухолевой прогрессии, а также для оценки эффективности противоопухолевой
терапии.
ВкДНК имеет другой состав, чем ядерная ДНК. Она содержит больший процент
пар гуанин-цитозин. С учетом того, что ГЦ-богатая вкДНК легко поддается окислению, и
это упрощает ее взаимодействие с раковой клеткой [Kostyuk S.V., Konkova M.S. et al.,
2013]. Крайне важно понимать роль окисления вкДНК при взаимодействии вкДНК с
клетками. ГЦ-богатые участки вкДНК более устойчивы к воздействию нуклеаз и
способны накапливаться в кровотоке и межклеточном пространстве. ГЦ-богатые участки
входят в промоторы примерно 40% генов человека (содержащих островки CpG),
имеющих такой же процент ГЦ, как и повторяющаяся последовательность рибосомной
ДНК, которой уделено большое внимание в данной работе.
Тот факт, что в пуле циркулирующей в крови вкДНК присутствует часть генов с
промоторами, мотивирует изучение возможности экспрессии генов в составе вкДНК в
раковой клетке. Кроме того, при проникновении в клетку фрагменты вкДНК могут
вступить во взаимодействие с некоторыми важными факторами, регулирующими
транскрипционную активность специфических генов. Таким образом, результатом
биологической активности вкДНК в отношении раковой клетки может стать изменение
паттернов экспрессии генов, важных с точки зрения терапии опухолей.
Взаимодействие вкДНК с клеткой непосредственно связано с работой ДНК-
сенсоров. Данная работа сфокусирована на роли ДНК-сенсоров TLR9 и AIM2. Клетка
MCF7 экспрессирует и тот, и другой ДНК-сенсор. Взаимодействие сигнальных путей,
активируемых этими ДНК-сенсорами, также представляет научный интерес. Уже
выявленная связь TLR9 с формированием адаптивного ответа, метастазированием,
пролиферацией и повышением резистентности раковых клеток указывает на TLR9 как на
перспективную мишень для терапии. Еще больше обостряет интерес к этому ДНК-
сенсору тот факт, что экспрессия TLR9 в раковых клетках повышена относительно
нераковых клеток. ДНК-сенсор AIM2 изучен в меньшей степени, но есть основания
полагать, что он также влияет на выживаемость раковых клеток.
В данной работе продемонстрирована не только связь двух этих ДНК-сенсоров, но
и обозначена их роль в биологической активности вкДНК применительно к раковой
клетке. Более прицельно изучить роль TLR9 и AIM2 позволило применение технологии
CRISPR/Cas9 для экспериментального нокаута соответствующих генов и метода РНК-
интерференции для подавления их транскрипционной активности. Ставилась цель
выявить таким образом сенсор, который в дальнейшем может служить мишенью для
целенаправленного снижения адаптивного ответа в раковой клетке, что имеет очевидные
практические приложения при терапии опухолей.
В рамках данной работы рассмотрена гипотеза о возможности ГЦ-богатой вкДНК
способствовать развитию устойчивости раковых клеток к противоопухолевой терапии
через TLR9, AIM2 и активируемые ими сигнальные пути.
Полученные данные ценны не только с позиции фундаментальной науки, но и в
перспективе могут найти применение в разработке новых подходов в клинике.
Степень разработанности темы исследования
Известно, что циркулирующая вкДНК имеет довольно высокий процент ГЦ-
богатых фрагментов [Li J.Z., Steinman C.R. et al., 1989; Sano H., Morimoto C., 1982], причем
ее состав изменяется при патологии, сопровождающейся обильной гибелью клеток [Veiko
N.N., Bulycheva N.V. et al., 2008; Veiko N.N., Shubaeva N.O. et al., 2006; Veiko N.N.,
Konorova I.L., Neverova M.E., 2010]. Существуют данные об отличии уровня вкДНК в
биологических жидкостях онкобольных относительно здоровых контрольных групп
[Fleischhacker M., Schmidt B., 2007; Leon S. et al., 1997, Anunobi R. et al., 2018; Mouliere F.
et al., 2014; Mouliere F. et al., 2011]. Также отмечается отличие ее качественного состава
[Mouliere F., Thierry A.R., 2012; D’Souza-Schorey C., Clancy J.W., 2012; Bettegowda C. et
al., 2014; Bettegowda C. et al., 2014; Zill O.A. et al., 2018].
Известно, что молекулы вкДНК способны влиять на экспрессию генов
провоспалительного ответа, антиокислительной системы, регуляции апоптоза в клетках
различных человеческих линий (эндотелиоциты, эмбриональные фибробласты,
мезенхимные стволовые клетки, фибробласты кожи), проявляя себя как молекулы стресс-
сигнализации [Konkova M.S. et al., 2019]. Существуют данные об изменении
транскрипционной активности различных генов в ответ на присутствие вкДНК для
раковых клеток. Предполагается, что вкДНК может влиять на процессы метастазирования
[Yoneyama M., Fujita T., 2008; Volik S. et al., 2016; Bendich A. et al. 1965, Garcia-Olmo D.
et al., 2000; Garcia-Olmo D. et al., 2011, Garcia-Olmo D. et al., 2010], пролиферации раковых
клеток [Niu Z. et al., 2018]. Есть данные о роли вкДНК в развитии резистентности к
терапии [Ermakov A.V. et al., 2011; Kostyuk S.V., Ermakov A.V. et al., 2012; Glebova K. et
al., 2015].
Изучаемый ДНК-сенсор TLR9 экспрессируется во многих линиях раковых клеток
человека и в клинических образцах [Sandholm J. et al., 2012; Berger R. et al., 2010;
Droemann D. et al., 2005; Ren T. et al., 2009; Schmausser B. et al., 2005; Gonzalez-Reyes S. et
al., 2010; Brignole C. et al., 2010; Nojiri K. et al., 2013], включая РМЖ [Merrell M.A. et al.;
2006, Berger R. et al., 2010; Ilvesaro J.M. et al., 2008; Sandholm J., Selander K.S., 2014]. Он
вовлечен в процессы пролиферации, повышения выживаемости раковых клеток,
процессы метастазирования, снижение цитотоксичности некоторых противоопухолевых
препаратов [Niu Z. et al., 2018, Pisani L.P. et al., 2017; Efremov D.G. et al., 2013; Chandler
M.R. et al., 2017; Kang T.H. et al., 2019]. Рецептор AIM2 изучен в меньшей степени, но
также показана его роль в биологии раковой клетки, поскольку активация AIM2
индуцирует апоптотические процессы и ингибирует пролиферацию клеток [Fernandes-
Alnemri T. et al., 2009; Asefa B. et al., 2004; Chen I.F. et al., 2006].
Также есть данные о влиянии окисленной геномной ДНК на выживаемость клеток
MCF7, изучаемых в данной работе. Окисленная ДНК увеличивает нестабильность генома
и подавляет процессы гибели клеток [Kostyuk S.V., Konkova M.S. et al., 2013].
Однако, многие вопросы, касающиеся исследования роли конкретных
последовательностей в составе вкДНК в реализации ее биологической активности, а
также молекулярные механизмы воздействия вкДНК на раковые клетки, остаются
недостаточно изученными. В данной работе исследуется биологическая активность
вкДНК в отношении транскрипционной активности генов в клетках MCF7 и с
использованием модельных вкДНК, содержащих известное количество ГЦ, исследуется
роль ДНК-сенсоров TLR9 и AIM2 в реализации действия вкДНК на раковые клетки
MCF7.
Цель и задачи исследования
Цель исследования: установление молекулярного механизма формирования
адаптивного ответа опухолевых клеток посредством изменения функциональной
активности генома под воздействием внеклеточной ДНК.
Задачи исследования:
1. Проанализировать характеристики вкДНК больных раком молочной железы и
выявить различие в количестве ГЦ-богатых фрагментов, значимых с точки зрения
биологической активности вкДНК, относительно здоровой контрольной группы.
2. Изучить механизмы проникновения вкДНК на примере искусственно
сконструированных ГЦ-обогащенных плазмид в опухолевые клетки линии MCF7.
Исследовать значение АФК в этом процессе, а также роль активации гена NOX4 в
окислении ранее неокисленной вкДНК вблизи поверхности клетки.
3. С применением модельных фрагментов вкДНК оценить повреждающее действие
ГЦ-богатых фрагментов и выявить, какие последовательности вызывают адаптивный
ответ.
4. Исследовать изменение транскрипционной активности генов, отвечающих за про-
и антиапоптотические эффекты, за репарацию, генов-супрессоров опухолей и других
генов, активность которых влияет на выживаемость опухолевых клеток.
5. Исследовать, через какие рецепторы реализуется действие вкДНК. Изучить
активацию AIM2 – и TLR9 – сигнальных путей в клетках MCF7 при действии модельных
вкДНК.
6. Изучить изменения транскрипционной активности про- и антиапоптотических
генов, генов антиокислительного ответа и других генов, влияющих на жизнеспособность
раковых клеток MCF7 при действии вкДНК после экспериментального нокаута TLR9 и
AIM2 в клетках.
Методология и методы диссертационного исследования
В качестве методологической основы приняты исследования характеристик вкДНК
в биологических жидкостях и среде, а также исследования вкДНК как биологически
активной молекулы в отношении различных культур клеток, описанные как у
отечественных, так и у зарубежных авторов.
Работа сфокусирована на изучении механизма и условий проникновения вкДНК в
клетки аденокарциномы молочной железы (линии MCF7), изучении изменения
транскрипционной активности генов в клетках под воздействием ГЦ-богатых модельных
фрагментов, в том числе и при подавленной активности ДНК-сенсоров TLR9 и AIM2.
Исследование проводилось in vitro на ER/PR-положительной клеточной линии
аденокарциномы молочной железы MCF7.
В качестве модельных вкДНК использованы искусственные ГЦ-богатые
конструкции с известным содержанием ГЦ (pBR322-rDNA, pEGFP-rDNA, pEGFP-Gn). В
качестве контроля использовались коммерчески доступные векторы pEGFP и pBR322.
Для характеристики количества и состава вкДНК в крови больных РМЖ и
здоровых доноров проведен забор крови в асептических условиях и с соблюдением всех
этических норм. Определение содержания последовательности рДНК (рРНК-
кодирующей ДНК) осуществляли методом нерадиоактивной количественной
гибридизации. Для визуализации расположения в клетке модельных вкДНК и некоторых
белков использована флуоресцентная микроскопия. Для оценки изменений
транскрипционной активности генов использован метод ПЦР в реальном времени.
Оценка уровня белков в клетках проводилась с помощью проточной цитофлуориметрии.
Для оценки количества двунитевых разрывов ядерной ДНК использовался метод ДНК-
комет. Подавление экспрессии генов TLR9 и AIM2 проводилось методом РНК-
интерференции. Экспериментальный нокаут генов TLR9 и AIM2 осуществлялся при
помощи технологии CRISPR/Cas9.
Научные положения, выносимые за на защиту
1. Во внеклеточной ДНК больных раком молочной железы накапливаются фрагменты
рибосомного повтора (рДНК) и окисленные фрагменты.
2. Окислительная модификация ГЦ-богатой внеклеточной ДНК в составе плазмид
способствует ее проникновению в клетки МСF7. Окисленные и ГЦ-богатые фрагменты
вкДНК индуцируют синтез свободных радикалов в клетках за счет активации
транскрипции NOX4.
3. ГЦ-богатая вкДНК (рДНК) стимулирует появление репарируемых двухнитевых
разрывов ядерной ДНК и активирует ответ генов на повреждение ДНК, что приводит к
развитию адаптивного ответа в клетках MCF7 при повторном воздействии ГЦ-богатой
ДНК.
4. При воздействии ГЦ-богатой вкДНК (рДНК) происходит рост экспрессии генов,
отвечающих за репарацию, и антиапоптотических генов, снижение уровня экспрессии
супрессоров опухолей и проапоптотических генов. Под влиянием ГЦ-богатой вкДНК
(рДНК) происходит активация пути NF-kB, усиление экспрессии факторов транскрипции
STAT3 и STAT6, а также генов подконтрольных им металлопротеиназ.
5. При возрастании экспрессии TLR9, отвечающего за запуск механизмов выживания
клетки, снижается транскрипционная активность AIM2, активирующего механизмы
клеточной гибели.
6. При действии вкДНК после экспериментального нокаута TLR9 или AIM2 меняется
профиль транскрипционной активности про- и антиапоптотических генов, генов-
маркеров оксидативного стресса и гипоксии, транскрипционных факторов NF-kB, STAT3,
адаптерного белка MyD88, онкогенов и супрессоров опухолей, генов репарации. Это
приводит к изменению механизмов ответа на воздействие вкДНК и снижению
жизнеспособности раковых клеток MCF7.
Научная новизна результатов исследования
В работе полностью выявлена цепочка событий от контакта вкДНК с клеткой
MCF7 до изменения транскрипционной активности генов, отвечающих за ее выживание.
В рамках этой цепочки проиллюстрирован процесс окисления вкДНК, роль АФК и NOX4
в этом процессе, зависимость степени проникновения и локализации от ГЦ-
обогащенности и от уровня окисления вкДНК. Впервые обнаружена способность вкДНК
влиять на биогенез рибосом. Также показана способность вкДНК экспрессироваться при
наличии промотора.
Поскольку в работе использовали не выделенную геномную ДНК, а искусственные
конструкции с уже известным содержанием ГЦ, данное исследование дает более четкую
информацию о влиянии уровня ГЦ и определённых последовательностей в составе
вкДНК на ее взаимодействие с клеткой и биологическую активность.
Впервые показана взаимозависимость экспрессии ДНК-сенсоров TLR9 и AIM2.
Подтверждена роль этих ДНК-сенсоров в акцепции вкДНК при помощи таких методов,
как РНК-интерференция и CRISPR/Cas9, и проиллюстрированы механизмы
понижения/повышения выживаемости клетки MCF7 при «отключении» одного их этих
сенсоров.
Теоретическая и практическая значимость
Полученные результаты вносят ценный вклад в массив знаний о характеристиках
вкДНК при онкологической патологии. С точки зрения фундаментальной науки имеют
неоспоримую значимость полученные данные о механизмах и условиях проникновения
модельных вкДНК с известным ГЦ-составом, а также о вызываемых ими эффектах в
раковой клетке. Полученные данные могут быть экстраполированы на реальную вкДНК,
циркулирующую в крови больных РМЖ, что позволяет делать некоторые выводы о
потенциальном влиянии вкДНК на клетки опухоли в условиях организма.
Продемонстрированный в ходе исследования факт, что ГЦ-богатые вкДНК
вызывают DDR, повышающий резистентность раковой клетки к дальнейшему
воздействию, может прояснить некоторые вопросы клинической онкологии, связанные с
повышением устойчивости опухоли в процессе терапии.
Полученные результаты еще больше проясняют роль ДНК-сенсоров TLR9 и AIM2
во взаимодействии вкДНК с раковой клеткой. Показанная связь между экспрессией
рецепторов TLR9 и AIM2 может играть важную роль в дальнейшем изучении сигнальных
путей, активируемых ими, на других клеточных линиях.
Намечен ДНК-сенсор, «отключение» которого ведет к снижению выживаемости
клеток и активации апоптотического сценария вместо механизмов, направленных на
выживание раковых клеток. Этим сенсором оказался TLR9, что делает его перспективной
мишенью для дальнейших исследований и разработок в области противоопухолевой
терапии.
Степень достоверности результатов
Экспериментальные данные работы получены на большом фактическом
материале. В исследовании вкДНК в крови задействованы 68 больных РМЖ и 76 человек
без онкологической патологии. Все эксперименты с клеточной культурой проведены не
менее, чем в 3-х повторах. Достоверность полученных в исследовании результатов,
научных положений и выводов подтверждается статистическими методами. Нулевую
гипотезу об отсутствии различий между выборками проверяли при помощи U-критерия
Манна Уитни. Различия между выборками считали достоверными при p<0,05. Оценка распределений осуществлялась при помощи теста Колмогорова- Смирнова. Использованы следующие программы: Statistica 6.0, Excel (Microsoft), StatGraph. Соответствие диссертации паспорту научной специальности Диссертация соответствует формуле специальности 1.5.7. (03.02.07) – Генетика (биологические науки), охватывая проблемы процессов репарации (пункт 3 паспорта специальности), методы генетического анализа у прокариот и эукариот (пункт 5), реализация генетической информации (пункт 7), механизмы регуляции экспрессии генов (пункт 7), апоптоз (пункт 8), генетическая и клеточная инженерия (пункт 10), генетические основы биотехнологии (пункт 11). Апробация результатов исследования Результаты исследования доложены на конференции 44th FEBS Congress, From Molecules to Living Systems, Краков, Польша, 2019; Structural and molecular biology of the DNA damage response, Мадрид, Испания, 2019; 11th International Symposium on Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum (CNAPS), Иерусалим, Израиль; II Объединенном научном форуме, VI съезде физиологов СНГ, VI съезде биохимиков России, IX Российском симпозиуме «Белки и пептиды», Сочи, Россия, 2019; Конференция молодых ученых ФГБНУ «МГНЦ», Москва, Россия, 2019. Работа одобрена этическим комитетом и прошла экспертную комиссию, рекомендована к защите на заседании Диссертационного совета 24.1.168.01 при ФБГНУ

Заказать новую

Лучшие эксперты сервиса ждут твоего задания

от 5 000 ₽

Не подошла эта работа?

Закажи новую работу, сделанную по твоим требованиям

Читать

Помогаем с подготовкой сопроводительных документов

Совместно разработаем индивидуальный план и выберем тему работы Подробнее

Помощь в подготовке к кандидатскому экзамену и допуске к нему Подробнее

Поможем в написании научных статей для публикации в журналах ВАК Подробнее

Структурируем работу и напишем автореферат Подробнее

Хочешь уникальную работу?

Больше 3 000 экспертов уже готовы начать работу над твоим проектом!

Читаю лекции и веду занятия со студентами по матанализу, линейной алгебре и теории вероятностей. Защитил кандидатскую диссертацию по качественной теории дифференциальн... Читать все

Читаю лекции и веду занятия со студентами по матанализу, линейной алгебре и теории вероятностей. Защитил кандидатскую диссертацию по качественной теории дифференциальных уравнений. Умею быстро и четко выполнять сложные вычислительные работ

#Кандидатские #Магистерские

117 Выполненных работ

Окончила магистратуру Воронежского государственного университета в 2009 г. В 2014 г. защитила кандидатскую диссертацию. С 2010 г. преподаю в Воронежском государственно... Читать все

Окончила магистратуру Воронежского государственного университета в 2009 г. В 2014 г. защитила кандидатскую диссертацию. С 2010 г. преподаю в Воронежском государственном университете инженерных технологий.

#Кандидатские #Магистерские

66 Выполненных работ

Берусь за решение юридических задач, за написание серьезных научных статей, магистерских диссертаций и дипломных работ. Окончила Кемеровский государственный универси... Читать все

Берусь за решение юридических задач, за написание серьезных научных статей, магистерских диссертаций и дипломных работ. Окончила Кемеровский государственный университет, являюсь бакалавром, магистром юриспруденции (с отличием)

#Кандидатские #Магистерские

38 Выполненных работ

Работы пишу исключительно сама на основании действующих нормативных правовых актов, монографий, канд. и докт. диссертаций, авторефератов, научных статей. Дополнительно... Читать все

Работы пишу исключительно сама на основании действующих нормативных правовых актов, монографий, канд. и докт. диссертаций, авторефератов, научных статей. Дополнительно занимаюсь английским языком, уровень владения - Upper-Intermediate.

#Кандидатские #Магистерские

39 Выполненных работ

руководитель успешно защищенных диссертаций, автор около 150 работ, в активе - оппонирование, рецензирование, написание и подготовка диссертационных работ; интересы - ... Читать все

руководитель успешно защищенных диссертаций, автор около 150 работ, в активе - оппонирование, рецензирование, написание и подготовка диссертационных работ; интересы - медицина, биология, антропология, биогидродинамика

#Кандидатские #Магистерские

12 Выполненных работ

Стаж педагогической деятельности в вузах Москвы 15 лет, автор свыше 140 публикаций (РИНЦ, ВАК). Большой опыт в подготовке дипломных проектов и диссертаций по научной с... Читать все

Стаж педагогической деятельности в вузах Москвы 15 лет, автор свыше 140 публикаций (РИНЦ, ВАК). Большой опыт в подготовке дипломных проектов и диссертаций по научной специальности 12.00.14 административное право, административный процесс.

#Кандидатские #Магистерские

216 Выполненных работ

Преподаю англ язык более 10 лет, есть опыт работы в университете, школе и студии англ языка. Защитила кандидатскую диссертацию в 2009 году. Имею большой опыт написания... Читать все

Преподаю англ язык более 10 лет, есть опыт работы в университете, школе и студии англ языка. Защитила кандидатскую диссертацию в 2009 году. Имею большой опыт написания и проверки (в качестве преподавателя) контрольных и курсовых работ.

#Кандидатские #Магистерские

16 Выполненных работ

Красный диплом референта-аналитика информационных ресурсов, 8 лет преподавания. Опыт написания работ вплоть до докторских диссертаций. Отдельно специализируюсь на повы... Читать все

Красный диплом референта-аналитика информационных ресурсов, 8 лет преподавания. Опыт написания работ вплоть до докторских диссертаций. Отдельно специализируюсь на повышении уникальности текста и оформлении библиографических ссылок по ГОСТу.

#Кандидатские #Магистерские

132 Выполненных работы

Работаю на сайте четвертый год. Действующий преподаватель вуза. Основные направления: микробиология, биология и медицина. Написано несколько кандидатских, магистерских... Читать все

#Кандидатские #Магистерские

566 Выполненных работ