Изучение последствий активации арил-гидрокарбонового рецептора человека in vivo в исследованиях на Drosophila melanogaster

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Оценку специфичности активации генов-мишеней AhR в ответ на воздействие различных ксенобиотиков осуществляли в экспериментах с использованием специально созданной, генетически трансформированной линии дрозофил с применением новейших молекулярно-биологических и биохимических методов. Использовали эмбрионы, личинок и имаго дрозофилы, трасформированных генной конструкцией, содержащей ген AhR человека, поставленный под контроль UAS-последовательности. Это позволило активировать его транскрипцию при помощи GAL4-тканеспецифических драйверов в различных тканевых и органных системах дрозофилы. Продукты трансляции трансгена UAS-AhR человека активировали следующими лигандами: индирубином, бета-нафтафлавоном и индинолом. Помимо уникальной линии дрозофилы, полученной нашим коллективом, мы использовали линии, выписанные из международного коллекционного центра линий дрозофилы (Блумингтон, США). Этот ряд экспериментов включал гибридологический синтез линий, совмещающих в одном геноме различные мутации и генные конструкции. Синтезированные линии использовали для оценки как специфичности действия различных лигандов на процессы развития, так и на экспрессию спектра генов-мишеней, которые активирует AhR человека. Для прогнозирования сайтов связывания AhR человека в геноме дрозофилы использовали веб-инструменте LASAGNA-Search 2.0 на основе матрицы M00139 с консенсусной последовательностью nnnCnynwTnGCGTGnnn [Lee, Huang, 2013]. Для подтверждения экспрессии белка AhR человека в организме дрозофилы проводили электрофорез белков по стандартному протоколу [Laemmli, 1970]. Белок выделяли из 30-40 голов дрозофил для каждого образца. На молекулярном уровне для сравнительного анализа спектра транскрипции генов-мишеней AhR использовали метод полимеразной цепной реакции в реальном времени. Каждый эксперимент был проведен в 2-3 биологических повторностях, по 3 технические повторности в каждой. Тотальную РНК выделяли из 20 голов, органов или целых тел. Анализ данных, полученных в ходе ПЦР-РВ, проводили при помощи программного обеспечения 7500 Software v 2.3 (Applied Biosystem, США). Статистическую значимость различий между образцами для экспериментов оценивали с помощью программного обеспечения REST (Qiagen, США) [Pfaffl et al., 2002] с использованием парного теста рандомизации с фиксированным перераспределением с 2000 перестановок. Оценку морфогенетических эффектов влияния исследуемых лигандов выполняли с использованием световой и конфокальной микроскопии. Препараты окрашивали, используя стандартные иммуногистохимические методы и специфические флуоресцентно меченые антитела. Оценка соматических клеток на конфокальных изображениях иммунофлуоресцентно окрашенных семенников проводилась при помощи программного обеспечения Imaris® 5.0.1 (Bitplane AG). Размер выборки в одном опыте составлял 10-20 особей для каждого лиганда. В
экспериментах с драйверными линиями Tj-GAL4 и NOS-GAL4, статистический анализ проводили с использованием t-критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Получение трансгенной линии UAS-AhR Drosophila melanogaster
Главным условием для проведения запланированных экспериментов было получение линии дрозофил с управляемой экспрессией гена AhR человека под индуцибельным промотором. С этой целью были получены трансгенные дрозофилы, экспрессирующие ген AhR человека под индуцибельным дрожжевым промотором UAS, для активации его в двухкомпонентной системе UAS/GAL4 (рис 1.).
Рисунок 1. Схема эксперимента.
Схема предполагаемой активации AhR человека в организме дрозофилы экзогенными лигандами. Для активации тканеспецифической и убиквитарной экспрессии AhR, дрозофил различных драйверных линий (RE-GAL4) скрещивали с дрозофилами репортерной линии (UAS-AhR). Полученное потомство пересаживали на корм с добавление одного из трех экзогенных лигандов (индирубина, бета- нафтофлавона или индинола). При попадании ксенобиотика в клетку, AhR должен был связывается с ним как с лигандом и активировать экспрессию своих генов-мишеней.
Наличие конструкта в геноме дрозофилы было подтверждено методом ПЦР с использованием специфичной пары праймеров (рис. 2А). Правильная UAS-опосредованная индуцибельная экспрессия конструкции UAS-AhR была подтверждена с помощью ОТ-ПЦР и Вестерн-блот анализа потомства, полученного в результате скрещивания дрозофил линий UAS-AhR и Elav-GAL4, выращенных на стандартной среде (контроль) и среде с добавлением лиганда (рис. 2Б-В). На рисунке 2Б (дорожки 1 и 2) видно наличие амплифицированного фрагмента после индукции экспрессии UAS-AhR драйвером Elav-GAL4, что доказывает наличие РНК AhR, а соответственно и его экспрессии в головах дрозофил Elav-GAL4>UAS-AhR. На рисунке 2В (дорожки 1 и 2) видно наличие белка AhR в образцах, полученных из голов дрозофил Elav-GAL4>UAS-AhR.
Хромосомное картирование показало, что конструкт UAS-AhR локализован во II хромосоме. В результате молекулярного картирования и дальнейшего биоинформатического анализа в программе BLAT, мы подтвердили встройку конструкта в свободную от генов область на 2-й хромосоме (рис. 2Г). Экспрессия близлежащего гена CG30424 у дрозофил линии UAS-AhR не менялась (рис. 2Д).
Рисунок 2. Подтверждение инсерции конструкции, кодирующей AhR человека и анализ её экспрессии в трансгенной линии дрозофил. (A) ПЦР-анализ геномной ДНК с использованием AhR-специфических праймеров. 1 – дрозофилы линии UAS-AhR. 2 – дрозофилы линии w1118 (контроль). (Б) ОТ–ПЦР мРНК выделенной из голов дрозофил Elav- GAL4>UAS-AhR, выращенных на среде с добавлением индинола (1, 4) или без добавок (2, 5), и из голов дрозофил линии UAS-AhR (3, 6). ОТ-ПЦР проводили с AhR-специфическими праймерами (1–3) или с тубулин- специфическими в качестве контроля для нанесения (4–6). (В) Вестерн-блот анализ экспрессии AhR человека. Образцы выделяли из голов дрозофил Elav-GAL4>UAS-AhR, выращенных на среде с добавлением индинола (1), на стандартной среде (2), голов дрозофил линии UAS-AhR в качестве отрицательного контроля (3). Мембрану инкубировали с антителами против AhR человека. В качестве контроля для нанесения использовали антитела против актина. (Г) Молекулярное картирование района встраивания конструкции, несущей ген AhR человека, в геноме дрозофилы. Красная стрелка указывает положение вставки UAS-AhR на карте 2 хромосомы в цитологической области 60E11 между локусами генов CG30424 и Rpl19 (40 п.н. выше неизвестного гена CG30424 и приблизительно 540 п.н. ниже Rpl19). (Д) Экспрессия гена CG30424 у имаго контрольной линии w1118 и линии с инсерцией конструкта UAS-AhR.
Таким образом, мы получили трансгенную линию дрозофил с подтверждённой индуцибельной экспрессией AhR человека.
Убиквитарная экспрессия AhR человека у D. melanogaster
Последствия убиквитарной индукции UAS-AhR человека драйвером Tub- GAL4, без применения ксенобиотиков, привели к тотальной гибели особей. Гибель происходила в эмбрионально-личиночный период развития (рис. 3).
Рисунок 3. Последствия убиквитарной индукции UAS-AhR человека на ранних стадиях развития личинки. Фотография демонстрирует двух четырехдневных личинок, слева – крупная личинка UAS-AhR/+; UAS-GFP/Tb (контроль), справа – светящаяся личинка UAS-AhR/+; UAS-GFP/Tub-GAL4 с убиквитарной экспрессией трансгенного AhR.
Тотальная гибель дрозофилы на ранних стадиях развития, в отсутствии обладающих лигандной активностью ксенобиотиков, свидетельствует о наличии эндогенных лигандов, способных активировать AhR человека, эктопическая экспрессия которого останавливает развитие и приводит к гибели. Очевидно, активированный AhR изменял паттерны экспрессии генов, участвующих в процессах развития, что вероятно и являлось причиной гибели организма.
Активация AhR в нервной и генеративной системе
Эктопическую экспрессию AhR человека в генеративных клетках яичников дрозофилы индуцировали при помощи драйверов NOS-GAL4 и MTD- GAL4. В результате добавления экзогенных лигандов в кормовую среду примерно 25 % самок NOS>AhR (N=25 для индирубина и N=28 для БНФ) были стерильны.
Иммуногистохимический анализ яичников стерильных самок MTD>AhR, развивавшихся на корме с лигандом, показал нарушение формирования монослоя фолликулярных клеток, деградацию яйцевых камер и лишний раунд митоза при делении цистоцитов (5 раундов митоза вместо 4), в результате чего происходило формирование не 16, а 32-клеточные цисты (рис. 4Б-Г).
Рисунок 4. Активация AhR в генеративных клетках и нервной системе вызывает различные нарушения во время оогенеза и нейрогенеза у Drosophila. Конфокальный срез нормальной овариолы самки MTD-GAL4/UAS-AhR развивавшейся на стандартной кормовой среде без добавления лиганда (А); Деградация яйцевой камеры самки MTD-GAL4/UAS-AhR росшей на среде с добавлением бета-нафтофлавона (стрелками показаны пикнотические ядра) (Б); яйцевая камера с дезорганизованным фолликулярным слоем (обозначен стрелкой) у самки MTD-GAL4/UAS-AhR, развивавшейся на среде содержащей индинол (В); фолликул с 32 трофоцитами и отсутствием ооцита (обозначен стрелкой) у самки MTD-GAL4/UAS-AhR росшей на среде с добавлением индирубина (Г). Овариолы для визуализации ДНК окрашивали Sytox Green (зеленый) и фаллоидином (красный) для визуализации цитоскелета. * – ооцит, Т – трофоцит и ФК – фолликулярные клетки. Прижизненные препараты оптических долей и торакальных ганглиев личинок Elav-GAL4>UAS-AhR 3-го позднего возраста (Д-Е). Мозг и торакальный ганглий личинки, росшей на стандартной кормовой среде (Д) значительно больше, чем у личинки, росшей на среде с добавлением БНФ (Е). ТГ – торакальный ганглий. Экспрессия Elav-GAL4 визуализирована по экспрессии белка GFP.
Мы оценили динамику гибели эмбрионов в потомстве самок NOS>AhR, получивших дозу индирубина. Данные представлены на графике (рис. 5).
Максимальная гибель эмбрионов в потомстве самок всегда наблюдалась на третий день после прекращения кормления их ксенобиотиком (рис. 5). Затем выживаемость восстанавливалась. После отмены действия ксенобиотика фертильность самок восстанавливалась примерно на 3 день.
Эктопическую
индуцировали при помощи драйвера Elav-GAL4 и ксенобиотиков – индирубина, бета-нафтофлавона (БНФ) и индинола, которые по литературным данным
экспрессию AhR 11
человека
в ЦНС дрозофилы
Рисунок
гибели
потомстве
NOS>AhR,
кормом с индирубином и стандартной кормовой средой без лиганда (контроль).
5. Динамика эмбрионов в самок питавшихся
Динамика гибели эмбрионов
50
30
10
*
*
12345
Без лиганда Индирубин
% погибших эмбрионов

являются лигандами-агонистами [Busbee et al., 2013; Murray al., 2014; Ishida, Takechi, 2019], что в итоге приводило к тотальной гибели эмбрионов и личинок. В отсутствии ксенобиотиков транскрипция AhR человека в нервных клетках не нарушала развитие дрозофилы. Вероятно, в нейробластах дрозофилы отсутствуют лиганды способные активировать AhR человека. Добавление экзогенных лигандов в кормовую среду личинок Elav-GAL4/+, не влияло на их жизнеспособность.
Мы исследовали морфологию ЦНС личинок 3-го возраста, визуализированной с помощью GFP. Активация AhR человека в нейронах личинок Elav-GAL4>UAS-AhR приводила к нарушению сегментации и симметрии их торакального ганглия. Размеры мозга и торакального ганглия личинок, развивавшихся на среде с ксенобиотиком, были меньше по сравнению с размером мозга личинок, развивавшихся на стандартной кормовой среде (рис. 4). Мы отметили, что размер самих личинок не отличался от контрольных. Очевидно, у личинок Elav-GAL4>UAS-AhR, росших на среде с ксенобиотиком, шла остановка развития ЦНС – именно той ткани, в которой шла индукция и активация AhR.
Далее мы провели поиск предполагаемых генов-мишеней AhR человека среди их гомологов у дрозофилы и исследовали уровень их экспрессии.
Гены-мишени AhR человека у Drosophila
Поиск предполагаемых генов-мишеней AhR у дрозофилы проводили среди гомологов известных генов-мишеней AhR человека, в области регуляторных элементов, которых был обнаружен XRE (Xenobiotic response element) – потенциальный сайт связывания AhR человека (табл. 1). Ген Rpl32, который использовали в качестве референсного в экспериментах с ПЦР в реальном времени, этот элемент не содержал.
Таблица 1. Набор генов-мишеней AhR у Drosophila, используемых в анализе RT- PCR.
Функция кодируемого белка
Символ гена
Mgat1
Гомолог гена человека Mgat1, имеет ацетилглюкозаминилтрансферазную активность.
GstT4
Гомолог гена человека GstT4, участвует в окислительно – восстановительных процессах.
Cyp6g1
Гомолог гена человека TBXAS1, участвует в окислительно – восстановительном процессах.
Rel
р53
Гомолог гена человека, кодирующего субъединицу RelA NF-kB, участвует в позитивной регуляции экспрессии генов.
Гомолог гена человека TP53, транскрипционный фактор, для адаптивного ответа на генотоксические стрессы.
Myc
Гомолог гена человека Myc, транскрипционный фактор, является протоонкогеном.
12

dap
Rbf
Cdc42
Гомолог гена человека p27, участвует в регуляции клеточного цикла.
Гомолог гена человека RBL2, участвует в регуляции клеточного цикла.
Jra
Гомолог гена человека JunD, транскрипционный фактор, участвует в регуляции клеточного цикла.
Гомолог гена человека Cdc42, играет ключевую роль в организации актинового цитоскелета.
dl
Sox70
Гомолог гена человека NF-kB, является транскрипционным фактором, участвует в позитивной регуляции процессов иммунного ответа.
Гомолог гена человека Sox11, является транскрипционным фактором.
ST6Gal
Гомолог гена человека ST6GAL1, обладает сиалилтрансферазной активностью.
Csas
Гомолог гена человека Csas. ключевой фермент пути сиалирования.
Nans
Гомолог гена человека Nans, участвует в процессах углеводного биосинтеза и гликозилирования.
Анализ экспрессии генов-мишеней AhR в ЦНС дрозофилы
Сравнительный анализ транскрипции генов-мишеней AhR в ЦНС личинок третьего возраста генотипа Elav-GAL4>UAS-AhR показал существенное увеличение экспрессии генов-мишеней AhR при добавлении экзогенных лигандов в кормовую среду (рис. 6). Добавление индинола в кормовую среду приводит к увеличению экспрессии гена Myc в 200 раз. Экспрессия остальных генов, включая Rbf, dap, Cdc42, участвующих в регуляции клеточного цикла, также значительно возрастала. Немного слабее на воздействие ксенобиотика реагируют гены dl, Rel и Sox 70, которые участвуют в процессах развития. Слабее всего реагируют гены p53, Jra и GstT4 (рис. 6).
Рисунок 6. Изменения экспрессии генов-мишеней AhR в центральной нервной системе личинок Elav-GAL4>UAS-AhR при воздействии лигандов. Отображение данных полученных в экспериментах ПЦР-РВ. Красный цвет – уровень экспрессии по сравнению с контролем падал; темно зеленый – увеличивался больше чем в 5 раз; зеленый – увеличивался меньше чем в пять раз; белый – не менялся. IR – индирубин, BNF – бета-нафтофлавон, IND – индинол. Различия считались значимыми, если p ≤ 0,05.
Меньший рост уровня экспрессии наблюдается под воздействием двух других экзогенных лигандов – индирубина и БНФ. Слабее всего гены-мишени AhR человека реагировали на индирубин. Более того, мы отметили понижение уровня экспрессии генов: Mgat1, GstT2, Relish и Jra, два последних из которых участвуют в процессах развития (рис. 6). Под воздействием БНФ понижения экспрессии генов-мишеней AhR не наблюдалось, но и рост был не такой значительный, как при воздействии индинола.
В ЦНС имаго, в отличие от мозга личинки, гены-мишени AhR реагировали значительно слабее или могли не реагировать вообще. Воздействие экзогенных лигандов на имаго вызывало три вида эффектов: слабый рост уровня экспрессии генов-мишеней AhR, падение уровня экспрессии или реакция на воздействие отсутствовала (рис. 7).
Рисунок 7. Изменения в уровне экспрессии генов-мишеней AhR в ЦНС имаго Elav- GAL4>UAS-AhR, которых кормили средой с добавлением лиганда на протяжении 2 суток. Отображение данных полученных в экспериментах ПЦР-РВ. Обозначения, как на рис. 6.
Анализ уровня экспрессии генов-мишеней AhR человека в ЦНС личинок дрозофилы, показал усиление их транскрипции при воздействии индинолом и БНФ, однако под воздействием индирубина наблюдалось снижение уровня экспрессии генов, некоторые из которых вовлечены в процессы развития. Воздействие теми же лигандами на имаго не приводило к таким масштабным изменениям в уровне экспрессии генов-мишеней, и не влияло на жизнеспособность дрозофил. Таким образом, лиганды, которые по литературным данным, полученным в экспериментах ex vivo на клеточных культурах, являются агонистами (повышают уровень транскрипции генов- мишеней AhR), в условиях in vivo могут проявлять свойства антагонистов.
Эктопическая активация AhR в глазных имагинальных дисках дрозофилы
Гибриды GMR-GAL4>UAS-AhR с активной экспрессией AhR в глазных имагинальных дисках не имели видимых дефектов в морфологии (N=50), что говорит об отсутствии эндогенных лигандов в глазных структурах дрозофилы на всех этапах развития организма. При введении экзогенных лигандов AhR в кормовую среду личинок 3-го возраста GMR-GAL4>UAS-AhR, мы наблюдали морфологические изменения структуры фасеточного глаза у дрозофил (рис. 8).
БНФ вызывал нарушение рядности омматидиев, топографии распределения щетинок и их слияние. Воздействие индирубина вызывало уменьшение размера глаза, числа омматидиев и щетинок. Добавление индинола в кормовую среду личинок приводило к уменьшению размера глаза, числа омматидиев, нарушало их структуру и значительно сокращало количество механорецепторов.
Анализ уровня экспрессии генов-мишеней AhR показал, что после воздействия индинола экспрессия гена dl повышалась почти в 10 раз, также повышалась экспрессия St6Gal, Rbf, p53, Rel, но экспрессия гена Cdc42 слабо понижалась (рис. 9). Индирубин вызывает в основном понижение экспрессии или не оказывает эффекта, за исключением гена St6Gal, чья экспрессия немного повышена. БНФ вызывает повышение экспрессии Rel и понижение экспрессии генов p53, dap, Jra, Cdc42, Myc и Mgat1.
Рисунок 8. Фенотип фасеточных глаз дрозофил GMR-GAL4>UAS-AhR. У дрозофил, развивавшихся на стандартной среде, омматидии расположены четкими ровными регулярными рядами. Добавление экзогенного лиганда, вызывало выраженный «грубый» фенотип глаз, характеризующийся нерегулярным рисунком и изменённым количеством механорецепторов.
Рисунок 9. Изменения в уровне экспрессии генов-мишеней AhR в головах дрозофил GMR-GAL4>UAS-AhR. Отображение данных полученных в экспериментах ПЦР-РВ. Обозначения, как на рис. 6.
Активация AhR экзогенными лигандами в глазных имагинальных дисках давала такой же разнонаправленный эффект, что и в ЦНС дрозофилы – часть генов-мишеней AhR не повышала свой уровень экспрессии.
Таким образом, при эктопической экспрессии AhR человека под контролем тканеспецифических драйверов и активации его функции различными экзогенными лигандами, возможны 3 варианта развития событий: повышение уровня экспрессии генов-мишеней, понижение экспрессии или отсутствие последствий воздействия лигандов. Наблюдаемый разнонаправленный эффект действия экзогенных лигандов на экспрессию генов-мишеней AhR ранее не был описан, так как используемые нами в работе лиганды, по литературным данным, полученным в экспериментах ex vivo на клеточных культурах [Busbee et al., 2013; Murray al., 2014; Ishida, Takechi, 2019], являются агонистами по отношению к AhR человека и должны только активировать экспрессию его генов-мишеней.
Регуляция активности AhR человека эпигенетическими модификаторами хроматина группы Polycomb
Неспособность ряда генов-мишеней AhR (например, Sox70, Mgat1, dl, p53, dap и Cdc42) повышать уровень экспрессии в ответ на воздействие
ксенобиотиков в нашей модельной системе в условиях in vivo предполагает наличие регулирующих факторов, которые ограничивают способность AhR активировать экспрессию его генов-мишеней. Такими регуляторами могут быть эпигенетические факторы группы Polycomb (PcG), которые путем модификации структуры хроматина ограничивают доступ регуляторным белкам к сайтам связывания на ДНК. Поскольку эти факторы поддерживают транскрипционно-молчащий статус генов, установленный во время дифференцировки клеток, это могло бы объяснить отсутствие ответной реакции на воздействие экзогенных лигандов AhR у ряда генов в дифференциированных тканях.
Чтобы проверить нашу гипотезу, мы использовали мутантных дрозофил, несущих нуль-аллель (Pc4) гена Polycomb – кодирующего ключевой белок семейства эпигенетических регуляторов PcG, который входит в состав репрессирующего комплекса PRC1 [Grossniklaus, Paro, 2014]. В результате мы обнаружили повышение уровня транскрипции ранее не4 реагировавших генов- мишеней AhR человека у дрозофил GMR>AhR; Pc /+ после добавления лиганда, по сравнению с дрозофилами того же генотипа развивавшихся на стандартной среде (рис. 10).
Рисунок 10. Повышение уровня экспрессии генов-мишеней AhR в головах имаго GMR- GAL4/UAS-AhR; Pc4/+. На стадии личинки третьего возраста дрозофил пересаживали на корм с добавлением индирубина (зеленый), БНФ (фиолетовый) или на стандартную среду без добавления лиганда (синий). Представленные данные являются репрезентативными для двух независимых экспериментов. Звездочка указывает на значимое различие в экспрессии генов по сравнению с контролем (* p ≤ 0,05).
Такую же реакцию мы наблюдали при введении в кормовую среду личинок 3-го возраста GMR>AhR ингибиторов гистоновой метилтрасферазы
E(z) (UNC1999) и гистоновой деацетилазы HDAC (белиностат), двух ключевых эпигенетических ферментов, и экзогенных лигандов (рис. 11).
Рисунок 11. Повышение уровня экспрессии генов-мишеней AhR в головах имаго GMR-GAL4>UAS- AhR. Дрозофил, при достижении 3-й поздней личиночной стадии, помещали на кормовую среду с добавлением ингибитора метилтрансферазы – UNC1999 (A) или ингибитора деацетилазы – белиностат (Belinostat) (Б), и лигандов индирубина (IR, зеленый) и БНФ (BNF, фиолетовый), в качестве контроля использовали стандартную кормовую среду без добавления ксенобиотиков (синий). Представленные данные являются репрезентативными для двух независимых экспериментов. Звездочка указывает на значимое различие в экспрессии генов по сравнению с контролем (* p ≤ 0,05).
Вероятно,
ответственных за тканеспецифическую локальную конденсацию хроматина, меняется хроматиновый статус регуляторных областей генов-мишеней, делая их доступными для взаимодействия с AhR, что приводит к активации экспрессии этих генов.
Последствия эктопической активации AhR экзогенными лигандами в ходе сперматогенеза D. melanogaster
В семенниках Drosophila драйвер Tj-GAL4 активирует UAS-конструкции в соматических клетках, контактирующих с генеративными клетками. У дрозофилы это клетки, гомологичные клеткам Сертоли человека, выполняющие трофическую функцию по отношению к герминативным клеткам [Spradling et al., 2011].
Чтобы оценить последствия эктопической экспрессии AhR человека мы рассчитали плодовитость самцов Tj-GAL4>UAS-AhR, сидевших на кормовой среде с добавлением ксенобиотиков, по доле неразвившихся яиц, отложенных самками, которых они оплодотворяли. Доля неразвившихся яиц от самцов, подвергавшихся действию ксенобиотиков, была значительно выше по сравнению с самцами, сидевшими на стандартной диете (рис. 12).
вследствие
инактивации
эпигенетических факторов,
Рисунок 12. Посуточное влияние экзогенных лигандов на долю неразвившихся яиц, отложенных самкой дикого типа после скрещивания с самцами UAS-AhR/Tj-GAL4, питающихся стандартной средой (контроль, оранжевый), или кормовой средой с добавлением лиганда: индирубина (синий), БНФ (голубой) или индинола (зеленый).
Самый сильный эффект был вызван индирубином и БНФ в первые два дня после кормления. Примечательно, что эти эффекты полностью обратимы: когда самцов дрозофил, которых кормили ксенобиотиками, переводили обратно на стандартную диету, их плодовитость быстро восстанавливалась. Похожий эффект мы наблюдали у самок NOS>AhR – отмена действия ксенобиотика восстанавливала их фертильность (рис. 7).
Мы предположили, что снижение плодовитости самцов было вызвано нарушениями в клетках семенников, участвующих в формировании функциональных сперматозоидов. В семенниках Drosophila стволовые клетки зародышевой линии и соматические стволовые клетки-предшественники находятся в апикальной части семенника, известной как хаб [Davies, Fuller, 2008]. Соматические стволовые клетки важны для дифференцировки клеток зародышевой линии. Поскольку мы использовали драйвер Tj-Gal4 для генерации мисэкспрессии AhR, мы предположили, что причина снижения плодовитости самцов Tj-GAL4>UAS-AhR, в ответ на воздействие экзогенных лигандов, может быть связана с нарушением деления соматических стволовых клеток цисты.
Подсчет количества соматических клеток в семенниках дрозофил Tj- GAL4>UAS-AhR показал снижение среднего числа клеток, окрашенных антителами против Tj, на семенник (индирубин 75,8 ± 6,19, N = 18; БНФ: 86 ± 9,7, N = 13; индинол: 79,8 ± 8,1, N = 14) по сравнению с самцами, сидевшими на стандартной диете (106,3 ± 8,25; N = 24). Кроме того, размер апикальной части семенников дрозофил, потребляющих экзогенные лиганды, был меньше (рис. 13).
Таким образом, мы показали, что снижение плодовитости самцов Tj- GAL4>UAS-AhR, сопровождается сокращением количества соматических клеток цисты в ответ на активацию AhR человека экзогенными лигандами. Этот факт может стать причиной снижения продукции сперматозоидов, поскольку по литературным данным, отсутствие стволовых соматических
клеток цисты в семенниках дрозофил блокирует нормальный сперматогенез [Li et al., 2003].
Рисунок 13. Ксенобиотик-опосредованная активация AhR человека в семенниках дрозофилы, вызывает снижение количества Tj-позитивных клеток. (А) Схема строения семенника. (Б–Д) Конфокальные срезы имунногистологических препаратов апикального конца семенника окрашенные SytoxGreen, для визуализации ДНК (зеленый), и анти-Tj, для визуализации соматических клеток цисты (красный). Третья колонка представляет объединенные изображения. (Б) Семенники дрозофил, питавшихся в течение 3 дней стандартной кормовой средой или средой с содержанием (В) индирубина, (Г) БНФ, (Д) индинола. Все самцы имели один и тот же генотип – Tj-GAL4>UAS-AhR. Размер апикальной области семенников у самцов, получавших ксенобиотики, меньше, чем у самцов, которых кормили стандартной средой. ГСК – герминативные стволовые клетки, СКЦ – соматические клетки цисты.
Далее мы исследовали уровень экспрессии генов-мишеней AhR в семенниках Tj-GAL4>UAS-AhR.
Влияние экзогенных лигандов и нуклеотропного шаперона CG5017 на экспрессию генов-мишеней AhR в семенниках дрозофилы
В семенниках дрозофил Tj-GAL4>UAS-AhR активация AhR экзогенными лигандами приводила к тому же разнонаправленному эффекту, что и в тканях
описанных нами ранее: рост уровня экспрессии, снижение экспрессии и отсутствие реакции генов-мишеней (рис. 14).
Например, активация AhR человека индирубином привела к увеличению экспрессии почти у всех протестированных генов, кроме Mgat1, Cyp6g1 и Myc. Активация AhR БНФ приводила к увеличению уровня экспрессии генов Cyp6g, Rel и Myc, а также к понижению уровня экспрессии генов Mgat1 и dap. Активация AhR человека с помощью индинола приводила к снижению уровня экспрессии Cyp6g и слабой активации генов Mgat1, GstT4, Csas, Rel, p53, Myc и Jra (рис. 14, табл. 2).
Рисунок 14. Плейотропные эффекты воздействия экзогенных лигандов AhR человека на уровень мРНК его генов-мишеней в семенниках дрозофил UAS-AhR/Tj-GAL4. Относительный уровень мРНК анализировали с помощью метода ПЦР в реальном времени в образцах полученных из семенников дрозофил UAS-AhR/Tj-GAL4, которых кормили кормовой средой с добавлением индирубина, БНФ или индинола в течение 2 дней. В качестве контроля использовали мух того же генотипа, но питавшихся кормовой средой без добавления ксенобиотиков. Статистический анализ проводили с использованием t-критерия Стьюдента (* p ≤ 0,01).
При активации AhR человека экзогенными лигандами в семенниках дрозофил Tj-GAL4>UAS-AhR мы обнаружили тот же разнонаправленный эффект, зависящий от типа лиганда, как и в предыдущих экспериментах. Мы связали неспособность некоторых генов-мишеней AhR реагировать на его активацию, с эпигенетическим репрессивным состоянием хроматина их регуляторных районов.
Ранее было показано, что CG5017 (белок семейства NAP, члены которого участвуют в эпигенетической регуляции транскрипции) и Spineless (Ss, гомолог AhR млекопитающих D. melanogaster) действуют синергически, контролируя морфогенез, память и детоксикацию [Kuzin et al., 2014]. Синергия в генетических взаимодействиях между гипоморфными мутациями ss и CG5017 может отражать участие шаперонов семейства NAP в регуляции AhR- сигнального пути. Поэтому мы изучили влияние CG5017 на транскрипцию генов-мишеней AhR человека в соматических клетках семенников Tj-
GAL4>UAS-AhR; ssaSc, несущих мутантный гипоморфный аллель CG5017 – ssaSc (табл. 2).
Активация AhR ксенобиотиками на фоне мутантного аллеля CG5017 увеличивала уровень экспрессии генов-мишеней AhR, участвующих в поддержании клеточного гомеостаза (табл. 2). Воздействие индирубина приводило к сильному росту уровня экспрессии гена Cyp6g1 (увеличение уровня экспрессии в 22 раза). Воздействие БНФ приводило к увеличению экспрессии Mgat1 (рост до 3–5 раз) и увеличивала уровень экспрессии генов GstT4, Csas и Nans. Воздействие индинола не очень выражено и приводило к увеличению экспрессии Cyp6g1. С другой стороны, уровень транскрипции генов, регулирующих пролиферацию и дифференцировку клеток, либо не затрагивался, либо снижался (табл. 2).
Таблица 2. Лиганд-зависимая экспрессия генов-мишеней AhR на фоне гипоморфной мутации гена нуклеотропного шаперона CG5017. Обобщенные результаты экспериментов ПЦР в реальном времени в семенниках дрозофил Tj-GAL4>UAS-AhR (столбец +/+) и Tj-GAL4>UAS-AhR; ssaSc (столбец ssaSc). «+», «-» и «0» означают рост уровня экспрессии, снижение уровня экспрессии и отсутствие эффекта соответственно.
Поскольку CG5017 принадлежит к семейству белков сборки нуклеосом (NAP) и может участвовать в эпигенетической регуляции, мы предполагаем, что этот нуклеотропный шаперон ограничивает доступ AhR человека к определенному набору его генов-мишеней в соматических клетках во время сперматогенеза. Однако не все гены реагировали на пониженную экспрессию нуклеотропного шаперона CG5017. Вероятно, помимо CG5017 доступ к регуляторным зонам генов-мишеней AhR в ходе сперматогенеза ограничивают и другие эпигенетические факторы.