Клинико-экспериментальное обоснование технологии задней послойной кератопластики с использованием ультратонкого трансплантата, заготовленного с эндотелиальной поверхности роговицы с помощью низкочастотного фемтосекундного лазера

Материал и методы исследования
Общая характеристика экспериментального материала
Первая часть экспериментальной работы включала в себя изучение и
сравнительный анализ воздействия на эндотелиальные клетки и кератоциты
двух различных фемтолазерных систем.
Дляэтогометодомприжизненногоокрашиванияспомощью
флуоресцентного красителя, после заготовки трансплантата толщиной 130
мкм при помощи двух различных фемтолазерных установок, были
исследованы 10 свиных роговиц.
Группа 1 состояла из 5 свиных корнеосклеральных дисков, из которых в
последствиибылизаготовленыультратонкиетрансплантатыс
эндотелиальной поверхности роговицы при помощи низкочастотного ФСЛ.
Группа 2 включала 5 свиных корнеосклеральных дисков, из которых
впоследствиибылизаготовленыультратонкиетрансплантатыс
эндотелиальной поверхности роговицы при помощи высокочастотного ФСЛ.
Вторая часть экспериментальной работы заключалась в количественной
оценке качества формируемой стромальной поверхности трансплантатов,
заготовленных при помощи двух различных ФСЛ методом атомно-силовой
микроскопии.
В группу 1 были включены 10 кадаверных роговичных дисков, которые
были получены после выкраивания ультратонкого роговичного трансплантата
при помощи низкочастотного ФСЛ.
В группу 2 были включены 10 кадаверных роговичных дисков, которые
были получены после выкраивания ультратонкого роговичного трансплантата
с использованием высокочастотного ФСЛ.

Общая характеристика клинического материала
Исследование основывалось на сравнительном анализе данных клинико-
функциональных исследований и результатов хирургического лечения 101
пациента (101 глаза) с дистрофией роговицы Фукса и псевдофакичной
буллезной кератоптаией. У пациентов с ДФ также была диагностирована
катаракта разной степени выраженности. Всем пациентам была выполнена
ФЛ-ЗПК с применением ультратонких трансплантатов, заготовленных при
помощи двух различных ФСЛ. Все пациенты, которые вошли в исследование,
обратилисьвголовнуюорганизациюФГАУ«НМИЦ«МНТК
«Микрохирургия глаза» и МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад.
С.Н. Федорова» Минздрава России с жалобами на выраженное снижение
зрения или отсутствие предметного зрения, пациенты с выраженной ПБК
также жаловались на слезотечение, светобоязнь, боли.
В зависимости от выявленной клинической патологии и вида
хирургического лечения все пациенты были разделены на 4 группы.
Группа 1А – пациенты с катарактой и ДФ, которым одномоментно
выполненакомбинированнаяоперацияФЛ-ЗПКсиспользованием
низкочастотногоФСЛ+факоэмульсификациякатаракты(ФЭК)+
имплантация интраокулярной линзы (ИОЛ) в капсульный мешок (25
пациентов, 25 глаз).
Группа 1Б – пациенты с ПБК и артифакией, которым была выполнена
ФЛ-ЗПК с использованием низкочастотного ФСЛ (24 пациента, 24 глаз).
Группа 2А – пациенты с катарактой и ДФ, которым одномоментно
выполненакомбинированнаяоперацияФЛ-ЗПКсиспользованием
высокочастотного ФСЛ + ФЭК + имплантация ИОЛ в капсульный мешок (27
пациентов, 27 глаз).
Группа 2Б – пациенты с ПБК и артифакией, которым была выполнена
ФЛ-ЗПК с использованием высокочастотного ФСЛ (25 пациентов, 25 глаз).
Критериями включения пациентов были наличие эндотелиальной
дистрофии роговицы в развитой или далеко зашедшей стадиях, на основании
классификации Волкова В.В. и Дронова М.М. (1978), которая также
применима к первичной дистрофии роговицы Фукса и отражает поражение и
вовлечение основных тканевых структур роговицы пациента. Для групп 1А и
2А критерием включения служило дополнительное наличие возрастной
катаракты.
К наличию развитой стадии относились пациенты, которые имели
стойкий отек эндотелия и стромы, множественные складки ДМ, что можно
было визуализировать при выполнении биомикроскопии. По данным
кератопахиметрии, данная стадия характеризовалась центральной толщиной
роговицы (ЦТР) >640 мкм.
Пациенты с далеко зашедшей стадией характеризовались наличием
выраженного диффузного стромального и эпителиального отека роговицы,
буллезностью эпителия. ЦТР находилась в диапазоне от 700 до 1010 мкм.
Пациенты с выраженным роговичным синдромом до операции получали
консервативное лечение в виде корнеопротекторов и временного ношения
мягкой контактной линзы.
Критериями исключения пациентов из исследования были следующие
параметры: отказ пациента от участия в исследовании, тяжелое соматическое
состояние пациента, выраженные необратимые изменения в строме роговицы,
неоперабельная отслойка сетчатки, рубцовая стадия возрастной макулярной
дегенерации (ВМД), амблиопия высокой степени, терминальная глаукома,
глаукома с некомпенсированным внутриглазным давлением (ВГД).
Всем пациентам было выполнено комплексное клинико-функциональное
обследование, которое включало в себя следующие исследования: визометрия
скоррекциейибез,авторефрактометрия,тонометрия,периметрия,
электрофизиологические исследования зрительного нерва (определение
порогов электрической чувствительности и лабильности), биомикроскопия,
офтальмоскопия, ультразвуковая эхобиометрия, кератотопография, подсчет
плотности эндотелиальных клеток, оптическая когерентная томография,
Шаймпфлюг денситометрия.
Вкачествеописательнойстатистикииспользовалисреднеесо
стандартным отклонением (M±SD). Нормальность распределения имеющихся
переменных оценивалась с использованием теста Шапиро-Уилка. Во время
оценкиполученныхрезультатовстатистическизначимымисчитали
результаты при значениях p≤0,05. Статистическую обработку полученных
данных и визуализацию результатов осуществляли с использованием
программы GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, Inc., США).

Результаты экспериментальной части
Новая технология заготовки трансплантата с использованием
низкочастотного фемтосекундного лазера
Длязаготовкиультратонкоготрансплантатаиспользовалась
низкочастотная фемтолазерная установка немецкого производства с плоским
аппланационныминтерфейсом,которыйобуславливаетравномерное
уплощение донорской роговичной ткани – Alcon Wavelight FS 200.
Данный ФСЛ имеет возможность изменять мощность импульсов и
расстояние между ними индивидуально в зависимости от глубины реза и
поставленных задач, это дает возможность подобрать параметры работы
лазера так, чтобы максимально снизить плотность излучаемой энергии на
площадь роговичной поверхности (мкДж/мм2). Фемтолазерная установка
осуществляет свою работу на частоте 200 кГц с энергией импульса от 0,3 до
1,5 мкДж, расстояние между импульсами варьирует от 4 до 12 мкм.
Экспериментальныйсвинойкорнеосклеральныйдиск,
законсервированный в растворе для хранения роговичной ткани производства
ООО «Научно-экспериментальное производство Микрохирургия глаза»
(Россия,ТУ9393-013-29039336-2007,регистрационноеудостоверение
№ ФСР2010106650), устанавливали на искусственную переднюю камеру
(ИПК) эндотелиальной поверхностью вверх. После закрывания механизма
ИПК, выполняли ее заполнение сбалансированным солевым раствором при
помощи подключения к ней инфузионной системы. Для этого располагали
флакон с солевым раствором на штативе с фиксатором на высоте,
обеспечивающей давление внутри системы равное 30 см вод. ст. Данное
давление является минимальным для срабатывания датчика в ФСЛ,
позволяющего выполнить срез, а также снижает потерю эндотелиальных
клеток за счет минимизации силы контакта с аппланационным интерфейсом,
обеспечиваетравномернуюаппланациюипредсказуемыйэтап
фемтодиссекции. Эндотелиальную поверхность роговицы увлажняли путем
нанесения на нее консервационный среды.
Готовую для работы роговицу, находящуюся в ИПК, помещали под
аппланационной интерфейс лазера. После центровки выполняли процесс
аппланации путем вращения джойстика ФСЛ, который, в свою очередь,
оснащен электрическим сервоприводом.
Далее, под контролем компьютерной программы, выполняли срез
роговицы заданного профиля. Первый срез проводили в ламеллярной
плоскости на глубине 130 мкм, второй – в вертикальной плоскости с глубины
150 мкм кверху (в сторону эндотелия) диаметром 8,0 мм под углом 90°. В
таком случае происходит перекрывание ламеллярного и вертикального среза
друг другом, что обеспечивает качественное отделение полученного
трансплантата по краям среза. Для минимизации энергии, которая расходуется
на единицу площади поверхности роговицы во время выполнения
ламеллярного среза, наиболее оптимальными выявлены ниже представленные
параметры ФСЛ: расстояние между точками – 8 мкм, между рядами – 8 мкм,
энергия – 0,8 мкДж.
Растровый паттерн. Время формирования среза (контакта интерфейса
ФСЛ с эндотелием) занимает 15 сек.
Расчёт проводили по формуле:
=1000000/ × × ,
где W – плотность энергии на площадь поверхности, мкДж/мм2; а –
расстояние между импульсами, мкм; b – расстояние между рядами, мкм; Е –
энергия, мкДж; 1000000 – количество мкм2 в 1 мм2.
Отделениеполученноготрансплантатаотокружающихтканей
производили при помощи шпателя. Оставшиеся коллагеновые перемычки во
всех случаях были разрушены тупым способом.

Экспериментальное исследование воздействия фемтолазерной энергии
на эндотелиальные клетки и кератоциты при заготовке трансплантата
Для определения жизнеспособности эндотелия и кератоцитов роговицы
применяли флуоресцентный краситель Live and Dead. Для визуализации и
изучения результатов окрашивания применяли лазерный сканирующий
конфокальный микроскоп Olympus Fluoview 10i (Olympus, Япония). Подсчет
живых и мертвых клеток с полученных изображений осуществлялся при
помощи программы ImageJ (National Institutes of Health, США).
Проведенный статистический анализ не выявил статистически значимые
различия по остаточному проценту живых эндотелиальных клеток и мертвых
между указанными группами (p>0,05).
Процентживыхэндотелиальныхклетокпослевыкраивания
ультратонкого трансплантата с использованием низкочастотного ФСЛ
составил в среднем 93,2±5,4%, мертвых – 6,7±5,4%. В тех случаях, когда
трансплантат заготавливался при помощи высокочастотного, процент живых
эндотелиальных клеток был равен 85,3±6,3%, мертвых – 14,6±6,1%.
Порезультатамэксперимента,повреждающеевоздействие
фемтолазерной энергии вне зависимости от вида ФСЛ проникает внутрь
стромы трансплантата от непосредственного места формирования среза на
глубину до 117 мкм. Выполненный статистический анализ выявил
статистически значимые отличия между группами только на глубине от 13 до
52 мкм (p<0,05). В указанном диапазоне большая гибель кератоцитов наблюдалась в группе с применением низкочастотного ФСЛ. Экспериментальное изучение качества формируемой стромальной поверхности ультратонкого трансплантата после его заготовки с использованием двух различных фемтолазерных систем Сканирование осуществляли при помощи сканирующего микроскопа Certus V (Nano Scan Technologies, Россия). Его выполняли в безвоздушной среде и в контактном режиме, причем образцы были предварительно высушены в эксикаторе. Применялись следующие зонды: MSCT-AUNM (Vecco, США), жесткость балки – 0,01 Н/м, радиус кривизны зонда – 10 нм. Качество формируемой при помощи лазера поверхности возможно оценить при помощи показателя RMS: чем он выше, тем трансплантат имеет более грубую поверхность, что, возможно, в дальнейшем может сказаться на зрительных функциях пациента. В группе 1, в которой для выкраивания трансплантата использовался низкочастотный ФСЛ, значение RMS составило 18,55±4,59 мкм. В группе 2, в которой применялся высокочастотный ФСЛ, значение показателя RMS было равно 13,9±5,2 мкм. По результатам оценки качества среза, шероховатость после воздействия низкочастотного ФСЛ была больше в сравнении с высокочастотным (р<0,05). Результаты клинической части Анализ клинико-функциональных исследований пациентов в послеоперационном периоде Во всех случаях операцию завершали полноценной адгезией и запланированной центровкой трансплантата, что свидетельствует об очень высокой предсказуемости и повторяемости ФЛ-ЗПК. Послеоперационный периодпротекалареактивно.Всепациентыполучалистандартные послеоперационныеназначенияввидеинстилляцииантибиотика, стероидного противовоспалительного препарата и кераторепаранта, а также субконъюнктивальные инъекции стероидного препарата. Во всех группах в послеоперационном периоде на всех сроках наблюдения отмечали увеличение показателей некорригированной остроты зрения (НКОЗ) по сравнению со значениями, полученными в дооперационном периоде (p<0,05). Значения корригированной остроты зрения (КОЗ) в послеоперационном периоде были значительно выше во всех группах по сравнению с дооперационными данными. К трем месяцам наблюдения восстановление КОЗ было наиболее стремительным во всех исследуемых группах. На сроке 12 месяцев наилучшие показатели КОЗ были в группах с ДФ и составили 0,6, в группе 1А (0,33±0,16) – у 7 пациентов и в группе 2А (0,3±0,12) – у 5 соответственно. В группах с ПБК наилучшими показателями КОЗ также было достижение 0,6, однако в меньшем количестве случаев: в группе 1Б (0,3±0,1) – у 3 пациентов, в группе 2Б (0,29±0,07) – у 2 пациентов. При этом статистически значимые различия КОЗ между группами 1А и 2А, а также 1Б и 2Б не были обнаружены ни на одном сроке наблюдения (p>0,05).

Сравнительный анализ потери плотности эндотелиальных клеток в
послеоперационном периоде
ВгруппахпациентовсДФнаибольшаяпотеряплотности
эндотелиальных клеток (ПЭК) к сроку наблюдения 1 год наблюдалась в
группе2А,вкоторойтрансплантатбылзаготовленприпомощи
высокочастотного ФСЛ. Также были выявлены статистически значимые
различия в плотности эндотелиальных клеток между группами 1А и 2А на всех
сроках наблюдения (p<0,05). К сроку наблюдения 12 месяцев эти показатели составили в группе 1А – 1397,4±348,7 кл/мм2 (48,1±6,7%) и в группе 2А – 959,01±240,4 кл/мм2 (67,2±4,4%). В группе 1А эти показатели были выше. В процессе анализа динамики снижения ПЭК в группах пациентов с ПБК были выявлены статистически значимые отличия (p<0,05). В группе 1Б, в которой использовали для заготовки трансплантата низкочастотный ФСЛ, на всех сроках наблюдения ПЭК была выше по сравнению с группой 2Б, в которой применяли высокочастотный ФСЛ. К сроку наблюдения 12 месяцев эти показатели составили в группе 1Б – 1189,6±231,2 кл/мм2 (59,4±8,1%) и в группе 2Б – 872,3±256,9 кл/мм2 (70,1±7,8%). Сравнительный анализ результатов оптической когерентной томографии роговицы На сроке наблюдения 12 месяцев во всех группах регистрировали достоверное уменьшение толщины ЦТР по сравнению с дооперационными данными: в группе 1А – с 673±54 до 539±25,3, в группе 2А – с 632±61 до 544±28,9, 1Б – с 771±147 до 546±19,4, 2Б – с 809±153 до 545±25,6 мкм (p<0,05). Статистически значимые различия в группах с ДФ (1А, 2А) выявлены не были (p>0,05). В группах пациентов с ПБК (1Б и 2Б) статистически достоверных
различий также выявлено не было (p>0,05).
Во всех случаях полученные ультратонкие трансплантаты были
равномерными (индекс Ц:П стремился к 1,0).

Сравнительный анализ оптической плотности роговицы после
выполнения ФЛ-ЗПК
В послеоперационном периоде на различных сроках наблюдения
статистически значимые отличия показателей общей оптической плотности
роговицы (TL) в группах 1А (18,5±6,3) и 2А (19,2±4,01) выявлены не были, так
же, как и в группах 1Б (20,6±7,5) и 2Б (21,3±5,8) (p>0,05). Статистически
значимые различия показателей оптической плотности переднего, среднего,
заднего слоев, а также условленной зоны интерфейса между группами 1А и
2А, 1Б и 2Б выявлены не были (p>0,05). На сроке наблюдения 12 месяцев после
проведенного оперативного лечения во всех группах величина оптической
плотности роговицы была максимально приближена к нормальным значениям
денситометрии.

ВЫВОДЫ
1. Новый метод заготовки ультратонкого роговичного трансплантата для
заднейпослойнойкератопластикисэндотелиальнойповерхности
роговицы с помощью низкочастотного фемтосекундного лазера с
применением разработанных параметров (расстояние между точками – 8
мкм, между рядами – 8 мкм, энергия – 0,8 мкДж) позволяет достичь
качественного формирования трансплантата без риска его перфорации и
получить лентикулу предсказуемой толщины и формы.
2. Анализ воздействия фемтолазерной энергии на эндотелиальные клетки
роговицы в эксперименте продемонстрировал безопасность методики ФЛ-
ЗПК, причем статистически значимая разница между используемыми ФСЛ
не была выявлена (p>0,05): процент живых клеток после выкраивания с
помощью низкочастотного и высокочастотного ФСЛ составил 93,2±5,4% и
85,3±6,3% соответственно; мертвые кератоциты вне зависимости от типа
ФСЛ встречаются до глубины 117 мкм от непосредственного места
формирования среза, значимые отличия между ФСЛ встречаются только на
глубине от 13 до 52 мкм (p<0,05): в указанном диапазоне большая гибель кератоцитов наблюдалась в группе с применением низкочастотного ФСЛ. 3. Сравнительныйанализрезультатоватомно-силовоймикроскопии продемонстрировал,чтокачествоповерхностиультратонкого трансплантатапослевоздействиянизкочастотногоФСЛбыло статистически значимо ниже в сравнении с высокочастотным ФСЛ (р<0,05). 4. Разработан в клинике хирургический этап технологии задней послойной кератопластикисиспользованиемультратонкоготрансплантата, заготовленного с эндотелиальной поверхности роговицы с помощью низкочастотного фемтосекундного лазера 5. В результате проведения пациентам ФЛ-ЗПК во всех группах отмечали положительную динамику клинико-функциональных показателей. На сроке 12 месяцев после операции наилучший показатель КОЗ во всех группах составил 0,6, при этом наличие КОЗ зрения ³0,5 было достигнуто в 28% случаев в группе 1А, 12,5% – в 1Б, 18,5% – в 2А и 8% случаев в группе 2Б, статистически значимые различия КОЗ в послеоперационном периоде в группах пациентов с ДФ, а также с ПБК выявлены не были (p>0,05). Применение низкочастотного ФСЛ позволяет достичь более
высоких показателей ПЭК (к 12 мес. 1397,4±348,7 кл/мм2 – ДФ,
1189,6±231,2 кл/мм2 – БК) и меньшей потери эндотелиальных клеток (к 12
мес. 48,1±6,7 % – ДФ, 59,4±8,1 – БК) на всех сроках наблюдения (p<0,05). 6. Во всех группах в послеоперационном периоде методом ОКТ наблюдали равномерную толщину трансплантата, а также уменьшение ЦТР – между исследуемыми группами не были выявлены статистически значимые различия (p>0,05). Показатели оптической плотности роговицы на сроке
наблюдения 12 месяцев были сопоставимы между методиками (p>0,05) и
максимально приближены к нормальным значениям денситометрии
здоровой роговицы (TL в центральной зоне в группе 1А – 18,5±6,3, 2А –
19,2±4,01, 1Б – 20,6±7,5, 2Б – 21,3±5,8), что говорит о высоком качестве
формируемой поверхности ультратонкого трансплантата, выкроенного при
помощи низкочастотного и высокочастотного ФСЛ, а также о высокой
биологической эффективности предложенной технологии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Для обеспечения предсказуемости процесса аппланации и выкраивания
трансплантата, а также минимизации силы контакта стыковочного конуса
низкочастотного ФСЛ и эндотелия, следует применять следующую
методику:донорскийкорнеосклеральныйдискфиксируютв
искусственную переднюю камеру эндотелием вверх, давление внутри
камеры должно соответствовать 30 см вод. ст., за счет использования
флакона с сбалансированным солевым раствором на штативе с фиксатором
на высоте 30 см от уровня искусственной камеры.
2. Для выкраивания ультратонкого трансплантата для ЗПК при помощи
низкочастотного ФСЛ оптимальными являются следующие параметры:
глубина – 130 мкм, энергия – 0,8 мкДж, расстояние между точками – 8 мкм,
между рядами – 8 мкм. Эти параметры позволяют получить равномерный
по толщине и форме ультратонкий трансплантат с качественной
поверхностью.
3. Уменьшение толщины трансплантата менее 100 мкм не является
целесообразным, так как повреждающее действие фемтолазерной энергии
(мертвые кератоциты) встречается до глубины 117 мкм от места
формирования среза и, следовательно, при уменьшении толщины может
оказывать губительное воздействие и на эндотелиальные клетки.