Клинико-лабораторная диагностика вагинальных инфекций с учетом особенностей лактобациллярной микрофлоры и локального иммунного ответа

ГЛАВА 1. РОЛЬ ВАГИНАЛЬНЫХ ЛАКТОБАЦИЛЛ И ЛОКАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА В ПОДДЕРЖАНИИ ПОСТОЯНСТВА ВАГИНАЛЬНОГО МИКРОБИОМА (Обзор литературы)
1.1. Современные представления о лактобациллах влагалища женщин репродуктивного возраста
1.1.1. История изучения бактерий рода Lactobacillus spp
Ранее все виды лактобацилл, обнаруживаемые во влагалище и являющиеся основным компонентом его нормальной микрофлоры, называли палочками Додерлейна. Свое название они получили в честь немецкого акушера-гинеколога профессора Альберта Додерлейна. Считается, что именно ему принадлежат первые исследования по изучению вагинальной микрофлоры. В 1892 году он опубликовал монографию, в которой описал палочковидные бактерии в вагинальных выделениях у женщин с родильной горячкой. Ему удалось культивировать эти микроорганизмы и выявить их способность к продукции молочной кислоты, ингибирующей рост патогенной микрофлоры in vitro и in vivo [47]. Однако, несколькими годами ранее, в 1886 году российским гинекологом профессором Дмитрием Оскаровичем Оттом было сделано сообщение об исследовании вагинальной микрофлоры, а в 1887 году предложена теория о самоочищении влагалища. В основу теории легли утверждения о способности бактерий, находящихся во влагалище здоровых женщин продуцировать молочную кислоту и создавать неблагоприятные условия для других микроорганизмов. Образование же молочной кислоты связано с гликогеном, которым богаты клетки слизистой оболочки влагалища. В 1902 году Илья Ильич Мечников, развил свою теорию о том, что старение вызывается гнилостной кишечной микрофлорой, а молочная кислота, продуцируемая лактобациллами кишечника, способна продлить жизнь [83]. В 1928 году Стенли Томас идентифицировал палочки Додерлейна как Lactobacillus acidophilus, сделав пророческое замечание, что это возможно группа родственных видов или виды, претерпевшие
значительные изменения [116]. Многими исследователями отмечались трудности при идентификации лактобацилл в связи с выраженным сходством по морфологии, физиологическим потребностям и биохимическим тестам. В 1980 году, в соответствии с наблюдениями С. Томаса, в доминирующем виде Lactobacillus acidophilus была обнаружена значительная гетерогенность [72]. Альтернативным подходом в изучении многообразия лактобацилл стал анализ ДНК. В результате, используя метод ДНК гибридизации, бактерии рода Lactobacillus были разделены на ДНК гомологичные группы. Удалось выделить 6 групп лактобацилл, представители 4 из них встречаются в вагинальном биотопе (группа I: L.delbrueckii ssp.; группа II: L. acidophilus ssp.; группа III: L. paracasei ssp.; группа IV: L. salivarius ssp.) [70]. Изучение внутривидового состава этих групп стало возможно благодаря уникальному открытию американского микробиолога Карла Вёзе. В 1985 году он обратил внимание на наличие у бактерий консервативного участка гена 16S рРНК, очень удобного для определения нуклеотидных последовательностей (секвенирования) и установления видовой принадлежности бактерий [128]. В результате, в комплексе Lactobacillus acidophilus выделили несколько отдельных видов: это собственно L. acidophilus, а также L. amylolyticus, L. amylovorus, L. crispatus, L. gallinarium, L. gasseri, L. iners, L. jensenii, L. johnsoni [53, 55, 103, 109]. Сегодня род Lactobacillus spp. является одним из самых многочисленных бактериальных родов и насчитывает более 220 видов, которые подразделяются на 15 групп [101].
Представляющие для нас интерес вагинальные лактобациллы, согласно современной таксономической классификации, относят к филогенетической группе Lactobacillus delbrueckii роду Lactobacillus семейства Lactobacillaceae порядка Lactobacillales класса Bacilli типа Firmicutes царства Бактерий.
1.1.2. Морфология и виды вагинальных лактобацилл
Лактобациллы – это палочковидные грамположительные факультативно анаэробные или микроаэрофильные бактерии. В большинстве случаев они выглядят как длинные «палочки» правильной формы, также
встречаются изогнутые, булавовидные формы или короткие коккобактерии. Лактобациллы располагаются поодиночке, попарно или группами в виде коротких, реже длинных цепочек. Они, как правило, неподвижны, спор и капсул не образуют. При окраске по Граму или метиленовым синим у некоторых штаммов лактобацилл выявляют биполярные тельца, цитоплазматическую зернистость и исчерченность [2].
Благодаря реализации глобального международного проекта «Микробиом человека» было идентифицировано 20 видов лактобацилл, способных колонизировать вагинальный биотоп. При этом характерно доминирование, как правило, одного вида лактобацилл [65].
Из всего разнообразия вагинальной лактофлоры доминирующими являются 4 вида лактобацилл группы Lactobacillus acidophilus: L. crispatus, L. iners, L. jensenii и L. gasseri [91]. Большинство исследований свидетельствуют о преобладании вида L. crispatus в вагинальном биотопе здоровых женщин [8, 14, 34, 98], в то время как L. gasseri и L. iners в 4 раза чаще встречаются у женщин с БВ [46, 130]. На сегодняшний день существуют данные о варьировании доминирующих видов в зависимости от этнической принадлежности и географического расположения [68, 69, 96]. Так североамериканские ученые исследовали образцы отделяемого влагалища, полученных от 396 здоровых женщин разных этнических групп: европейской, азиатской, латиноамериканской и африканской [96]. Преобладание лактобацилл в составе вагинальной микрофлоры отмечалось в группе европейских и азиатских женщин (89,7% и 80,2%, соответственно) и лишь у 61,9% африканских женщин и 59,6% латиноамериканок доминировали лактобациллы. По видовой распространенности L. crispatus чаще встречался среди европейских женщин (50,6%). В трех оставшихся группах наиболее распространенным оказался вид L. iners (53,2 – 58,3%). Самым редким видом вагинальных лактобацилл оказался вид L. jensenii, который встречался лишь у 7,3% среди всех обследованных.
В другом исследовании вид L. jensenii был доминирующим у американских женщин [33]. При изучении вагинальной микрофлоры японских женщин самым распространенным оказался вид L. vaginalis [108]. Также этот вид был достаточно распространен среди женщин африканских стран, хотя частота выявления вагинальных лактобацилл у них значительно ниже, чем у азиатских и европейских женщин [68]. Шведские исследователи охарактеризовали вагинальные лактобациллы у 23 здоровых женщин и показали, что наиболее распространены виды L. crispatus (48%), далее L. gasseri (30%), L. jensenii (17%) и L. iners (17%) [117]. У здоровых турецких женщин доминировал вид L. gasseri. 58 штаммов лактобацилл удалось получить от 10 из 19 женщин, 21% составил вид L. gasseri, по 16 % L. vaginalis и L. acidophilus, 14% L. crispatus [34].
Среди видового разнообразия лактобацилл Lactobacillus iners занимает особое место. Этот вид был идентифицирован в 1999 году [55]. Изучение генома L. iners показало, что он является наименьшим среди всех геномов лактобацилл, имеет 65 чужеродных генов, 26 из которых несут аминокислотные последовательности, не характерные для рода Lactobacillus [77]. Вид L. iners не продуцирует перекись водорода и D (-) молочную кислоту; способен адаптироваться к повышенным значениям pH вагинальной среды [33, 122]. Вид L. iners является трудно культивируемым микроорганизмом и требует дополнительных ростовых факторов, очень изменчив по морфологическим и тинкториальным свойствам. L. iners часто встречается при БВ, обнаруживается у женщин при преждевременных родах. Однако частота встречаемости L. iners в качестве доминирующего вида при нормоценозе также не редкость [96]. Несмотря на то, что L. iners в норме часто присутствует в составе микробиоты влагалища, протективное значение этого вида остается спорным [93]. В отличие от L. crispatus, L. iners не достаточно активно препятствует размножению УПМ. Благодаря уникальному строению своего генома L. iners имеет способность быстро адаптироваться к меняющимся условиям окружающей среды, переключая
свой метаболизм и используя в качестве пищевых ресурсов не гликоген, а другие вещества. Так в условиях дисбиоза L. iners продуцирует холестеринзависимый цитотоксин инеролизин – это порообразующий токсин, схожий с вагинолизином Gardnerella vaginalis, разрушающий клеточные стенки. L. iners использует глицерин разрушенных клеточных мембран в качестве нового пищевого субстрата [76, 95]. При этом происходит гибель других видов лактобацилл, снижение концентрации молочной кислоты и повышение рН вагинальной среды. Это приводит к размножению анаэробов, ассоциированных с БВ, которые стремительно занимают освободившуюся нишу [126]. Таким образом, вид L. iners не способен, подобно другим лактобациллам, эффективно защищать женский организм от патогенных микроорганизмов [121], а наоборот, предрасполагают к заселению влагалища УПМ и катализируют процессы, инициирующие преждевременную родовую деятельность [51, 76]. Существуют данные о влиянии L. iners на уровень экспрессии цитокинов. При преждевременных родах отмечается увеличение уровня провоспалительных цитокинов – одной из причин их необычно раннего повышения может быть наличие инфекции. Изменения в транскрипционном профиле генов, ассоциированные с доминированием L. iners, аналогичны изменениям, характерным для вагинитов и БВ, хотя существенно менее выражены [3].
В последних исследованиях по изучению адаптационных механизмов лактобацилл в экосистеме влагалища был проведен сравнительный анализ генома доминирующих видов [119]. Установлено, что L. crispatus имеет в среднем самый большой геном с наибольшим количеством белков в отличие от других вагинальных лактобацилл. Были найдены штаммы L. crispatus, имеющие уникальную ДНК-полимеразу, бактериоцин и токсин-антитоксин системы и гены, кодирующие мобильные генетические элементы, особенно транспозазу, определяющие большие размеры генома.
В другом исследовании авторы провели сравнительный анализ геномов 25 представителей рода Lactobacillus spp., обитающих во влагалище,
желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) и пищевых продуктах. Обнаружили, что геномы вагинальных лактобацилл были значительно меньше и имели более низкое содержание GC-состава, что указывает на их меньшую сопротивляемость к условиям окружающей среды в сравнении с невагинальными видами. Также выяснили, что каждый геном вагинальных видов лактобацилл кодируется специфическими белками. Эти результаты свидетельствуют о том, что вагинальные лактобациллы не имеют общих механизмов адаптации к среде влагалища. Каждый вид обладает уникальными способами взаимодействия с окружающей средой, будь то вагинальный эпителий или другие микроорганизмы в сообществе [82].
1.1.3. Роль лактобацилл в поддержании и восстановлении микробиоценоза влагалища
Лактобациллам принадлежит основная роль в поддержании постоянства микробиоценоза влагалища за счет их ферментативной, бактерицидной, витаминообразующей и иммуностимулирующей активности. Они выполняют барьерную функцию, путем конкурентного исключения вторгающихся чужеродных микроорганизмов. Важным защитным механизмом лактобацилл является поддержание низкого окислительно- восстановительного потенциала вагинальной среды (рН < 4,5) за счет продукции ими перекиси водорода и молочной кислоты. В процессе жизнедеятельности они создают такую среду, что выжить рядом с ними могут только очень приспособленные микроорганизмы. Гетероферментативные виды лактобацилл в качестве конечных продуктов также могут продуцировать уксусную, масляную, янтарную кислоты и углекислый газ. Поддержание низкого значения рН (3,8 – 4,4) обусловлено, прежде всего, образованием молочной кислоты в результате расщепления гликогена - основного пищевого субстрата лактобацилл. Гликоген вырабатывается клетками вагинального эпителия под влиянием эстрогена. Особенно высокое содержание эстрогена наблюдается в период полового созревания и беременности и способствует сохранению вагинального гомеостаза. Кроме того, эстроген стимулирует созревание и пролиферацию эпителиальных клеток влагалища, способствует образованию рецепторов для лактобацилл на клетках вагинального эпителия и накоплению гликогена, создавая благоприятные условия для размножения лактобацилл [12, 13]. Эстрогензависимая способность лактобацилл к адгезии на эпителиальных клетках влагалища обеспечивает колонизационную резистентность вагинального биотопа. Лактобациллы покрывают стенки влагалища сплошным слоем, создавая биопленку и препятствуя адгезии других микроорганизмов [28]. Еще одним важным свойством лактобацилл является их способность к продукции перекиси водорода. Изучение вагинальных лактобацилл показало, что L. crispatus, L. jensenii и L. vaginalis наиболее часто встречающиеся виды перекись продуцирующих лактобацилл [33, 108, 127]. Отсутствие перекись продуцирующих лактобацилл во влагалище связано с увеличением частоты встречаемости БВ, с повышенным риском распространения ВИЧ через генитальный тракт, приобретением вируса простого герпеса II типа и преждевременными родами [38, 43, 45, 61, 78]. Наличие же лактобацилл, продуцирующих высокий уровень перекиси водорода, наоборот ассоциировано с низкой частотой БВ и хорионамнионита при беременности [32, 57, 127]. Однако результаты недавних исследований ставят под сомнение антимикробные свойства перекиси водорода in vivo и подчеркивают ключевую роль молочной кислоты [112]. Так, продукция перекиси водорода вагинальными лактобациллами представляется как неоднозначный элемент защиты в естественных условиях, потому как: 1) анаэробная среда влагалища препятствует продукции перекиси водорода; 2) высокая антиоксидантная активность цервикально-вагинальной жидкости блокируют бактерицидную способность перекиси водорода; 3) сама перекись водорода более токсична по отношению к лактобациллам, чем к другим 17 бактериям, ассоциированным с бактериальным вагинозом [87]. Лактобациллы демонстрируют широкую вариабельность в отношении синтезируемых изомеров молочной кислоты. Молочная кислота обнаруживается во влагалище в виде двух изомеров D (-) и L (+), которые отличаются своими протективными свойствами. Способность лактофлоры продуцировать определенный изомер молочной кислоты является еще одним показателем защитного потенциала разных видов. L. crispatus продуцирует в 4 раза больше D (-) формы, чем L (+), L. jensenii в 9 раз, а L. iners производит исключительно L(+) форму [54]. В отличие от перекиси водорода молочная кислота: 1) беспрепятственно производится в анаэробной среде влагалища; 2) цервикально-вагинальная жидкость не блокирует бактерицидную активность молочной кислоты [88]; 3) а в условиях in vitro вагинальные лактобациллы не чувствительны к молочной кислоте, которая полностью инактивирует все бактерии, ассоциированные с БВ [89]. Также выявлена выраженная активность молочной кислоты против Candida albicans и Candida glabrata [67, 75], вируса простого герпеса II типа [44], Chlamydia trachomatis [54, 60, 81, 90] и Neisseria gonorrhoeae [37, 62]. В дополнение к прямой инактивации патогенных микроорганизмов низкое значение рН влагалища потенцирует блокирование вирионов ВИЧ-1 цервикальной слизью. Степень защитного эффекта зависит от концентрации молочной кислоты [94, 106]. Большинство исследователей указывают на более выраженные защитные свойства вида L. crispatus. В двух исследованиях были созданы модели с использованием цервикального эпителия и клеток HeLa, которые инфицировали Chlamydia trachomatis. В опыте с цервикальным эпителием клетки обрабатывали супернатантами, полученными при культивировании L. crispatus, L. jensenii, L. iners. Наилучший результат наблюдали при обработке клеток супернатантом L. crispatus с высокой концентрацией D (-) молочной кислоты и pH 4. Обработка клеток раствором соляной кислоты с pH 4 не дала такого же защитного эффекта [54]. В эксперименте на клетках HeLa оценили активность in vitro 15 штаммов разных видов лактобацилл, а именно, L. crispatus, L. gasseri, L. vaginalis, против C. trachomatis. Выявили выраженную способность L. crispatus препятствовать инфицированию клеток C. trachomatis [90]. Также некоторые лактобациллы способны вырабатывать бактериоцины или антибиотикоподобные вещества (эндобиотики) - L. acidophilus продуцирует ацидофилин и лактоцид [17, 94]. Продукция бактериоцинов является еще одним важным фактором в ингибировании патогенных микроорганизмов. Бактериоцины представляют собой антимикробные пептиды, активные в отношении некоторых бактерий и вирусов. Американским ученым удалось изучить трипептидный антибиотик лактоциллин, производимый одним из штаммов L. gasseri, обладающий активностью в отношении Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Gardnerella vaginalis и Corynebacterium aurimucosum [52]. В одном из последних исследований были обнародованы данные о бактерицидной активности штамма L. parafarraginis (KU495926), который ингибировал 14 клинических изолятов грамотрицательных бактерий с множественной лекарственной устойчивостью (MDR) и β-лактамазой (ESBL) с расширенным спектром, а также 11 других микроорганизмов: Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Acinetobacter haemolyticus, Enterobacter aerogenes, Proteus mirabilis и Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli (O157:H7), Bacillus cereus, Yersinia enterocolitica, Shigella sonnei, Streptococcus pyogenes и Enterococcus faecalis [27]. 1.2. Механизмы иммунной защиты генитального тракта женщин синергизма между секреторными белками, пептидами, эпителиальными и иммунными клетками макроорганизма с другой стороны, играют ключевую роль в защите женских половых путей от инфекций. При поддержании здоровья слизистой оболочки влагалища все компоненты этой системы Доминирование лактобацилл с одной стороны, и сложный механизм находятся в определенном балансе. Нарушение баланса, вызванное изменением одного из «действующих лиц» может привести к увеличению восприимчивости макроорганизма и развитию инфекционного процесса [118]. Препятствуя проникновению инфекционного агента, клетки слизистой оболочки влагалища создают не только механический барьер. При попадании патогена в организм включается первая линия иммунологической защиты. Первичный воспалительный ответ на инфекционный агент опосредован специфическими толл-подобными рецепторами (toll-like receptors, TLRs), которые активируются при контакте с клеточной стенкой микроорганизмов и распознают патоген. В результате этого начинается синтез провоспалительных цитокинов, способствующих дальнейшей активации клеток врожденного иммунитета. При этом цитокины выполняют 2 основные функции: вовлекают в защитную реакцию другие клетки (например, эпителиальные, эндотелиальные, дендритные) и способствуют миграции лейкоцитов из кровотока в очаг воспаления [25]. Даже незначительные изменения в составе микрофлоры влагалища, вызывают местную иммунную реакцию, которая отражается на уровнях иммунных молекул, продуцируемых резидентными иммунными клетками (макрофагами, дендритными клетками, нейтрофилами, естественными киллерами), а также эпителиальными клетками влагалища. Так, макрофаги и дендритные клетки путем ферментативного расщепления уничтожают фагоцитированные патогены, что сопровождается синтезом целого ряда провоспалительных цитокинов (TNFα, IL1ß, IL6 и др.), сигнализирующих о внедрении чужеродных микроорганизмов и привлекающих другие иммунокомпетентные клетки в очаг воспаления. Важнейшей задачей системы цитокинов в развитии воспалительной реакции является обеспечение согласованного действия иммунной, эндокринной и нервной систем организма хозяина [3, 64]. Различные механизмы иммуномодуляции лактобацилл способствуют поддержанию вагинального гомеостаза. В опыте in vitro при обработке клеток вагинального эпителия агонистом toll-подобных рецепторов удалось оценить иммунный ответ слизистой на некоторые штаммы L. crispatus и L. jensenii, которые привели к смягчению реакции эпителия на раздражитель [99]. В другом опыте обнаружили, что L. crispatus незначительно стимулирует рецепторы распознавания вагинального эпителия, в отличие от L. iners, который способствуют этому [48]. Данный факт еще раз подтверждает уникальную способность L. iners адаптироваться к меняющимся условиям среды. Снижение пролиферации эпителиальных клеток слизистой нижних отделов репродуктивного тракта является одним из показателей стабильности. Так в эксперименте на 3D модели клеток цервикального эпителия было показано, как микробиота модулирует защитные механизмы макроорганизма. Клетки, обработанные супернатантом, полученным при культивировании L. crispatus, не только были устойчивы к инфицированию C. trachomatis, но и не проявляли пролиферативной активности, в отличие от клеток, обработанных супернатантом от культуры G. vaginalis, которые за 24 часа смогли полностью восстановить, искусственно созданный разрыв эпителия [54]. Способность клеток к повышенной регенерации делает их более уязвимыми. Такую повышенную регенерацию и десквамацию эпителия мы можем наблюдать при БВ. В последние годы большой интерес вызывают лактобациллы как вероятный компонент вакцины против ВИЧ-1. Лактобациллы обладают иммуномодулирующими механизмами, которые влияют на иммунные клетки хозяина, способствуя ингибированию передачи ВИЧ-1. При исследовании иммуномодулирующего действия шести штаммов Lactobacillus spp., выделенных из отделяемого влагалища, а именно, L. crispatus, L. fermentum, L. jensenii, L. gasseri, L. delbrueckii и L. johnsonii , обнаружили способность L. crispatus снижать экспрессию рецепторов клеток Лангерганса для проникновения ВИЧ-1. А, как известно, ВИЧ-1 имеет тропность к клеткам Лангерганса [107]. Таким образом, стабильность и относительная однородность вагинальной микробиоты с преобладанием вида L. crispatus создает серьезные трудности для проникновения и размножения патогенов, в то время как L. iners не всегда препятствует этому, и порой проявляет агрессивные свойства, не типичные для нормальной микрофлоры. 1.3. Дисбиотические нарушения вагинального микробиома В составе микробиоценоза влагалища могут возникать временные сдвиги. Это может быть связано с различными факторами, такими как: изменение уровня гормонов, лечение антибиотиками, сексуальная активность, гигиенические особенности, стресс. Так, в одном исследовании, было показано 100-кратное снижение L. crispatus во время менструации, в то время как количество L. iners, G. vaginalis, A. vaginae и P. bivia резко возросло у женщин с нормальной микрофлорой [102]. Противоречивый результат показывают другие исследования. При обследовании 26 женщин в различные фазы менструального цикла существенных изменений в микробиоценозе выявлено не было [42]. Это соответствует одному из основных выводов проекта «Микробиом человека» о том, что вариации микробиоты у одного человека с течением времени меньше, чем вариации между разными людьми [65]. Сдвиг микрофлоры в сторону выраженного преобладания строгих или факультативных анаэробов и существенное уменьшение лактофлоры вплоть до полного ее исчезновения приводит к БВ. Это одно из наиболее распространенных заболеваний влагалища в мире, встречающееся у женщин репродуктивного возраста и характеризующееся повышением рН влагалища, появлением неприятного запаха и выделений [92]. БВ представляет собой полимикробное расстройство, с преобладанием таких микроорганизмов как Atopobium vaginae, Gardnerella vaginalis, Megasphaera spp., Prevotella spp., Mobiluncus spp., Leptotrichia spp., Porhyromonas spp., Eubacterium spp., Sneathia spp., Fusobacterium spp., Veillonella spp., Dialister spp., Lachnobacterium spp., Clostridium spp., Peptostreptococcus spp., Eggerthella- подобных бактерий [13, 51, 126]. Установлено, что эти полимикробные сообщества способны создавать биопленки на поверхности эпителия вагинального биотопа женщин, страдающих БВ [111]. Предполагается, что образование этих биопленок инициировано G. vaginalis, которая как бы является своеобразной леской для удержания других микроорганизмов [125]. Объединенные в биопленки микроорганизмы становятся более резистентными к действию антибактериальных препаратов и защитным механизмам лактобацилл: перекиси водорода, молочной кислоте и бактериоцинам. Снижение уровня лактобацилл и повышенный уровень pH также характерны для АВ, но при данном состоянии преобладают аэробные микроорганизмы, такие как Escherichia coli, стрептококк группы B и Staphylococcus aureus. Клиническая картина АВ включает гнойные выделения, некоторую степень атрофии слизистой влагалища и наличие воспаления [114]. КВВ, по данным исследователей, хотя бы однажды встречался у 70- 75% женщин, при этом в 5-10% случаев наблюдаются рецидивы заболевания. КВВ проявляется появлением творожистых выделений, болезненностью, зудом и гиперемией вульвы. В 90% случаев причиной является чрезмерный рост Candida albicans, реже встречаются грибы Candida non-albicans: C. glabrata, C. tropicalis, C. krusei, C. рarapsilosis и другие [59]. Еще одним вероятным, но малоизученным фактором, способным влиять на постоянство вагинального микробиома, является фаговая инфекция. С помощью молекулярно-биологических методов были обнаружены лизогенные изоляты лактобактерий. Выявление свободной фаговой частицы после индукции лизогенных культур может говорить в пользу гипотезы о роли фаговой инфекции в развитии БВ и других нарушений микробиоценоза влагалища [9]. Можно предположить, что попадание лизогенного штамма в вагинальный биотоп, плотно колонизированный лактобациллами и представленный штаммами, чувствительными к внесенному в среду фагу, может действительно привести к массовому лизису лактобацилл бактериофагами и развитию дисбиоза влагалища. 1.4. Влияние антибиотиков на лактобациллы Антибактериальные препараты, применяемые для коррекции дисбиотических состояний влагалища, помимо терапевтического эффекта влекут и нежелательные последствия, приводящие к уничтожению резидентной микрофлоры. Известно, что уменьшение количества кишечных лактобацилл при системном приеме антибиотиков напрямую связано с уменьшением лактобацилл в вагинальном биотопе женщин. Многие клиницисты при лечении БВ и других дисбиозов влагалища отдают предпочтение интравагинальному пути введения противомикробных препаратов, который не уступает по эффективности системной терапии. По литературным данным, об антибиотикочувствительности различных видов лактобацилл известно, что терапия определенными антибиотиками может приводить к селективному увеличению одних видов лактобацилл и снижению или к полной элиминации других видов [6]. Так на примере 123 штаммов лактобацилл была изучена антибиотикочувствительность 4 основных видов: L. iners, L. crispatus, L. jensenii, L. gasseri к 12 антибактериальным препаратам. Все штаммы лактобацилл оказались чувствительными к ампициллину, цефазолину, цефотаксиму, ванкомицину и нечувствительными к метронидазолу, триметоприм/сульфаметоксазолу и левофлоксацину. К ряду антибиотиков различные виды лактобацилл демонстрировали вариабельную чувствительность. Это позволило предположить, что терапия метронидазолом, левофлоксацином и триметоприм/сульфаметоксазолом не оказывает влияния на уровень колонизации вагинального биотопа часто встречающимися видами лактобацилл. В то время как лечение препаратами из группы пенициллинов, цефалоспоринов и гликопептидов может привести к уменьшению лактобацилл в микробиоте влагалища. Вариабельная чувствительность, вероятно, может влиять на уровень отдельных видов лактобактерий в зависимости от схемы антибактериальной терапии. Было выявлено, что лечение клиндамицином, который широко применяется для лечения БВ, способно полностью подавить рост L. crispatus и привести к увеличению L. iners и L. gasseri [14]. Учитывая данное обстоятельство, информированность о видовом составе лактобацилл и их антибиотикочувствительности, очень важны для назначения адекватной антибиотикотерапии. 1.5. Методы выявления и идентификации вагинальных лактобацилл Клиническим материалом для выявления вагинальных лактобацилл является отделяемое влагалища. К основным методам исследования относят бактериоскопический, бактериологический (культуральный) и молекулярно- биологический методы. Микроскопическое исследование вагинального отделяемого является самым простым ориентировочным методом. Оно позволяет оценить выраженность лейкоцитарной реакции, состояние эпителия и морфологические особенности микробиоты. Необходимо помнить, что обнаружение в препаратах морфотипов лактобацилл не дает однозначного ответа о состоянии микробиоценоза влагалища [19]. Для выделения культуры лактобацилл из клинического материала проводят бактериологическое исследование вагинального отделяемого. Для исследования используют жидкие и плотные питательные среды с последующим культивированием в условиях СО2 инкубатора. Определение вида выделенных штаммов лактобацилл осуществляется биохимическими тестами с использованием автоматических анализаторов. Принцип исследования основан на изменении окраски индикаторных субстратов в лунках идентификационных панелей, где происходят биохимические ферментативные реакции. В последнее время одним из наиболее надежных и быстрых методов идентификации микроорганизмов является метод масс-cпектрометрического анализа с использованием времяпролетного масс-спектрометра MALDI-TоF MS (Matrix-Assisted Lazer Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry – матричноактивированная лазерная десорбция/ионизация с времяпролетным разделением). Внедрение в клиническую микробиологию технологий, основанных на масс-спектрометрии MALDI-TоF MS (Нобелевская премия, 2002 г., Танака Коити) открыло новые возможности очень точной идентификации микроорганизмов. В основе метода MALDI- ToF лежит процедура мягкой ионизации исследуемого материала, позволяющая в присутствии матрицы, под воздействием лазера ионизировать биологические макромолекулы (пептиды, белки, ДНК, олигонуклеотиды, липополисахариды и сахара) без их фрагментации и деструкции [56]. MALDI-TоF MS идентификация основана на определении уникального для каждого вида микроорганизмов набора белков – своеобразный «отпечаток пальца» (фингерпринтинг) микроорганизма, «протеомная дактилоскопия». Идентификация осуществляется в основном по рибосомальным белкам, которые присутствуют во всех микроорганизмах [7, 15]. Не все лактобациллы хорошо растут на питательных средах. Так L. iners относится к трудно культивируемым видам и не растрет на MRS агаре, предназначенном для культивирования лактобацилл [55]. Отличить различные виды лактобацилл по характеру роста на питательной среде, так же весьма проблематично, а при обильном росте и вовсе не представляется возможным. В этом случае надежным методом идентификации является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Тест системы отечественного производства позволяют определить шесть наиболее распространенных видов вагинальных лактобацилл (L. crispatus, L. iners, L. jensenii, L. gasseri, L. johnsonii, L. vaginalis) и один промышленный вид L. acidophilus методом количественной ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени. Другие молекулярно- биологические методы, например ДНК-гибридизация и пиросеквенирование, позволяющие провести видовую идентификацию лактобацилл, используются в основном для научных исследований. Таким образом, на сегодняшний день имеются данные о различном протективном потенциале разных видов лактобацилл и их роли в модулировании иммунной реакции макроорганизма и поддержании вагинального гомеостаза. Важнейшим диагностическим критерием, позволяющим определить состояние микробиоценоза влагалища, является оценка видового и количественного состава вагинального биотопа с учетом отношения вагинальных лактобацилл к общей бактериальной массе. Однако широко распространенные диагностические методы не всегда позволяют получить точное представление о характере микрофлоры и наличии воспалительной реакции слизистой влагалища. До сих пор не существует эффективного и доступного клиницистам исследования, позволяющего определять тип вагинальной лактофлоры и оценить состояние местного иммунного ответа. ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Обследуемая группа пациентов и дизайн исследования Для исследования состояния микробиоценоза влагалища и изучения видового состава вагинальных лактобацилл было обследовано 223 женщины репродуктивного возраста, которые обратились в поликлинические отделения ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта» с марта 2017 года по декабрь 2018 года. Причинами обращения пациенток были как профилактический осмотр, так и жалобы на различные вульвовагинальные симптомы. При осмотре регистрировали наличие патологических выделений из влагалища, зуд / жжение, болезненность / зуд и эритема вульвы, неприятный запах, дизурия, диспареуния, гнойный или слизисто-гнойный эндоцервикальный экссудат, петехии на шейке матки, абдоминальные боли. Критериями исключения были беременность, менопауза, прием пероральных или местных противомикробных препаратов и местных пробиотиков в течение 1 месяца до обследования. Для изучения уровня экспрессии мРНК генов локального иммунного ответа была обследована часть этих пациенток, а именно 137 женщин. Дополнительными критериями исключения для этого исследования были: выявление возбудителей ИППП, связанных с цервицитом (Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, Mycoplasma genitalium, HSV I, II типов), признаки цервицита, установленный или предполагаемый диагноз воспалительных заболеваний органов малого таза, использование внутриматочной спирали или вагинальных контрацептивов. Дизайн исследования У 223 женщин изучали анамнез заболевания, жалобы, данные гинекологического осмотра, измеряли рН среды влагалища. Клинические материалы отделяемого влагалища всех 223 женщин были исследованы с использованием микроскопического метода с оценкой микробиоценоза влагалища и выявления «ключевых» клеток, дрожжевых клеток и псевдомицелия дрожжеподобных грибов, определения соотношения числа лейкоцитов и клеток плоского эпителия; с использованием критериев Нуджента; с использованием критериев Дондерса, всего выполнено 669 микроскопических исследований. Проводили бактериологическое (культуральное) исследование с выделением и идентификацией микроорганизмов до вида, в том числе лактобацилл у всех 223 женщин. Использовали метод амплификации нуклеиновых кислот (ПЦР в режиме реального времени с использованием теста ФемофлорСкрин), 223 исследования. Кроме того, методом ПЦР в режиме реального времени с использованием теста «Типирование лактобактерий» исследовано 208 клинических материалов отделяемого влагалища, методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени с использованием теста «ИммуноКвантэкс» исследовано 137 клинических материалов из влагалища. Таким образом, проведено обследование 223 женщин и исследовано 1460 образцов, полученных из влагалища. Из них микроскопическими методами исследовано 669 вагинальных проб, выполнено 223 посева отделяемого влагалища, выделено 153 штамма лактобацилл. Методом амплификации нуклеиновых кислот проведено 208 определений 497 лактобацилл 7 видов (L. crispatus, L. iners, L. jensenii, L. gasseri, L. johnsonii, L. vaginalis и L. acidophilus). Методом ОТ-ПЦР проведено 137 постановок реакции с выявлением мРНК генов цитокинов (IL1В, IL10, IL18, TNF), транскрипционного фактора GATA3, толл-подобных рецепторов TLR4 и поверхностного маркера клеток иммунной системы CD68. Исследование проводилось в несколько этапов. На первом этапе был изучен качественный и количественный состав лактобацилл. Для этого обследованные женщины по состоянию микробиоценоза влагалища были разделены на 5 групп: I группу составили 20 женщин с АВ, II группу – 19 женщин с БВ, III группу - 14 женщин с КВВ, в IV группу вошли 18 женщин со смешанными инфекциями и 152 женщины с физиологическим микробиоценозом влагалища составили V группу. На следующем этапе мы оценили способность определенных видов лактобацилл к поддержанию рН вагинальной среды у 180 женщин. Этих пациенток разделили на 8 групп: первые 4 группы составили женщины с физиологическим микробиоценозом влагалища, разделенные по доминирующему типу лактобацилл: I - доминирование L. crispatus (36 женщин), II - доминирование L. gasseri (16 женщин), III - доминирование L. iners (50 женщин), IV- доминирование L. jensenii (7 женщин); и группы женщин с вагинальными инфекциями: V - АВ (20 женщин), VI - БВ (19 женщин), VII - КВВ (14 женщин), VIII - смешанные инфекции (18 женщин). На третьем этапе были изучены уровни экспрессии мРНК генов компонентов локального иммунного ответа. Для этого обследованы 137 женщин, из них, учитывая критерии включения, в исследование была включена 131 пациентка. Этот этап исследования мы разделили на 3 части. 1. Валидация теста ИммуноКвантэкс по наличию воспалительной реакции в вагинальном биотопе с использованием микроскопического метода и индекса воспаления теста ИммуноКвантэкс. 50 обследуемых разделили на 2 группы по микроскопическим признакам воспаления: I группу составили 26 женщин с воспалением, II группу – 24 женщины без воспаления. 2. Сравнительная оценка теста, основанного на ОТ-ПЦР с микроскопическим методом. Для решения этой задачи всех пациенток разделили на 8 групп: I БВ - 9 женщин, II КВВ – 7 женщин, III АВ - 14 женщин, IV БВ и КВВ – 1 пациентка, V БВ и АВ - 4 женщины, VI БВ, КВВ и АВ –2 женщины, VII группу составили пациентки, имеющие жалобы, но не имеющие инфекции – 72 женщины и VIII контрольная группа - 22 женщины. 3. Изучение уровня иммунных маркеров при вагинальных инфекциях. Всех пациенток разделили на группы с вагинальными инфекциями: I группа АВ - 20 женщин, II группа БВ - 16 женщин, III группа КВВ -10 женщин и IV группа контрольная – 22 женщины. Исследование было одобрено Этическим комитетом Научно- исследовательского института акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта, Санкт-Петербург (протокол 78/2016). Информированное согласие было получено от каждой участницы, включенной в исследование. 2.2. Исследуемый материал Материалом для исследования служило отделяемое заднего и боковых сводов влагалища. От каждой женщины были взяты три образца с помощью дакроновых тампонов. Один образец использовался для приготовления препарата для микроскопического исследования, второй – для культурального исследования, третий - для молекулярного тестирования. Биоматериал с одного тампона наносился тонким слоем на 2 предметных стекла для окрашивания по Граму и метиленовым синим и проведения микроскопического исследования. Для этого препарат высушивался на воздухе при комнатной температуре, после чего помещался в контейнер для транспортировки. Второй тампон помещали в транспортную среду с муколитиком ТСМ (ООО «Интерлабсервис», Москва, Россия) для скринингового анализа микробиоценоза с обнаружением возбудителей ИППП и видового типирования лактобацилл методом ПЦР. Содержимое третьего тампона для культурального исследования помещали в транспортную среду Amies (Medical Wire, Англия). Для оценки профиля экспрессии мРНК генов иммунного ответа с применением теста ИммуноКвантэкс биоматериал, во избежание деградации РНК, помещали в пластиковые пробирки объемом 1,5 мл, содержащие 500 мкл среды для стабилизации РНК в биопробах (ООО «НПО ДНК-Технология», Москва, Россия). Для транспортировки в лабораторию все исследуемые образцы были промаркированы и сопровождались направлениями на соответствующие исследования с указанием фамилии, имени и отчества пациентки, возраста, даты взятия материала, указания исследуемого материала (отделяемое влагалища). Хранение материала осуществляли при температуре 2–8°С не более 48 часов. Материал для определения профиля экспрессии иммунных маркеров методом ОТ-ПЦР после доставки в лабораторию сразу тестировался. Если не было возможности повести исследование в течение суток, образец хранился при -20° C от одного до нескольких месяцев до проведения исследования. Перед замораживанием образцы выдерживали в среде для стабилизации РНК при температуре 2-8°С в течение 12-24 часов для фиксации биоматериала. 2.3. Методы исследования Микроскопическое исследование проводили для формирования основных групп пациенток и оценки воспалительной реакции. Культуральное исследование осуществляли для получения культур микроорганизмов (основной интерес представляли культуры лактобацилл). Метод амплификации нуклеиновых кислот (МАНК), а именно ПЦР в режиме реального времени применяли для: 1) скринингового изучения вагинальной микробиоты с определением общего количества лактобацилл, основных УПМ и возбудителей ИППП; 2) видового типирования лактобацилл; 3) анализа транскрипционного профиля генов иммунного ответа. 2.3.1. Микроскопический метод Препараты для микроскопического исследования окрашивали по Граму и метиленовым синим. Окраску проводили в автоматическом мультистейнере TISSUE-TEK DRS 2000 (Sakura, Япония) набором реагентов ЗАО «Эколаб» (Россия) в соответствии с инструкцией производителя. В окрашенных препаратах оценивали характер микрофлоры, эпителиальные клетки, количество лейкоцитов. Наличие воспалительной реакции влагалища оценивали с использованием 1000-кратного увеличения микроскопа: учитывали отношение количества полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЯЛ) к эпителиальным клеткам (ЭК): соотношение ПМЯЛ/ЭК≤1:1 оценивали как отсутствие воспаления, при соотношении ПМЯЛ/ЭК>1:1 констатировали наличие воспаления [20].

Система подсчета баллов по Нудженту
0>30 0 0
Диагностику БВ проводили с применением метода Нуджента. Этот метод основан на микроскопической оценке в препарате трех морфотипов микроорганизмов: 1) морфотип лактобациллы – крупные грамположительные палочки; 2) морфотип Gardnerella и Bacteroides – мелкие грамотрицательные или грамвариабельные палочки, кокки и коккобациллы; 3) морфотип Mobiluncus – изогнутые грамотрицательные или грамвариабельные палочки. При обнаружении данных морфотипов по каждой позиции присваивались баллы, которые затем суммировались. Число баллов от 0 до 3 расценивали как нормоценоз, от 4 до 6 – промежуточный вариант, от 7 до 10 – БВ [86] (табл. 1). Важным микроскопическим признаком БВ является обнаружение «ключевых клеток». Это клетки плоского поверхностного эпителия влагалища, покрытые большим количеством грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов (чаще это тонкие палочки и коккобактерии), придающих клеткам зернистый вид и нечеткие очертания [20].
Таблица 1
Баллы
Морфотип
Lactobacillus
(Грам+ палочки)
Морфотип
Gardnerella
(Грам+/- кокки и коккобациллы)
Морфотип
Mobiluncus
(Грам+/- изогнутые палочки)
1 5-30
21-4 1-4 >5
<1 1-5 3 <1 40 >30
5-30
Для диагностики АВ использовали микроскопическое исследование по методу G. Donders [50]. В данном методе учитывается соотношение
лактобациллярной и нелактобациллярной микрофлоры, количество лейкоцитов и их соотношение с количеством эпителиальных клеток, лизосомальную активность лейкоцитов (токсичные лейкоциты выглядят округлыми и раздутыми, с лизосомами внутри), отношение количества парабазальных эпителиоцитов к количеству эпителиоцитов поверхностных и средних слоев. Суммирование баллов по каждой позиции дает общий счет от 0 до 10. Данные критерии также оценивали баллами и суммировали. При числе баллов <3 констатировали отсутствие АВ, 3 или 4 –легкую форму АВ, 5 или 6 – умеренную форму АВ, >6 – как тяжелую форму АВ (соответствует десквамативному воспалительному вагиниту) (табл. 2).
Таблица 2.
Критерии микроскопической диагностики аэробного вагинита (при увеличении микроскопа ×400)
микрофлора лейкоциты микрофлора эпителиоциты
Баллы
Лактобациллярная
Лейкоциты
Токсичные
Другая
Парабазальные
0
Лактобациллы
≤10 в поле
Отсутствуют
Отсутствует
существенно
зрения
или
или
Отсутствуют
или <1% встречаются очень редко превалируют над присутствует в другой 1 Количество увеличения другой >10 в поле
≤50% всех
незначительно
микрофлорой
м количестве
Маленькие
≤10% всех
лактобацилл
зрения, но
лейкоцитов
колиформные
эпителиоцитов
значительно
≤10 на
одну
бациллы
снижено на фоне
эпителиаль
ную клетку
значительного
микрофлоры
2
Лактобациллы
>10 на
отсутствуют или
одну
>50% всех
лейкоцитов
Кокки или
цепочки
>10% всех
эпителиоцитов
эпителиаль
ную клетку
присутствуют в
кокков
незначительном
количестве на фоне
избыточного роста
другой
микрофлоры
Микроскопический диагноз КВВ устанавливали при обнаружении вегетирующих форм грибов Candida: почкующихся клеток, псевдомицелия, других морфологических структур (бластоконидии, псевдогифы).
Чувствительность микроскопического исследования составляет 65-85%, специфичность (при наличии клинических проявлений) – 100%.
2.3.2. Культуральный (бактериологический) метод
Для бактериологического исследования клинический материал наносили на поверхность кровяного агара с 5% дефибринированной бараньей или лошадиной крови (OOO «БиоВитрум», Россия). Чашки Петри с клиническим материалом культивировали при температуре 36°С в СО2- инкубаторе (МСО-20AIC, Sanyo, Япония) в течение 24-48 часов. На основе эмпирических исследований была проведена полуколичественная оценка роста микроорганизмов на поверхности агара.
Видовую идентификацию выделенных лактобацилл и других микроорганизмов, осуществляли методом масс-cпектрометрического анализа с использованием времяпролетного масс-спектрометра MALDI-TоF MS AutoFlex III (Bruker Daltoniсs, Германия) c программным обеспечением Maldi BioTyper 3,0, позволяющим идентифицировать микроорганизмы с указанием коэффициента достоверности (score). Коэффициент достоверности выше 2,0 указывает на точную идентификацию до вида, уровень score от 1,7 до 2,0 свидетельствует о точной идентификации до рода.
2.3.3. Метод количественной полимеразной цепной реакции с детекцией результатов в режиме реального времени
Все этапы ПЦР-исследования выполнены согласно инструкциям производителей тестов. Для выделения ДНК использовали комплект реагентов «ДНК-сорб-АМ» (ООО «НекстБио», Москва, Россия), термостаты «Гном» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия), мини-центрифуги вортекс Микроспин (BioSan, Латвия) и центрифуги (Thermo Scientific, CША), для постановки реакции использовали детектирующие амплификаторы «DT-96» и «DTprime» (в модификациях 4 и 5 каналов, 96х0,2 мл).
Принцип метода ПЦР основан на использовании процесса амплификации ДНК, заключающегося в повторяющихся циклах
температурной денатурации ДНК, отжига праймеров с комплементарными последовательностями и последующей достройки полинуклеотидных цепей с этих праймеров Taq-полимеразой. В реакционную смесь для амплификации введены ДНК-зонды, каждый из которых несёт флуоресцентную метку и гаситель флуоресценции. При образовании специфичного продукта ДНК- зонд разрушается, действие гасителя на флуоресцентную метку прекращается, что ведёт к возрастанию уровня флуоресценции. Количество разрушенных зондов (а, следовательно, и уровень флуоресценции) увеличивается пропорционально количеству образовавшихся специфических ампликонов и измеряется на каждом цикле амплификации.
Использование нескольких флуоресцентных красителей позволяет сократить количество пробирок, поскольку появляется возможность одновременно регистрировать результаты разных реакций амплификации, проходящих в одной пробирке. В состав ДНК-зондов, использующихся для детекции продуктов амплификации фрагментов геномов определяемых микроорганизмов, в зависимости от количества каналов детекции, могут быть включены флуоресцентные метки Fam, Rox, Hex, Сy5 и Сy5,5. Регистрация сигнала флуоресценции проводится прибором во время амплификации. Учёт и интерпретация результатов реакции осуществляется автоматически с помощью программного обеспечения, поставляемого с детектирующим амплификатором.
Скрининговое исследования микрофлоры урогенитального тракта женщин осуществляли с помощью мультиплексного теста Фемофлор СКРИН (ООО «НПО ДНК-Технология», Москва) определяли общую бактериальную массу (ОБМ), нормофлору (ДНК Lactobacillus spp.), УПМ (G. vaginalis/P. bivia/Porphyromonas spp., Ureaplasma spp. и Mycoplasma hominis, Candida sp.), ДНК возбудителей ИППП (Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, Mycoplasma genitalium), и вирусов (вирусов простого герпеса с I и II типов, цитомегаловируса). В качестве контроля взятия материала указывается уровень геномной ДНК человека.

Микробиоценоз оценивали путём сравнения количества Lactobacillus spp. с ОБМ. Отсутствие значимых различий между этими показателями (лактобациллы составляют большую часть бактериальной массы – 80-100%) свидетельствует о сохранности нормофлоры. Уменьшение количества лактобацилл относительно ОБМ (менее 80%), как правило, свидетельствует о дисбиотических нарушениях различной степени тяжести, при которых на фоне снижения нормальной микрофлоры увеличивается количество условно патогенных бактерий и может сопровождаться ИППП.
Для видовой идентификации лактобацилл использовали тест- систему для исследовательских целей «Типирование лактобактерий», позволяющую определить общее количество (ДНК Lactobacillus spp.), шесть наиболее распространенных видов вагинальных лактобацилл и один биотехногенный (L. crispatus, L. iners, L. jensenii, L. gasseri, L. johnsonii, L. vaginalis и L. acidophilus) (ООО «НПО ДНК-Технология», Москва, Россия). Амплификацию осуществляли в режиме реального времени с измерением уровня флуоресценции по каналу FAM. Регистрацию и учет результатов ПЦР проводили с помощью программного обеспечения.
2.3.4. Метод количественной полимеразной цепной реакции с детекцией результатов в режиме реального времени с обратной транскрипцией для исследования профиля мРНК генов маркеров локального иммунного ответа слизистой влагалища
Для определения локальной воспалительной реакции использовали тест ИммуноКвантэкс (ООО «НПО ДНК-Технология», Москва, Россия). Для выделения нуклеиновых кислот использовали наборы «Проба-МЧ-НК-200S». Метод основан на лизисе клеток в 4М растворе гуанидинтиоцианата и осаждении нуклеиновых кислот изопропанолом в присутствии соосадителя с последующими отмывками промывочным раствором. После выделения суммарного пула ДНК/РНК проводили реакцию обратной транскрипции для получения матрицы мРНК, комплементарной ДНК, которая в дальнейшем амплифицировалась методом ПЦР. В качестве праймеров для обратной
транскрипции использовали оригинальные специфичные олигонуклеотиды и обратную транскриптазу M-MuLV. Реакцию проводили при температуре 40oС в течение 30 минут, с последующей инактивацией обратной транскриптазы при 95oС в течение 5 минут. Амплификацию осуществляли в режиме реального времени с измерением уровня флуоресценции по каналу FAM. После этапа амплификации по показателю индикаторного цикла программно рассчитывали уровень экспрессии мРНК генов врожденного иммунитета: интерлейкинов IL1b, IL10, IL18, фактора некроза опухоли TNFa, толл-подобных рецепторов TLR4, транскрипционного фактора GATA3, гена, кодирующего трансмембранный белок CD68. Гены были отобраны из 24 генов-кандидатов врожденного иммунного ответа на основе их уровня транскрипции (с концентрацией мРНК более 103 копий на 1 мл) в вагинальной жидкости 310 небеременных женщин репродуктивного возраста [36]. Референтным транскриптом, используемым для подтверждения достоверности прохождения реакции и нормирования транскриптов генов иммунного ответа, была мРНК бета-2-микроглобулина. На основе интегральной оценки полученных уровней экспрессии генов получали автоматическое заключение о наличии или отсутствии локальной воспалительной реакции по величине индекса воспаления (ИВ). Значение ИВ менее 50% оценивали как отсутствие воспалительной реакции, ИВ более 60% – как наличие воспаления, а диапазон значения 50–60% – как «нельзя исключить воспаление» (серая зона).
2.3.5. Статистические методы
Для анализа межгрупповых различий по частотным показателями использовали точный критерий Фишера (если сравнивались две переменные и какое-либо число в таблице сопряжения было меньше 5) или критерий хи- квадрат Пирсона (в остальных случаях). Все количественные переменные были сначала проверены на нормальное распределение с использованием теста Шапиро-Уилка. Для анализа различий между несколькими группами по количественным показателям использовали тест Крускала-Уоллиса с
последующим попарным сравнением групп с использованием теста Коновера. Ассоциацию между различными количественными переменными изучали с применением корреляции Спирмана. Для выявления наиболее специфичных иммунных маркеров различных вагинальных инфекций и лейкоцитоза использовали ROC-анализ (Receiver Operator Characteristic). Были построены ROC-кривые и рассчитаны характеристики эффективности классификации (площади под кривыми, индекс Юдена и оптимальные пороговые значения). Статистический анализ был выполнен с использованием пакета статистики MedCalc Statistical Software версии 18.11 (MedCalc Software bvba, Остенде, Бельгия; https://www.medcalc.org; 2018). Все различия считались статистически значимыми при p <0,05. Для получения графиков и рисунков использовали статистическую программу EA Analyzer. Для валидации нового теста оценки локальной воспалительной реакции по индексу воспаления, основанного на ОТ-ПЦР, ИммуноКвантэкс, проводили сравнение с микроскопическим методом. В анализ были включены только образцы, однозначно интерпретированные как наличие выраженной воспалительной реакции или отсутствие воспаления. Расчет чувствительности и специфичности проводили посредствам построения таблицы сопряженности. Истинно положительным считали положительный результат, полученный микроскопическим методом. Ложно положительными считали образцы, которые дали положительный результат только при исследовании тестом ИммуноКвантэкс, а при микроскопическом исследовании были отрицательны. Истинно отрицательными считали образцы, давшие отрицательный результат при исследовании микроскопическим методом и тестом ИммуноКвантэкс. Ложно отрицательными считали образцы, показавшие отрицательный результат при исследовании тестом ИммуноКвантэкс и, одновременно, положительный результат микроскопическим методом. Чувствительность, специфичность и прогностическую значимость применяемых методов рассчитывали по формулам: Чувствительность = Специфичность = ИП 100% ИП  ЛП ИП 100% ИП  ЛО ИО 100% ИО  ЛП ПЗ– = ИО ИО  ЛО 100% ПЗ+ = Объяснения к формулам: ПЗ+ ПЗ– ИП ЛП ИО ЛО прогностическая значимость положительного результата прогностическая значимость отрицательного результата истинно положительный результат ложноположительный результат истинно отрицательный результат ложноотрицательный результат ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Структура вагинальных инфекций в обследуемой популяции В исследование было включено 223 женщины в возрасте от 18 до 48 лет (рис. 1). Рис.1. Возраст обследованных пациенток Как видно из диаграммы, приведенной на рис. 1, большинство обследованных женщин были в возрасте от 30 до 35 лет (28,7%). Средний возраст составил 31,4±6,5 года. На основании данных осмотра и результатов лабораторных исследований были сформированы группы пациенток и охарактеризован состав микробиоценоза влагалища. Основную группу составили пациентки с признаками вагинальной инфекции 88,3% (n=197). Эти женщины предъявляли жалобы на выделения из половых путей (85,7%), зуд и жжение в области вульвы отмечали 26,5% женщин, неприятный запах выделений – Жалобы Выделения из половых путей Зуд/жжение Неприятный запах выделений Дизурия Диспареуния Абдоминальные боли 16,1%, 8,5% пациенток беспокоила диспареуния, 6,3% женщин жаловались на дизурию, а 3,6% - на боли внизу живота. Данные приведены в таблице 3. Жалобы обследованных пациенток Число пациенток 191 59 36 14 19 8 Таблица 3. Частота 85,7% 26,5% 16,1% 6,3% 8,5% 3,6% Как видно из данных, приведенных в таблице 3, самой частой жалобой у обратившихся на прием пациенток была жалоба на выделения из половых путей (у 85,7% женщин). При гинекологическом осмотре у 62,3% женщин регистрировали патологические выделения из влагалища, эрозия шейки матки была обнаружена у 21,5% женщин, у 7,2% – гиперемия вульвы и/или влагалища, выделения из цервикального канала наблюдали у 0,9%, и у 1 пациентки (0,5%) наблюдались петехии на шейке матки (таблица 4). Таблица 4. Результаты гинекологического осмотра обследованных женщин Симптомы Выделения из влагалища Эрозия шейки матки Гиперемия влагалища или вульвы Выделения из цервикального канала Петехии на шейке матки Число пациенток Частота 139 62,3% 48 21,5% 16 7,2% 2 0,9% 1 0,5% Вагинальные инфекции, вызванные условно патогенными микроорганизмами, были выявлены у 71 женщины (31,8%): АВ – у 20 (9%), БВ – у 19 (8,5%), КВВ – у 14 (6,3%); а также смешанные формы инфекций: сочетания БВ и АВ – у 9 (4%), БВ, АВ и КВВ – у 4 (1,8%), БВ и КВВ –у 4 (1,8%), АВ и КВВ – у 1 (0,4%). Эти данные приведены в таблице 5. Таблица 5. Частота выявления вульвовагинальных инфекций у женщин Инфекция АВ БВ КВВ БВ, АВ БВ, АВ, КВВ БВ, КВВ АВ, КВВ Есть симптомы, нет инфекции Нет симптомов, нет инфекции Число случаев Частота 20 9,0% 19 8,5% 14 6,3% 9 4,0% 4 1,8% 4 1,8% 1 0,4% 126 56,5% 26 11,7% Общая частота АВ, в том числе и в составе смешанных инфекций, составила 15,2% (34 из 223), БВ – 16,1% (36 из 223), КВВ – 10,3% (23 из 223). Инфекций не было обнаружено у 126 (56,5%) пациенток с вульвовагинальными симптомами. Контрольную группу составили 26 женщин (11,7%) с отсутствием жалоб, признаков воспаления и инфекций. Структура вагинальных инфекций в обследованной популяции представлена на рис. 2. Самыми распространенными инфекциями являются АВ и БВ 28,2% (20 из 71) и 26,8% (19 из 71), соответственно, доля КВВ составила 19,7% (14 из 71). Сочетание нескольких вагинальных инфекций наблюдалось в 25,3% случаев (18), а именно, БВ в сочетании с АВ имел место у 12, 7% женщин (9), БВ в сочетании с АВ и КВВ и БВ в сочетании с КВВ встречались в 5,6% случаев (по 4 женщины) и в 1,4% (1 пациентка) имел место АВ в сочетании с КВВ. Рис. 2. Структура вагинальных инфекций При дальнейшей разработке темы мы учитывали и наличие смешанных инфекций у обследованных женщин. Таким образом, из 71 женщины с вагинальными инфекциями доля пациенток с БВ составила 50,7%, АВ - 47,9%, КВВ - 23%. 3.2. Валидация мультиплексного исследовательского теста на основе ПЦР в реальном времени для обнаружения и дифференциации видов Lactobacillus spp. Внедрение любого диагностического теста в практическую работу требует проведения его оценки с определением параметров чувствительности и специфичности. Важнейшей задачей лабораторных исследований является получение достоверных результатов с использованием надежных тест- систем. ПЦР является одним из самых востребованных методов лабораторной диагностики, и для оценки пригодности новой тест-системы, основанной на ПЦР в реальном времени, необходим процесс валидации, включающий оптимизацию, стандартизацию и определение объективных параметров нового теста. Амплификация, учет и интерпретация результатов реакции данного теста осуществляется автоматически с помощью программного обеспечения, что соответствует требованиям к оптимизации и стандартизации предлагаемой методики. Прежде, чем приступать к видовой дифференциации лактобацилл в исследуемых образцах, мы провели валидацию тест-системы для научных исследований «Типирование лактобактерий» (ООО «НПО ДНК-Технология», Москва, Россия). Это было необходимо для того, чтобы убедиться, что 1) тест способен надежно дифференцировать основные виды лактобацилл; 2) тест не обнаруживает влагалищные микроорганизмы, не относящиеся к роду Lactobacillus spp. Для выявления аналитической чувствительности теста были исследованы 40 клинических изолятов следующих микроорганизмов, полученные при культуральном исследовании отделяемого влагалища и идентифицированные методом масс-спектрометрии: L. crispatus (n = 9), L. iners (n = 4), L. jensenii (n = 4), L. gasseri (n = 2), L. vaginalis (n = 2), L. johnsonii (n = 2), L. plantarum (n = 2), L. rhamnosus (n = 2), L. fermentum (n = 1), L. paracasei (n = 1), Staphylococcus aureus (n = 1), Streptococcus agalactiae (n = 1), Esherichia coli (n = 1), Klebsiella pneumoniae (n = 1), Proteus mirabilis (n = 1), Enterobacter aerogenes (n = 1), Enterobacter cloacea (n = 1), Enterococcus faecalis (n = 1), Corynebacterium amycolatum (n = 1), Gardnerella vaginalis (n = 1), Candida albicans (n = 1). При этом исследовании с помощью теста «Типирование лактобактерий» все 29 видов лактобацилл, такие как L. crispatus (n = 9), L. iners (n = 4), L. jensenii (n = 4), L. gasseri (n = 2), L. vaginalis (n = 2), L. johnsonii (n = 2), L. plantarum (n = 2), L. rhamnosus (n = 2), L. fermentum (n = 1), L. paracasei (n = 1), идентифицированы со 100% точностью. Все образцы лактобацилл были определены в количестве ≥6 lg ГЭ/мл. С другими изолятами бактерий, не относящихся к роду Lactobacillus spp., тест не дал положительных результатов. Таким образом, аналитическая чувствительность и специфичность теста для выявления вагинальных лактобацилл методом ПЦР в реальном времени составила 100%. 3.3. Видовое типирование лактобацилл методами количественной ПЦР и MALDI TOF MS 3.3.1. Видовое типирование лактобацилл методом количественной ПЦР Методом ПЦР в режиме реального времени лактобациллы были выявлены у 208 из 223 женщин (93,3%). При видовом типировании 208 образцов было обнаружено 497 лактобацилл 7 видов, входящих в тест- систему, и выявлено, что наиболее распространенными являются 4 вида лактобацилл: L. iners, L. crispatus, L. jensenii, L. vaginalis (рис. 3). Рис. 3. Частота выявления различных видов лактобацилл в вагинальном биотопе обследованных женщин (n=208) Так частота встречаемости L. iners в исследуемой популяции составила 62%, L. crispatus - 47%, L. jensenii - 45%, L. vaginalis - 43%, реже определялись L. gasseri - 31%, L. johnsonii - 11%. Вид L. acidophilus, который является биотехногенным штаммом, был обнаружен лишь у одной женщины и был единственным видом лактобацилл в составе микробиоценоза. Несмотря на то, вид L. vaginalis входит в четверку самых часто встречающихся видов, его количество в общем пуле лактобацилл незначительное - от 3,1 до 5,5 lg ГЭ/мл. 3.3.2. Идентификация лактобацилл методом масс-спектрометрии При культуральном исследовании отделяемого влагалища лактобациллы были выделены в 135 образцах. При этом было получено 152 штамма лактобацилл. Видовая идентификация полученных штаммов была проведена методом MALDI TOF MS с высокой (score ≥ 2,0) и средней (score 1,7 -2,0) степенью достоверности. По результатам масс-спектрометрического типирования лидирующее положение занимали 4 вида: L. crispatus - 59 штаммов (38,8%), L. jensenii- 41 (27%), L. gasseri - 30 (19,7%) и L. iners - 12 (7,9%). Также были определены 10 штаммов (6,6%) других видов (L. rhamnosus, L. plantarum, L. fermentum, L. vaginalis, L. jonsonii и L. curvatus), их доля в общем количестве лактобацилл составила от 0,7 до 2%. 3.3.3. Сравнение результатов видового типирования лактобацилл методом MALDI TOF MS и ПЦР в реальном времени Учитывая разную чувствительность методов, нельзя полноценно сравнивать результаты видового типирования лактобацилл, полученные при масс-спектрометрической идентификации культур, выделенных на питательной среде и ПЦР типирования с праймерами к 7 видам лактобацилл. При культуральном исследовании, как правило, мы выявляли один вид лактобацилл, два вида были выделены лишь в 14 образцах (9,2%). Тогда как при ПЦР исследовании чаще в одном образце обнаруживалось 2 и более видов. Так из 208 проб, содержащих лактобациллы, видовое разнообразие наблюдалось в 151 образце (72,6%). При этом вид лактобацилл, выявленный при культуральным исследовании, зачастую соответствовал доминирующему виду, определенному методом ПЦР. Исключение составляли образцы, где доминирующим был вид L. iners. Культуральным методом в исследуемом материале у 70 (33,7%) из 208 пациенток выделить лактобациллы не удалось. У 5 из них в пробах, исследованных методом ПЦР, общее количество лактобацилл было менее 3,5 lg ГЭ/мл. Учитывая низкую чувствительность бактериологического метода, такое количество микроорганизмов может быть недостаточным для получения культуры на питательной среде. В остальных 65 образцах, где количество лактобацилл составляло 4,4 - 8.2 lg ГЭ/мл, в 41 пробе доминирующим видом был вид L. iners (63,1%), в 9 - L. crispatus (13,9%), в 9 - L. gasseri (13,9%), в 5 - L. jensenii (5,7%) и в одном образце доминировал вид L. vaginalis (1,5%). Результаты культурального метода показали, что видовое разнообразие вагинальных лактобацилл не ограничивается видами, входящими в состав тест-системы для типирования лактобацилл. С помощью масс-спектрометрии были выявлены такие виды, как L. curvatus, L. fermentum, L. rhamnous, L. plantarum. Результаты сравнения культурального и молекулярно- биологического методов выявления вагинальных лактобацилл, представлены в таблице 6. Как видно из данных, представленных в таблице , хорошо культивируемыми видами являются виды L. crispatus, L. jensenii и L. gasseri. Частота совпадений была почти 60% по выявлению L. crispatus, 43% по L. jensenii и 45% по L. gasseri. Эти виды лактобацилл неплохо культивировались на плотных питательных средах, хотя методом ПЦР в реальном времени они выявлялись чаще. Вид L. vaginalis, относящийся к часто встречающимся видам, выделить культуральным методом удалось лишь в одном случае, так же как и вид L. johnsonii. В одном образце методом ПЦР был обнаружен вид L. acidophilus, который являлся единственным видом. При исследовании материала от этой пациентки культуральным методом L. acidophilus культивировать не удалось, однако был выделен вид L. plantarum. Самый распространенный в нашей популяции вид L. iners относится к трудно культивируемым микроорганизмам, рост лактобацилл этого вида получили в 12 образцах, что составило менее 10% от общего числа проб, содержащих L. iners. Таблица 6 Различия в обнаружении видов лактобацилл методом ПЦР в реальном времени и культуральным методом Вид лактобацилл ПЦР в реальном времени n=497 Культуральное исследование n=152 Культуральное исследование / ПЦР в реальном времени % совпадений L. iners 128 L. crispatus 97 L. jensenii 94 L. gasseri 65 L. vaginalis 89 L. johnsonii 23 L. acidophilus 1 Таким образом, лишь благодаря определить лидирующее место вида L. iners в исследуемой популяции и выявить, что вагинальный биотоп одной женщины зачастую колонизируют несколько видов вагинальных лактобацилл. 12 9,4 58 59,8 40 42,6 29 44,6 1 1,1 1 4,3 0 - использованию ПЦР удалось 3.4. Видовое разнообразие лактобацилл у женщин с вагинальными инфекциям Используя метод ПЦР в режиме реального времени, мы исследовали ассоциацию разных видов лактобацилл с вагинальными инфекциями (БВ, АВ и КВВ). Частота различных видов лактобацилл при определенных вагинальных инфекциях оценивалась в сравнении со всеми остальными группами пациенток, включающих группы женщин с другими вагинальными инфекциями и физиологическим микробиоценозом влагалища. В таблице 7 представлены данные по выявлению различных видов лактобацилл при бактериальном вагинозе (БВ). Проводилось сравнение с женщинами, у которых не был установлен диагноз БВ. Группу сравнения составили женщины с АВ, КВВ и физиологическим микробиоценозом. Таблица 7. Частота обнаружения различных видов лактобацилл при Вид лактобацилл L. crispatus L. iners L. jensenii L. gasseri L. vaginalis бактериальном вагинозе (БВ) Частота, n (%) Значение р <0,0001 0,3653 0,0179 0,1667 0,0015 БВ есть (n=37) 2 (5,4) 24 (64,9) 9 (24,3) 7 (18,9) 6 (16,2) БВ нет (n=186) 95 (51,1) 104 (55,9) 85 (45,7) 58 (31,2) 83 (44,6) В таблице 8 представлены данные по выявлению различных видов лактобацилл при аэробном вагините (АВ). Проводилось сравнение с женщинами, у которых не был установлен диагноз АВ. Группу сравнения составили женщины с БВ, КВВ и физиологическим микробиоценозом. Частота обнаружения различных видов лактобацилл при аэробном вагините (АВ) Таблица 8. Вид лактобацилл L. crispatus L. iners L. jensenii L. gasseri L. vaginalis Частота, n (%) АВ есть (n=34) 4 (11,8) 17 (50,0) 8 (23,5) 9 (26,5) 8 (23,5) АВ нет (n=189) 93 (49,2) 111 (58,7) 86 (45,5) 56 (29,6) 81 (42,9) Значение р <0,0001 0,3532 0,0227 0,8385 0,0373 Как видно из данных, приведенных в таблицах 8 и 9, при БВ и АВ наблюдалась схожая картина частоты обнаружения видов лактобацилл. Так, L. crispatus, L. jensenii и L. vaginalis при этих заболеваниях влагалища встречались значительно реже, чем другие виды. Особенно это характерно для вида L. crispatus (p=0,0001). При БВ L. crispatus был выявлен в 5,4% случаев, при АВ – в 11,8%. Самым часто встречающимся видом при БВ (64,9%) и АВ (50%) был вид L. iners, однако различия в частоте выявлении этого вида лактобацилл при этих заболеваниях не были статистически значимыми. В таблице 9 представлены данные по выявлению различных видов лактобацилл при кандидозном вульвовагините (КВВ). Проводилось сравнение с женщинами, у которых не был установлен диагноз КВВ. Группу сравнения составили женщины с БВ, АВ и физиологическим микробиоценозом. Частота обнаружения различных видов лактобацилл при кандидозном вульвовагините (КВВ) Таблица 9. Вид лактобацилл L. crispatus L. iners L. jensenii L. gasseri L. vaginalis Частота, n (%) КВВ есть (n=23) 8 (34,8) 15 (65,2) 12 (52,2) 13 (56,5) 15 (65,2) КВВ нет (n=200) 89 (44,5) 113 (56,5) 82 (41,0) 52 (26,0) 74 (37,0) Значение р 0,5061 0,5076 0,3738 0,0061 0,0125 Как показано в таблице 10, значительно чаще в группе с КВВ обнаруживался вид L. gasseri (p=0,0061). При КВВ, в отличие от БВ и АВ, нет дефицита лактобациллярной микрофлоры, однако частота встречаемости основных видов схожа с таковой при БВ и АВ. Так L. crispatus был самым редким видом при КВВ, выявлялся в трети всех случаев, а L. iners самым распространенным (65,2%). Основным отличием от БВ и АВ явилась высокая распространенность в группе с КВВ L. vaginalis (65,2%), что сопоставимо с распространенностью L. iners. Вариации содержания различных видов лактобацилл у женщин с вагинальными инфекциями по сравнению с женщинами без инфекций (с физиологическим микробиоценозом влагалища) показаны на рисунке 4. Для выявления более точной ассоциации видов лактобацилл с вагинальными инфекциями в анализ не были включены женщины со смешанными инфекциями. Рис. 4. Содержание лактобацилл различных видов (log- трансформированное количество копий на 1 мл) во влагалище женщин с аэробным вагинитом, бактериальным вагинозом, кандидозным вульвовагинитом по сравнению с группой женщин без данных инфекций; маркеры с ограниченными линиями обозначают медианы с межквартильными интервалами; * - значение р <0,05, ** - значение р <0,01, *** - значение р <0,001 На рисунке 4 показано, что вид L. iners обнаруживался в достаточном количестве во всех исследуемых группах. Содержание L. crispatus было самым большим в группе женщин с физиологическим микробиоценозом. Бактериальная масса видов L. crispatus и L. jensenii при БВ и АВ была незначительной. Количественное содержание видов L. gasseri и L. vaginalis было выявлено при КВВ в значительно большей бактериальной массе, чем у женщин без инфекции. Таким образом, было установлено, что содержание лактобацилл различных видов варьировало в зависимости от состояния микробиоценоза влагалища и наличия или отсутствия вагинальной инфекции. Общая частота встречаемости основных видов лактобацилл в зависимости от состояния микробиоценоза влагалища в исследуемой популяции показана на рисунке 5. Контрольную группу составили все пациентки с физиологическим микробиоценозом влагалища. В анализ не вошли виды L. johnsonii и L. acidophilus, так как их распространенность была незначительной. Рис. 5. Распространенность видов лактобацилл при вагинальных инфекциях (АВ – аэробный вагинит, БВ – бактериальный вагиноз, КВВ – кандидозный вульвовагинит) и нормоценозе Во всех исследуемых группах L. iners был самым часто встречающимся видом, кроме группы с КВВ, где чаще всего определялся вид L. vaginalis. Молекулярно-биологический метод диагностики позволил определить, что количество видов лактобацилл, выявляемых у одной женщины, варьировало от 1 до 6 видов, и этот показатель зависел от состояния микробиоценоза. На рисунке 6 показано соотношение образцов, содержащих 1 или 2 и более видов лактобацилл у пациенток с различными вагинальными инфекциями и с физиологическим микробиоценозом. Из исследования исключены женщины со смешанными инфекциями. Рис. 6. Количество видов лактобацилл, выявляемых у женщин с различными вагинальными инфекциями (АВ – аэробный вагинит, БВ – бактериальный вагиноз, КВВ – кандидозный вульвовагинит) и физиологическим микробиоценозом На рисунке видно, что у женщин с БВ - инфекции, для которой характерно истощение лактобациллярной микрофлоры, видовое разнообразие лактобацилл (выявление 2 видов и более) встречалось в 33,4% случаев, что значительно реже (р=0,0002), чем у женщин без инфекций (77,6%) или с КВВ (100%) – состояний, для которых истощение лактобациллярной микрофлоры не свойственно. В группе с АВ также наблюдалось преобладание образцов, содержащих несколько видов лактобацилл (70,6%). Учитывая, что вагинальные пробы содержали несколько видов лактобацилл, был проведен анализ всех образцов по доминирующему виду. Доминирующим считали вид, количество которого относительно общей концентрации лактобациллярной микрофлоры составлял 50% и более. На рисунке 7 представлено распределение случаев обнаружения лактобацилл по доминирующему виду. Рис. 7. Распределение случаев выявления лактобацилл в вагинальном биотопе женщин по доминирующему виду Нами было установлено, что наиболее часто доминирующими были 4 вида: L. iners (51%), L. crispatus (24%), L. gasseri (14,4%) и L. jensenii (5,8%). Доля других видов лактобацилл в общей лактобациллярной массе была незначительной. В единичных случаях (0,5%) доминировали L. vaginalis и L. acidophilus. В 10 образцах наблюдалось одновременное доминирование двух видов лактобацилл: в 4 случаях L. crispatus и L. iners (1,9%), в двух - L. iners и L. gasseri (1%), и по одному случаю (0,5%) L. crispatus /L. jensenii и L. iners/ L. jensenii. При доминировании двух видов лактобацилл, одним из них чаще всего был вид L. iners. Чтобы лучше изучить взаимосвязь основных видов лактобацилл с состоянием микробиоценоза, мы оценили распространенность лактобацилл по доминирующему типу в группах женщин с вагинальными инфекциями и у здоровых женщин. Для оценки влияния лактобацилл на состояние женщины, в качестве контрольной группы были взяты пациентки с физиологическим микробиоценозом и отсутствием каких-либо жалоб и симптомов (рис.8). Рис.8. Распространение основных видов лактобацилл по доминирующему типу при вагинальных инфекциях (АВ – аэробный вагинит, БВ – бактериальный вагиноз, КВВ – кандидозный вульвовагинит) и нормоценозе Как показано на рисунке, L. iners преобладает во всех группах. В группах с БВ и смешанными вагинальными инфекциями самая высокая частота доминирования L. iners, при этом вид L. crispatus ни в одной из этих групп не доминировал. Чаще всего в качестве доминирующего вида L. crispatus обнаруживался в контрольной группе. Вид L. jensenii во всех группах сравнения выявлялся одинаково редко. L. gasseri чаще обнаруживался в группе с АВ. Одним из важнейших механизмов поддержания стабильности вагинального микробиоценоза является способность вагинальных лактобацилл обеспечивать низкий окислительно-восстановительный потенциал вагинальной среды. Нами была проведена оценка значения рН влагалища при различных состояниях вагинального микробиоценоза. Для этого все образцы разделили на 8 групп: первые 4 группы составили женщины с физиологическим микробиоценозом влагалища, которых объединили по доминирующему виду лактобацилл, в остальные группы вошли пациентки с вагинальными инфекциями - АВ, БВ, КВВ и смешанные инфекции (табл.10). Таблица 10. Значения рН влагалища при различных типах вагинального микробиоценоза Значения рН Миниму м 25% квартиль Медиана 75% квартиль Максимум Тип микробиоценоза Значимые различия (6)(8) (6)(8) (6)(8) (5)(6)(8) (4)(8) (1)(2)(3)(4) (7) (6)(8) (1)(2)(3)(4) (5)(7) Доминирование 3,7 4,08 4,50 4,92 6,0 L. crispatus (1) Доминирование 3,7 4,20 4,50 4,68 6,0 L. gasseri (2) Доминирование 3,7 4,20 4,50 5,00 7,0 L. iners (3) Доминирование 3,5 3,75 4,00 4,42 6,0 L. jensenii (4) Аэробный 4,0 4,50 4,50 5,00 7,0 вагинит (5) Бактериальный 4,2 4,58 5,50 5,92 7,0 вагиноз (6) Кандидозный 4,0 4,18 4,50 4,80 6,0 вульвовагинит (7) Смешанные 4,0 5,00 6,00 6,00 7,0 инфекции (8) Самые низкие значения рН отмечались в группах женщин с физиологическим микробиоценозом, при этом самые низкие показатели были отмечены в группе с доминированием L. jensenii рН=3,5 (медиана 4,0). Самые высокие значения рН=7 были в группах с БВ (медиана 5,5) и смешанными инфекциями (медиана 6,0). Значения рН в группах женщин без инфекций и в группе с КВВ значительно отличались от рН в группах с БВ и смешанными инфекциями. Выявлены различия между группой с доминированием L. jensenii и группой женщин с АВ, а также между группами с АВ и смешанными инфекциями. Эти данные представлены на рисунке 9. Рис. 9. Значения рН влагалища при различных типах вагинального микробиоценоза: нормоценоз с доминированием разных видов лактобацилл и вагинальные инфекции (АВ – аэробный вагинит, БВ – бактериальный вагиноз, КВВ – кандидозный вульвовагинит); маркеры с ограниченными линиями обозначают медианы с межквартильными интервалами Значения рН вагинальной среды в группе пациенток с КВВ сопоставимо со значениями рН вагинальной среды женщин, не имеющих вагинальных инфекций. При этом очевидны различия между группами женщин без инфекций и женщин с БВ и смешанными инфекциями. Несмотря на то, что во всех группах с доминированием лактобацилл в среднем был одинаково низкой уровень рН 4-4,5, разные виды лактобацилл отличаются способностью к поддержанию кислой среды влагалища. В связи с этим, мы провели корреляцию между разными видами лактобацилл и значениями рН вагинальной среды (табл. 11). Вид лактобацилл Коэффициент Спирмена 95% доверительный интервал Значение р Нижняя граница Верхняя граница L.crispatus L.iners L.jensenii L.gasseri L.vaginalis рН влагалища -0,184 -0,328 -0,030 0,146 -0,008 0,294 -0,009 -0,163 0,145 -0,040 -0,193 0,115 -0,093 -0,244 0,062 0,0159 0,0553 0,9025 0,6052 0,2237 Таблица 11. Корреляция между содержанием различных видов лактобацилл и По результатам, отображенным в таблице 11 видно, что значительно чаще низкие значения рН наблюдались в группе пациенток с доминированием L. crispatus (р=0,0159), чем у женщин с преобладанием других видов лактобацилл. 3.5. Сочетание различных видов лактобацилл между собой и с другими бактериями влагалища Особенностью нормальной микрофлоры вагинального биотопа является многообразие его состава, включающее как разные виды лактобацилл, так и различные УПМ. Чтобы оценить сосуществование разных микроорганизмов, нами была проанализирована взаимосвязь различных видов лактобацилл, как между собой (табл. 12), так и с отдельными представителями условно патогенной микрофлоры, а именно кластером G. vaginalis/P. bivia/Porphyromonas spp., а также Ureaplasma spp. и Mycoplasma hominis, а также взаимосвязь между этими УПМ (табл.13). Корреляция между различными видами лактобацилл 95% ДИ Таблица 12 Сравниваемые параметры L. crispatus, L. iners L. crispatus, L. jensenii L. crispatus, L. gasseri L. crispatus, L. vaginalis L. iners, L. jensenii L. iners, L. gasseri L. iners, L. vaginalis L.jensenii, L.gasseri L.jensenii, L.vaginalis L.gasseri, L.vaginalis р 0,3371 0,0792 0,0086 <0,0001 <0,0001 0,0039 <0,0001 0,1035 <0,0001 0,1872 Коэффициент Нижняя Спирмена граница граница -0,065 -0,198 0,071 0,118 -0,018 0,249 -0,176 -0,304 -0,041 0,403 0,283 0,510 0,395 0,274 0,503 -0,192 -0,319 -0,059 0,292 0,163 0,411 0,109 -0,241 0,026 0,370 0,247 0,481 0,089 -0,047 0,221 Верхняя Значение Выявлена значительная положительная корреляция между некоторыми видами лактобацилл, а именно между L. crispatus и L. vaginalis, L. iners и L. vaginalis, L. jensenii и L. vaginalis, L. iners и L. jensenii. Таким образом, вид L. vaginalis, который часто встречается в обследуемой популяции, но всегда в небольших количествах, чаще всего положительно коррелирует с основными видами лактобацилл L. crispatus, L. iners и L. jensenii. Отрицательная корреляция наблюдается между видами L. iners и L. gasseri, L. crispatus и L. gasseri, что указывает на редкую ассоциацию вида L. gasseri с двумя самыми распространенными представителями вагинальной лактофлоры. Между лактобациллами и УПМ положительной корреляции не наблюдается. Выраженная отрицательная корреляция отмечена между видом L. crispatus и кластером анаэробов G. vaginalis/P. bivia/Porphyromonas spp. (p<0,0001). Таблица 13 Корреляция между видами лактобацилл и другими бактериями влагалища Сравниваемые параметры Ureaplasma spp, L.crispatus Ureaplasma spp, L. iners Ureaplasma spp, L. jensenii Ureaplasma spp, L. gasseri Ureaplasma spp, L.vaginalis M.hominis, G.vaginalis+Prev+Porphyr. M.hominis, L. crispatus M.hominis, L. iners M.hominis, L. jensenii M.hominis, L. gasseri M.hominis, L. vaginalis G.vaginalis+Prev+Porphyr., L. crispatus G.vaginalis+Prev+Porphyr., L.iners G.vaginalis+Prev+Porphyr., L.jensenii G.vaginalis+Prev+Porphyr., L.gasseri G.vaginalis+Prev+Porphyr., L. vaginalis Ureaplasma spp, M. hominis Ureaplasma spp, G.vaginalis+Prev+Porphyr Коэффициент 95% ДИ Спирмена Нижняя Верхняя граница граница -0,019 -0,153 0,117 0,119 -0,017 0,250 0,044 -0,091 0,179 0,169 0,034 0,297 0,164 0,030 0,293 -0,003 -0,138 0,132 -0,035 -0,170 0,100 -0,138 -0,268 -0,003 -0,181 -0,309 -0,047 -0,001 -0,137 0,134 -0,105 -0,237 0,031 -0,263 -0,385 -0,133 0,054 -0,082 0,187 -0,061 -0,195 0,074 0,139 0,004 0,270 -0,015 -0,150 0,121 0,119 -0,017 0,250 0,417 0,98 0,522 Значение р 0,7819 0,0773 0,5095 0,0116 0,0140 0,9641 0,6010 0,0397 0,0066 0,9822 0,1186 <0,0001 0,4256 0,3608 0,0374 0,8262 0,0767 <0,0001 Менее значительная отрицательная корреляция наблюдается между видом L. jensenii и Mycoplasma hominis (p=0,0066). При оценке взаимосвязи между УПМ выявлена положительная корреляция кластера G. vaginalis/P. bivia/Porphyromonas spp. с Ureaplasma spp. (p<0,0001) . 3.6. Оценка воспалительной реакции с применением микроскопического метода и метода ОТ-ПЦР Мы провели сравнение теста ИммуноКвантэкс (ООО «НПО ДНК- Технология», Москва, Россия) на основе ОТ-ПЦР, предназначенного для определения локального воспаления нижних отделов женского репродуктивного тракта с микроскопическим методом, традиционно используемым для оценки воспалительной реакции. Из 137 обследованных пациенток 6 были исключены: у 2 был обнаружен ВПГ, у одной были признаки цервицита, а у 3 – абдоминальные боли. У 37 из 131 включенных в исследование женщин (28,2%) была диагностирована вагинальная инфекция. АВ (все формы), БВ и КВВ как единичные инфекции были выявлены у 14 (10,7%), 9 (6,9%) и 7 женщин (5,3%), соответственно. Комбинация АВ и БВ была обнаружена у 4 женщин (3,1%), БВ и КВВ у одной женщины (0,8%), АВ, БВ и КВВ у 2 женщин (1,5%). Общие показатели АВ, БВ и КВВ составили 15,3% (n = 20), 12,2% (n = 16) и 7,6% (n = 10) соответственно. У 94 женщин вагинальные инфекции не были диагностированы. При этом у 22 из них не было выявлено никаких вагинальных симптомов или признаков инфекции и эти пациентки были отнесены к контрольной группе. Различий в возрасте между тремя группами женщин, то есть женщин с вагинальными инфекциями, женщин, составившим контрольную группу и женщин, предъявляющими жалобы, но не имеющими ни одной из вагинальных инфекций, не было (средний возраст 31, 30 и 31 года, соответственно; р = 0,5161). При микроскопической оценке воспалительной реакции влагалища воспаление констатировали при соотношении количества ПМЯЛ и ЭК >1 [20].
Результаты исследования вагинальных образцов на наличие воспаления с использованием микроскопического метода и теста ИммуноКвантэкс, стратифицированные по различным вагинальным инфекциям и их сочетаниям, представлены в таблице 14.
Таблица 14 Результаты исследования вагинальных образцов на наличие воспаления с
использованием микроскопического метода и метода обратно- транскриптазной ПЦР (тест ИммуноКвантэкс)
Вагинальная инфекция
БВ
КВВ
АВ
БВ и КВВ
БВ и АВ
БВ, КВВ и АВ
ПМЯЛ/ЭК ≥1 (есть воспаление)
ПМЯЛ/ЭК <1 (нет воспаления) ИВ≥50 (есть воспаление) 2 5 14 1 4 2 ИВ<50 (нет воспаления) 0 0 0 0 0 0 ИВ≥50 (есть воспаление) 7 1 0 0 0 0 ИВ<50 (нет воспаления) 0 1 0 0 0 0 Симптомы есть, инфекции нет 20 7 18 27 Симптомов нет, инфекции нет 0 0 20 Всего Примечание: ПМЯЛ/ЭК – отношение числа полиморфноядерных лейкоцитов к числу эпителиальных клеток, определенное с применением микроскопического метода; ИВ – индекс воспаления, определенный с применением ОТ-ПЦР (тест ИммуноКвантэкс) ; АВ – аэробный вагинит, БВ – бактериальный вагиноз, КВВ – кандидозный вульвовагинит Результаты обоих методов в значительной мере совпали при анализе проб от женщин с КВВ и АВ – вагинальных инфекциях, для которых характерно воспаление. В то же время, при тестировании проб от женщин с БВ – невоспалительным синдромом, а также женщин, у которых вагинальные инфекции не выявлялись, но имелись жалобы, наблюдались существенные расхождения. Так, 7 из 9 проб от женщин, у которых обнаружили только БВ, были отрицательны на наличие воспаления микроскопическим методом и положительны методом ОТ-ПЦР. В группе женщин с симптомами, но без 7 48 Вагинальная инфекция КВВ АВ КВВ и БВ АВ и БВ КВВ, АВ и БВ ПМЯЛ/ЭК ≥1 (есть воспаление) ПМЯЛ/ЭК <1 (нет воспаления) инфекций у 7 пациенток (25,9%) с микроскопическими признаками воспаления результаты ИммуноКвантэкса были отрицательны. И, наоборот, у 18 женщин (40%) с симптомами, но без инфекций и 2 пациенток контрольной группы при отрицательных результатах микроскопии индекс ИммуноКвантэкса свидетельствовал о наличии воспаления. Для расчета чувствительности и специфичности нового теста ИммуноКвантэкс для оценки локальной воспалительной реакции во влагалище относительно широко распространенного микроскопического метода, мы сравнили данные результатов исследования 50 образцов от пациенток с вагинальными инфекциями с воспалительным синдромом (АВ, КВВ и смешанными инфекциями) и здоровых женщин контрольной группы, не имеющих микроскопических признаков воспаления (табл. 15). Таблица 15. Сравнение результатов исследования вагинальных образцов на наличие воспалительной реакции с использованием микроскопического метода и теста ИммуноКвантэкс ИВ≥50 (есть воспаление) 5 14 1 4 2 ИВ<50 (нет воспаления) 0 0 0 0 0 ИВ≥50 (есть воспаление) 1 0 0 0 0 ИВ<50 (нет воспаления) 1 0 0 0 0 Без вагинальных инфекций 0 0 2 20 Всего Примечание: ПМЯЛ/ЭК – отношение числа полиморфноядерных лейкоцитов к числу эпителиальных клеток, определенное с применением микроскопического метода; ИВ – индекс воспаления, определенный с применением ОТ-ПЦР (тест ИммуноКвантэкс); АВ – аэробный вагинит, БВ – бактериальный вагиноз, КВВ – кандидозный вульвовагинит 0 21 Сравнительный анализ показал, что все 26 проб, в которых выявлены признаки воспаления микроскопическим методом, были положительны на наличие воспаления при использовании метода ОТ-ПЦР (ИВ≥50). Из 24 проб, в которых микроскопическим методом воспалительная реакция влагалища не была установлена, в 21 пробе также не было выявлено воспаление методом ОТ-ПЦР (ИВ<50), но в 3 пробах по данным ОТ-ПЦР воспалительная реакция имела место (ИВ≥50). Таким образом, на основании сравнительного анализа, мы рассчитали параметры чувствительности специфичности нового теста для оценки воспалительной реакции влагалища методом ОТ-ПЦР в реальном времени. Чувствительность и специфичность нового теста ИммуноКвантэкс относительно микроскопического метода при оценке локальной воспалительной реакции во влагалище составили 100% и 87,5%, соответственно. Прогностическая значимость положительного результата составила 89,7%, прогностическая значимость отрицательного результата – 100%. При рассмотрении диагностических параметров теста ОТ- ПЦР для оценки воспаления при аэробном вагините оказалось, что параметры чувствительности, специфичности и прогностической значимости равны 100%. Таким образом, тест ИммуноКвантэкс для оценки локальной воспалительной реакции слизистой влагалища является объективным методом диагностики, позволяющим выявить наличие воспаления у женщин с вагинальными инфекциями. Его чувствительность составила 100%, специфичность - 87,5%. Для аэробного вагинита эти параметры равны 100%. 3.7. Дифференциальная экспрессия генов маркеров локального иммунного ответа у женщин с различными вагинальными инфекциями В данной части исследования мы оценили экспрессию генов маркеров локального иммунного ответа, специфичных для каждой вагинальной инфекции. Для этого отобрали 52 женщины, которых разделили на 4 группы: АВ – 14 женщин, БВ - 9, КВВ – 7 и контрольная группа – 22. Мы выявили значительные различия между профилями транскрипции генов IL1b, IL10, IL18, TNFa, TLR4, GATA3, CD68 в группах пациенток, у которых диагностировали исключительно AВ, БВ или КВВ по сравнению с пациентками контрольной группы (рис. 10). Рис. 10. Уровни мРНК (log-трансформированное количество копий на 1 мл) отдельных генов компонентов местного иммунного ответа во влагалище женщин с аэробным вагинитом, бактериальным вагинозом и кандидозным вульвовагинитом по сравнению с контрольной группой; маркеры с ограниченными линиями обозначают медианы с межквартильными интервалами; * - значение р <0,05, ** - значение р <0,01, *** - значение р <0,001 Уровни мРНК IL1b и IL10 были значительно выше в образцах, полученных от женщин с АВ и КВВ, чем в контрольной группе. Что касается проб от женщин с БВ, уровни экспрессии мРНК этих двух интерлейкинов были повышены по сравнению с пробами женщин контрольной группы, но для IL1b разница не достигла статистической значимости. Уровни мРНК IL18 были значительно ниже у женщин с БВ по сравнению с контрольной группой, тогда как при сравнении образцов от женщин с AВ или КВВ различий не наблюдалось. Уровни экспрессии мРНК TNFa и CD68 были значительно выше в клетках эпителия влагалища женщин с АВ и КВВ, и никаких различий не наблюдалось для женщин с БВ. Экспрессия гена GATA3 была значительно выше у женщин с ВВК. Для определения уровня экспрессии генов маркеров локального иммунного ответа при наличии или отсутствии воспалительной реакции, выявленной микроскопическим методом, всех пациенток разделили на две группы: воспаление было выявлено у 56 женщин, у 75 – воспаление отсутствовало. Уровни экспрессии мРНК IL1b, IL10, TNFa и TLR4 были значительно выше у женщин с повышенным содержанием лейкоцитов, чем у женщин без микроскопических признаков воспаления (рис. 11). Рис. 11. Уровни мРНК (log-трансформированное количество копий на 1 мл) некоторых генов маркеров местного иммунного ответа во влагалище женщин с соотношением числа полиморфноядерных лейкоцитов к числу эпителиальных клеток, определенное с применением микроскопического метода ПМЯЛ/ЭК ≥1, указывающее на наличие воспаления, по отношению к женщинам с ПМЯЛ/ЭК <1, свидетельствующее об отсутствии воспаления; * - значение р <0,05, ** - значение р <0,01, *** - значение р <0,001 Используя ROC-анализ, мы смогли выявить способность выбранных иммунных маркеров различать все положительные случаи каждой инфекции (включая случаи, когда данная инфекция сочеталась с другими инфекциями), а также случаи повышенного содержания лейкоцитов. Группу, положительную по АВ, составили 20 женщин, отрицательную - 111. Соответствующие показатели для БВ были 16 и 105 (10 женщин с промежуточной микрофлорой не были включены), для КВВ- 10 и 121, для повышенного количества лейкоцитов - 56 и 75 (табл. 16). Таблица 16. Классифицирующая способность отдельных маркеров местного иммунного ответа при аэробном вагините (АВ), бактериальном вагинозе (БВ), кандидозном вульвовагините (КВВ) и физиологическим микробиоценозом с повышенным количеством лейкоцитов по результатам ROC- анализа Площадь под кривой (индекс Юдена; оптимальный порог) Иммунологи- ческие маркеры IL1b 0.749 (0.423; >4.9) IL10 0.777 (0.440; >1.6)
IL18 0.679 (0.313; ≤3.7) TNFa 0.689 (0.385; >2.9) TLR4 0.733 (0.398; >2.7) GATA3 НЗ
АВ
БВ
НЗ НЗ
0.838 (0.583; ≤2.8) НЗ
НЗ
0.783 (0.526; ≤2.3) НЗ
КВВ
0.788 (0.489; >5.3) НЗ
НЗ
НЗ
0.717 (0.388; >2)
НЗ
Повышенное кол- во лейкоцитов
0.779 (0.466; >5) 0.678 (0.296; >2.2)
НЗ
0.695 (0.291; >3.2) 0.754 (0.444; >2.3) НЗ
CD68 НЗ
НЗ
НЗ
Примечание: НЗ (не значима) (площадь под ROC-кривой существенно не отличалась от
0,5, то есть классифицирующая способность отсутствовала); АВ – аэробный вагинит, БВ – бактериальный вагиноз, КВВ – кандидозный вульвовагинит
Как видно из данных, приведенных в таблице 16, самыми явными предикторами АВ были повышенные уровни мРНК IL1b, IL10 и TLR4. БВ был тесно связан со снижением уровней мРНК IL18 и GATA3. Повышенные
уровни мРНК IL1b и TLR4 показали выраженную классифицирующую способность в отношении КВВ и повышенного количества лейкоцитов.
3.8. Корреляция между различными видами лактобацилл и генами маркеров локального иммунного ответа
Учитывая ассоциацию разных видов лактобацилл c различными состояниями микробиоценоза влагалища и способность лактофлоры модулировать иммунный ответ слизистой, была проанализирована зависимость транскрипционного профиля генов врожденного иммунитета от вида лактобацилл. В данное исследование мы включили основные доминирующие виды лактобацилл L. crispatus, L. iners, L. jensenii и L. gasseri (табл. 17).
Таблица 17.
Корреляция между различными видами лактобацилл и генами маркеров локального иммунного ответа
95% ДИ
Нижняя граница
Верхняя граница
Сравниваемые параметры L.crispatus и IL 1B L.crispatus и IL 10 L.crispatus и IL 18 L.crispatus и TNFA L.crispatus и TLR4 L.crispatus и GATA3 L.crispatus и CD68
Коэффициент Спирмена
Значение
р
0,7512 0,4315 0,0027 0,5012 0,8417 0,0070 0,0085
-0,028 -0,205 0,150 -0,070 -0,245 0,109 0,260 0,087 0,417 0,059 -0,118 0,233 -0,018 -0,194 0,159 0,235 0,061 0,395 0,229 0,055 0,390

Сравниваемые параметры L.iners и IL 1B
L.iners и IL 10 L.iners и IL 18 L.iners и TNFA L.iners и TLR4 L.iners и GATA3 L.iners и CD68 L.jensenii и IL 1B L.jensenii и IL 10 L.jensenii и IL 18 L.jensenii и TNFA L.jensenii и TLR4 L.jensenii и GATA3 L.jensenii и CD68 L.gasseri и IL 1B L.gasseri и IL 10 L.gasseri и IL 18 L.gasseri и TNFA L.gasseri и TLR4 L.gasseri и GATA3 L.gasseri и CD68
Продолжение таблицы 17 Коэффициент 95% ДИ Значение
Нижняя граница
Верхняя граница
Спирмена
0,074 -0,105 0,248 0,060 -0,120 0,235 0,108 -0,070 0,279 0,031 -0,147 0,206 0,132 -0,046 0,301 0,093 -0,085 0,265 0,111 -0,067 0,282 0,081 -0,098 0,255 0,091 -0,088 0,265 0,070 -0,107 0,244 0,052 -0,126 0,226 0,067 -0,111 0,240 0,072 -0,106 0,245 0,114 -0,064 0,285 0,140 -0,039 0,310 0,016 -0,162 0,194 0,035 -0,142 0,211 0,063 -0,114 0,237 0,004 -0,173 0,180 -0,007 -0,183 0,170 -0,008 -0,184 0,169
р
0,4059 0,5028 0,2191 0,7283 0,1341 0,2902 0,2089 0,3618 0,3038 0,4244 0,5558 0,4488 0,4163 0,1940 0,1134 0,8528 0,6875 0,4726 0,9682 0,9358 0,9312

При анализе данных было установлено, что в образцах с доминированием L. crispatus уровни экспрессии мРНК генов IL18, GATA3 и CD68 были повышены. Корреляции между другими видами лактобацилл и генами маркеров локального иммунного ответа не наблюдалось.
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Тело человека колонизировано огромным количеством микроорганизмов, все вместе они составляют человеческий микробиом [65]. Известно, что микробиом влияет на многие важнейшие процессы в организме хозяина. Генитальный тракт женщин населяет множество микроорганизмов, формирующих микробиоту влагалища. Слизистая влагалища является входными воротами для возбудителей урогенитальных инфекций. Поэтому микробиота влагалища признается в качестве важного фактора защиты от различных бактериальных, вирусных и грибковых патогенов. Нормальная микрофлора женских половых путей чрезвычайно разнообразна и представлена аэробами, факультативными и строгими анаэробами. У большинства здоровых женщин детородного возраста, как правило, преобладают бактерии рода Lactobacillus spp. Именно они обеспечивают высокий уровень противомикробной защиты [13]. При этом разные виды лактобацилл различаются по своим протективным способностям [28, 82].
Помимо биологических свойств лактобацилл, обеспечивающих защиту вагинального биотопа от патогенов, важным является их иммуномодулирующая способность в отношении цервико-вагинального эпителия. Под воздействием внешних стимулов эпителиальные клетки могут высвобождать многочисленные антимикробные пептиды и цитокины, функция которых заключается в привлечении фагоцитарных клеток, поглощающих микробные патогены. Таким образом, в сохранении вагинального гомеостаза задействованы как микробиологический, так и иммунный компоненты [31].
Множество исследований показывают, что у женщин с дисбиозом влагалища существенно повышены риски инфицирования ИППП, возникновения эндометрита, бесплодия, невынашивания беременности, преждевременных родов и осложнений послеродового периода [35, 51, 97, 104, 113]. Исследователи всего мира пытаются установить причины развития
дисбиотических состояний влагалища. Изучено много факторов, приводящих к развитию дисбиоза, однако точные причины до сих пор не названы [35, 80]. Данное обстоятельство диктует необходимость дальнейшего изучения этиопатогенеза развития дисбиозов и выявления основных предикторов истощения лактобациллярной микрофлоры и размножения УПМ.
В данном исследовании мы предприняли попытку изучить возможность использования профиля лактобациллярной микрофлоры и уровней транскриптов некоторых генов врожденного иммунитета слизистой влагалища в качестве дополнительных тестов для дифференциальной диагностики вагинальных инфекций. Нашей задачей было оценить избирательную способность различных генов врожденного иммунитета в отношении АВ, БВ, КВВ вместе с молекулярным анализом соответствующей лактобациллярной микрофлоры, чтобы выявить определенные комбинации иммунных и микробиологических маркеров, как предикторов вагинальных инфекций.
Основной интерес для нас представляли женщины, предъявляющие какие-либо жалобы. Чаще всего пациенток беспокоили влагалищные выделения. По данным Международного союза по борьбе с инфекциями, передаваемыми половым путем (IUSTI) и Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) существует четыре основных патологических состояния, которые ассоциированы с влагалищными выделениями: БВ, АВ, КВВ и ИППП [104].
Данные осмотра и микроскопическое исследование отделяемого влагалища являются основными, а зачастую и единственными, методами диагностики БВ, АВ и КВВ. Так в условиях женских консультаций, диагноз «бактериальный вагиноз», поставленный на основании жалоб и данных осмотра, лишь в трети случаев был подтвержден с помощью лабораторных методов исследования [24]. Диагностические критерии Нуджента и Дондерса, широко применяемые в мире и считающиеся «золотым

стандартом» диагностики БВ и АВ, в нашей стране практически не используются.
В настоящее время молекулярно-биологические методы широко распространены в диагностике нарушений микробиоты, и дополняют «классические» лабораторные методы, такие как культуральное и микроскопическое исследования [105]. ПЦР имеет ряд преимуществ по сравнению с рутинными микробиологическими исследованиями: позволяет идентифицировать широкий спектр микроорганизмов, включая трудно культивируемые и анаэробные бактерии, вирусы, простейшие, а также дает возможность определить количество и соотношение микроорганизмов в общей бактериальной массе. УПМ являются представителями нормальной микрофлоры урогенитального тракта, поэтому обнаружение отдельных представителей условно патогенной микрофлоры еще не свидетельствует о наличии инфекции, важным является определение их доли в ОБМ и относительно лактофлоры [22].
Основной задачей нашего исследования было изучение видового состава вагинальных лактобацилл с помощью тест-системы для ПЦР в реальном времени «Типирование лактобактерий» (ООО «НПО ДНК- Технология», Москва, Россия). Предварительно мы провели валидацию данного теста с использованием штаммов разных видов лактобацилл и других микроорганизмов, полученных при культуральном исследовании отделяемого влагалища и идентифицированных методом масс- спектрометрии. Аналитическая чувствительность и специфичность теста составили 100%. С помощью данного теста были правильно дифференцированы основные виды лактобацилл и отсутствовали положительные результаты с изолятами не относящимися к роду Lactobacillus spp.
Далее мы сравнили культуральный метод и МАНК для выделения и идентификации лактобацилл. Учитывая разную диагностическую способность данных методов исследования, мы не оценивали параметры

чувствительности и специфичности культурального метода относительно ПЦР. Метод ПЦР позволяет выявлять даже незначительные количества лактобацилл, которые невозможно выделить культуральным методом, особенно в образцах с несколькими видами лактобацилл. Результаты видовой идентификации лактобацилл нельзя равноценно сравнивать, так как для ПЦР типирования мы использовали исключительно праймеры 7 наиболее распространенных видов вагинальных лактобацилл, а масс- спектрометрическое определение выделенных штаммов позволило нам выявить и другие виды лактобацилл в составе микробиоты влагалища (L. curvatus, L. fermentum, L. rhamnous, L. plantarum). Основное несовпадение результатов обнаружения видов лактобацилл методом количественной ПЦР и культуральным методом состояло в том, что только методом ПЦР удалось установить лидирующее место в исследуемой популяции вида L. iners среди видового разнообразия вагинальных лактобацилл.
L. iners является труднокультивируемым микроорганизмом. Впервые культуру L. iners удалось получить лишь 20 лет назад [55]. От здоровых женщин были получены 7 штаммов. На кровяном агаре после 24 часов инкубации в анаэробных условиях получили маленькие гладкие непигментированные колонии. При микроскопии бактерии были описаны, как грамположительные палочкообразные клетки, расположенные попарно или в коротких цепочках. В другом исследовании указали на грамвариабельность полученных культур L. iners, которые представляли собой коккобациллы [46]. Также имеются свидетельства о различии в морфологии в условиях in vivo и in vitro [73]. Такая неоднозначность морфологии и вариабельность при окраске по Граму имеет большое значение при микроскопии вагинального отделяемого с целью оценки состояния микробиоценоза. Так при оценке по методу Нуджента [86], такой морфотип лактобацилл может быть ошибочно отнесен к морфотипу Gardnerella, что может существенно исказить результат исследования.

Полученные нами результаты показали, что из 223 обследованных женщин у большинства (93,3%) в вагинальном биотопе присутствуют лактобациллы. Доминирование лактофлоры обусловлено высоким содержанием уровня эстрогенов у женщин детородного возраста. Именно в период репродуктивной активности женский организм нуждается в дополнительной защите. У девочек в препубертатном возрасте и у женщин в постменопаузе лактобациллы не являются доминирующим видом вагинального биотопа [13].
У трети обследованных нами пациенток были выявлены вагинальные инфекции, как отдельно, так и в смешанных формах. Общая частота встречаемости БВ составила –16,1%, АВ -15,2%, КВВ – 10,3%. ИППП были обнаружены у двух пациенток (0,9%): у одной гонорея, у другой хламидийная инфекция.
Учитывая данные о различной протективной способности лактобацилл и о том, что доминирующий вид лактобацилл может влиять на стабильность микробиоценоза, мы изучили состав лактофлоры. Молекулярные исследования выявили, что наиболее часто в исследуемой популяции обнаруживались виды L. iners, L. crispatus, L. jensenii, L. vaginalis и L. gasseri. Полученные результаты соответствуют данным большинства исследований, проведенным как зарубежом, так и в нашей стране [5, 8, 14, 28, 33, 34, 68, 69, 91, 96, 98, 108, 117, 130].
Самыми распространенными в нашей популяции стали виды L. iners и L. crispatus. Общая частота встречаемости L. iners составила 62%, при этом более чем в половине образцов (51%) в качестве доминирующего вида. Общая распространенность L. crispatus составила 47% и в качестве доминирующего в 24% проб. В нашем исследовании даже в группе женщин с физиологическим микробиоценозом L. crispatus уступил место L. iners. Полученный нами результат согласуется с данными других исследований о преобладании в биотопе здоровых женщин видов L. iners и L. crispatus. [49, 74, 96, 110].
Лидерство L. iners и L. crispatus в вагинальной микробиоте вызывает интерес многих исследователей, пытающихся изучить влияние этих видов лактобацилл на женский организм. Так в одном исследовании определили различия в свойствах эпителиальных клеток влагалища и в составе вагинальных выделений, при доминировании L. crispatus и L. iners во влагалище 157 беременных женщин в первом триместре беременности. При доминировании L. crispatus эпителиальные клетки демонстрировали более высокий уровень аутофагии (механизм клеточной адаптации к широкому спектру неблагоприятных условий, продлевающий жизнь клетки), меньшую индукцию связанного со стрессом белка теплового шока hsp70 и высвобождали более низкий уровень медиаторов воспаления [74]. Это исследование еще раз доказывает, что преобладание в вагинальном биотопе L. crispatus является маркером стабильности физиологического микробиоценоза влагалища.
Вид L. iners стал самым часто встречающимся в нашем исследовании, но учитывая, что основная масса обследованных пациенток предъявляли жалобы на выделения, то такое преобладание L. iners вполне ожидаемо. Известно, что L. iners обладает сниженным протективным действием, в сравнении с другими видами лактобацилл, и широко распространен при различных состояниях микробиоценоза, соседствуя с разнообразными микробными сообществами [59]. L. iners не продуцирует перекись водорода и способен существовать как самостоятельно, так сосуществовать с перекись продуцирующими видами L. crispatus и L. jensenii в условиях низких значений рН вагинальной среды при нормоценозе. Уникальна способность L. iners сохраняться при высоких значениях рН, часто оставаясь единственным видом лактобацилл в условиях выраженного дисбиоза. Такие механизмы устойчивости и адаптации к воздействиям факторов окружающей среды, вероятно, могут иметь важное значение в восстановлении лактобациллярной микрофлоры, но не могут гарантировать стабильность микробиоценоза [93].
В нашем исследовании у пациенток с ИППП вид L. iners был доминирующим, а у женщины с гонореей – единственным видом в микробиоценозе. По характеристике микробиоценоза с учетом микроскопических критериев Нуджента и Дондерса, данные пациентки были отнесены к группе со смешанными инфекциями, так как имели признаки БВ и АВ. Это соответствует многочисленным данным о повышенном риске инфицирования ИППП у женщин с дисбиозом влагалища [35, 37, 38, 60, 61, 62, 81, 113, 121].
Вид L. crispatus не являлся самым часто встречающимся видом в группе женщин с физиологическим микробиоценозом влагалища, но его содержание в группе здоровых женщин было достоверно выше, чем у женщин с БВ и АВ (p<0,0001). Именно L. crispatus в большинстве исследований ассоциируется с физиологическим микробиоценозом влагалища и является показателем стабильности вагинального микробиома [28, 54, 67, 90, 112]. В некоторых исследованиях показано, что L. crispatus способен ингибировать рост Candida albicans [67], что соответствует нашим данным о низкой встречаемости L. crispatus при КВВ. Реже всего L. crispatus встречался при дисбиозах, обусловленных истощением лактобациллярной флоры – АВ, БВ и в группе смешанных инфекций и ни разу не был доминирующим видом у женщин с БВ и смешанными инфекциями. БВ считается самым распространенным заболеванием влагалища женщин репродуктивного возраста и множество исследований посвящено изучению этого состояния [26, 32, 35, 41, 43, 45, 51, 71, 86, 89, 92, 100, 110, 125, 126]. Gardnerella vaginalis является основным микроорганизмом, присутствующим более чем в 95% всех случаев БВ. Наиболее важный фактор вирулентности G. vaginalis - выработка вагинолизина, токсина, который повреждает вагинальный эпителий и приводит к его усиленной десквамации [29]. Присутствие L. crispatus в вагинальном биотопе способно уменьшать повреждающее действие G. vaginalis. В опыте на среде, имитирующующей секрецию половых путей, было показано, что предварительное прикрепление L. crispatus к эпителиальным клеткам Hela снижает цитотоксичность, вызванную вагинолизином G. vaginalis. Этот эффект был специфичен только для L. crispatus, поскольку другие факультативно анаэробные микроорганизмы влагалища не оказывали защитного действия [41]. Важнейшим механизмом защиты лактобацилл является способность создания низкого окислительно-восстановительного потенциала среды влагалища за счет продукции молочной кислоты и перекиси водорода. Полученные нами результаты измерения рН отделяемого влагалища согласуются с данными, описанными в ряде исследований о том, что физиологический микробиоценоз с преобладанием L. crispatus коррелирует с более низким уровнем рН вагинального отделяемого [28, 35, 54, 96, 115]. Выраженность защитных свойств, способность модулировать иммунный ответ и снижать воспалительную реакцию слизистой, делают вид L. crispatus самым надежным компонентом поддержания здоровья вагинального биотопа [123]. Оценив лактобациллярный профиль в образцах от женщин с вагинальными инфекциями, мы определили, что самым часто встречающимся видом при БВ и АВ был вид L. iners, а виды L. crispatus, L. jensenii и L. vaginalis встречались довольно редко. При КВВ, в отличие от БВ и АВ, нет дефицита лактобациллярной микрофлоры, но по встречаемости L. iners и L. crispatus отмечена такая же тенденция. Вид L. vaginalis при КВВ встречается также часто, как и L. iners. В полученных нами результатах обращает на себя внимание высокая частота встречаемости вида L. vaginalis, хотя его концентрация в образцах была небольшой и лишь в одном образце L. vaginalis являлся доминирующим видом. При культуральном исследовании штамм L. vaginalis удалось выделить один раз, что может быть связано с его низким содержанием в образцах, либо с бактериальной интерференцией, возникающей в процессе конкуренции с другими лактобациллами за пищевые ресурсы при культивировании на питательной среде. Несмотря на то, что в нашем исследовании L. vaginalis относится к часто встречающимся видам, его концентрация незначительна, поэтому роль этого вида в поддержании постоянства микробиоценоза влагалища не ясна. Но существуют данные об обнаружении этого вида преимущественно у здоровых женщин [33, 68, 97, 108]. Так и в нашем исследовании L. vaginalis, как и L. crispatus, реже всего встречался при БВ и АВ. Вид L. gasseri чаще выявлялся у женщин с вагинальными инфекциями, чем в группе здоровых женщин, а самая большая его распространенность отмечалась в группе женщин с АВ. По данным литературы L. gasseri, как и L. iners, имеет сравнительно небольшой геном и лишь часть штаммов L. gasseri способны продуцировать перекись водорода [130]. Это может свидетельствовать о более низкой способности вида L. gasseri к поддержанию стабильности микробиоценоза влагалища. Подтверждается это и данными исследования, где виды L. gasseri и L. iners чаще определялись у женщин с промежуточным типом микробиоценоза или с дисбиозом [46], а изучение микробиоценоза беременных в первом и третьем триместрах показало, что при доминировании L. iners и L. gasseri состояние микробиоценоза наименее стабильно [124]. Использование молекулярных методик позволило определить, что влагалище одной женщины колонизируют от 1 до 6 видов лактобацилл одновременно. При этом число видов лактобацилл зависит от состояния микробиоценоза. При БВ и АВ, видовое разнообразие встречается гораздо реже, чем при КВВ и физиологическом микробиоценозе. В нашем исследовании при КВВ все образцы содержали 2 и более видов лактобацилл. Это может быть обусловлено тем, что при КВВ значения рН вагинальной среды такие же низкие, как и у здоровых женщин (рис.6). Успешная колонизация кислой влагалищной ниши C. albicans и C. glabrata зависит от их способности проявлять толерантность к уксусной и молочной кислотам, продуцируемых комменсальной микробиотой [75]. При БВ видовое разнообразие лактобацилл наблюдалось лишь в трети образцов. БВ характеризуется постоянно повышенным уровнем pH и увеличенным числом отслоившихся эпителиальных клеток. Высокие значения рН и апоптоз поврежденного вагинального эпителия не способствуют сохранению лактобацилл [100]. В образцах с несколькими видами лактобацилл доминирующим является один, реже 2 вида. В нашем исследовании чаще всего доминировали виды L. iners, L. crispatus и L. gasseri. В случаях доминирования двух видов, чаще это были виды - L. iners и L. crispatus или L. iners и L. gasseri. Такое сочетание лактобацилл может быть обусловлено высокой способностью вида L. iners адаптироваться к среде обитания [110]. Обнаружение двух доминирующих видов может быть переходным этапом, когда под воздействием каких-либо условий происходит смена доминирующего вида. Учитывая адаптивные способности L. iners и протективный потенциал L. crispatus, сочетание этих видов в микробиоценозе вероятно можно рассматривать, как дополнительный маркер стабильности вагинального биотопа. К особенностям нормальной микрофлоры влагалища относят многообразие ее видового состава. Учитывая этот факт, мы изучили корреляцию видов лактобацилл как между собой, так и с другими представителями вагинального биотопа. Значительная положительная корреляция наблюдалась между некоторыми видами лактобацилл: L. crispatus и L. vaginalis, L. iners и L. vaginalis, L. jensenii и L. vaginalis, L. iners и L. jensenii. Таким образом, вид L. vaginalis, который встречается часто, но в незначительных количествах, способен комфортно сосуществовать с основными видами лактобацилл. Являясь видом, продуцирующим перекись водорода и молочную кислоту, L. vaginalis в ассоциации с другими видами лактобацилл поддерживает оптимальные условия для колонизации вагинального биотопа лактофлорой [90]. Также выявлена корреляция между видами L. iners и L. jensenii. В нашей популяции вид L. jensenii встречался реже всех основных видов. Его самая большая распространенность отмечалась в группе смешанных инфекций, а самая низкая среди здоровых женщин. Недавно было отмечено, что преобладание вида L. jensenii, который производит преимущественно D-молочную кислоту и обладает меньшей защитной способностью по сравнению с L. crispatus, было связано с уменьшением концентрации молочной кислоты во влагалище и повышенным риском преждевременных родов [28]. Учитывая сниженные протективные способности L. iners и способность продуцировать только L-молочную кислоту, такая ассоциация с L. jensenii вполне объяснима. Отрицательная корреляция была отмечена между видами, которые чаще всего являются доминирующими - L. crispatus и L. gasseri, L. iners и L. gasseri, L. crispatus и L. iners [49, 110]. Это может объясняться их способностью к интерференции других видов лактобацилл. По данным литературы, при доминировании L. gasseri среда влагалища становится менее кислой (рН=5,0±0,7), чем при доминировании L. crispatus (рН=4,0±0,3) и L. iners (рН=4,4±0,6) [96], что вероятно создает не самые комфортные условия для сосуществования этих видов. Оценивая ассоциацию лактобацилл с другими представителями вагинального биотопа, мы выявили значительную отрицательную корреляцию между L. crispatus и кластером Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp. (р < 0,0001). Наш результат сопоставим с данными исследований, подтверждающих, что L. crispatus обладает способностью ингибировать рост G. vaginalis [37, 41, 46]. Также выявлена отрицательная корреляция между L. jensenii и M. hominis. M. hominis относится к микроорганизмам ассоциированным с БВ. Частота встречаемости M. hominis при БВ (74,6%) значительно выше, чем при нормоценозе (46,8%) [10]. M. hominis, как и другие микоплазмы, относится к классу Mollicutes, которые являются облигатными паразитами эукариотов, у них отсутствует клеточная стенка, они имеют чрезвычайно маленький размер генома и нуждаются в холестерине. Такая особенность строения делает их более чувствительными к условиям существования при низких значениях рН, создаваемых L. jensenii. Изучение ассоциации УПМ между собой выявило выраженную положительную корреляцию между Ureaplasma spp. и кластером Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp. (р < 0,0001). Ureaplasma spp. как и M. hominis, относится к классу Mollicutes, и является БВ-ассоциированным микроорганизмом. Считается, что Ureaplasma spp. может ускорять симптомы и патогенез БВ за счет своей способности проявлять гемолитическую активность и секретировать ферменты, в том числе эластазу и протеазу IgA, которые снижают иммунитет слизистой оболочки, а также фосфолипазу С и уреазу, которые гидролизуют мочевину до цитотоксического аммиака [26]. Изменения состава микробиоты влагалища, сопровождающиеся нарушением баланса микрофлоры с уменьшением количества лактобацилл и чрезмерным размножением УПМ, вызывают реакцию со стороны эпителиальных клеток влагалища и клеток иммунной системы, что приводит к изменению профиля экспрессируемых цитокинов. Иммунная реакция организма является определяющим фактором в развитии инфекционного процесса. Оценка воспалительной реакции влагалища происходит на основании данных гинекологического осмотра и традиционного подсчета числа лейкоцитов при микроскопии вагинального соскоба. Чаще всего наличие воспалительной реакции констатируют при выявлении более 10 лейкоцитов в поле зрения при микроскопии вагинального отделяемого у небеременных женщин и более 20 лейкоцитов в поле зрения у беременных женщин [1, 129]. Однако необходимо учитывать ряд факторов, от которых количество лейкоцитов, видимых в окрашенном препарате, может значительно варьировать: это техника взятия биоматериала, нанесение его на стекло и проведение окрашивания препарата. Так же стоит помнить об отсутствии четких критериев норм содержания лейкоцитов в вагинальном отделяемом и изменении их количества в зависимости от дня менструального цикла женщины. В настоящее время предлагаются альтернативные методы выявления воспалительной реакции. Так тест ИммуноКвантэкс (ООО «НПО ДНК-Технология», Москва, Россия), основанный на количественной обратно-транскриптазной ПЦР в режиме реального времени, позволяет идентифицировать локальную воспалительную реакцию по интегральной оценке транскрипционных профилей генов маркеров иммунного ответа в отделяемом влагалища [3]. Для валидации данного теста показатели индекса воспаления ИммуноКвантэкса мы сравнили с результатами микроскопического метода у 50 женщин, разделив их на 2 группы по микроскопическим признакам воспаления. В исследование вошли пациентки с АВ, КВВ и смешанными инфекциями, имеющие микроскопические признаки воспаления и женщины контрольной группы без воспалительной реакции. Чувствительность и специфичность нового теста ИммуноКвантэкс относительно микроскопического метода при оценке локальной воспалительной реакции во влагалище составили 100% и 87,5%, соответственно. Для 131 пациентки мы провели исследование по изучению профиля экспрессии генов цитокинов слизистой оболочки влагалища и определения ИВ с использованием теста на основе ОТ-ПЦР. При анализе проб от женщин с КВВ и АВ - вагинальными инфекциями, сопровождающимися выраженной воспалительной реакцией, наблюдалось совпадение результатов обоих методов, которые указывали на наличие воспаления во влагалище: повышенное количество лейкоцитов при микроскопии и показатель индекса воспаления (≥50), соответствующего картине локального воспаления при постановке теста ИммуноКвантэкс. Воспалительная реакция при AB связана с увеличением в составе микрофлоры аэробных микроорганизмов, таких как Enterobacteriaceae spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp. Полагают, что аэробные микроорганизмы способны вызвать воспалительную реакцию при сравнительно умеренном их количестве 105 КОЕ/мл [71]. Грибы рода Candida spp. также являются аэробами и вызывают как самостоятельную инфекцию КВВ, так и сочетаться с БВ и АВ. При кандидозе характер иммунного ответа может варьировать от толерантности цитокинов к антигенам кандид до резко выраженной воспалительной реакции [4]. Расхождение результатов ИммуноКвантэкса и микроскопии были получены при тестировании биоматериала от женщин, у которых был обнаружен БВ: 7 из 9 проб микроскопическим методом были отрицательны на наличие воспаления, а методом ОТ-ПЦР - положительны. Полученные нами данные микроскопического исследования подтверждают мнение большинства исследователей о том, что БВ - это невоспалительный синдром. БВ характеризуется резким снижением или полным отсутствием лактобацилл и их заменой на полимикробные ассоциации анаэробов, таких как Gargenerella vaginalis, Atopobium vaginae, Mobiluncus spp., Bacteroides spp., Fusobacterium spp., Prevotella spp., Prophyromanas spp., Peptostreptococcus spp. и другие [13, 110]. Основным клиническим проявлением БВ являются специфические, гомогенные с неприятным запахом, выделения из влагалища. При осмотре пациенток с БВ не отмечается воспаления слизистой вульвы и влагалища. В половине случаев заболевание протекает бессимптомно. Полагают, что анаэробные бактерии, ассоциированные с БВ, выделяют вещества, ингибирующие миграцию нейтрофилов во влагалище [84]. Так, G. vaginalis может продуцировать гемолизин, способный разрушать лейкоциты, а сиалидазы, продуцируемые G. vaginalis и некоторыми другими анаэробами, ингибируют фагоцитоз. Эпителиальные клетки и лежащие в их основе антиген-презентирующие клетки отвечают на избыток анаэробов, например, на Prevotella spp., Mobiluncus spp. и Sneathia spp., продуцируя провоспалительные цитокины, включая IL1α, IL1β и TNFα [30]. Это объясняет отсутствие повышенного количества лейкоцитов в вагинальном мазке, при выявлении воспалительного профиля генов цитокинов. Далее, при оценке проб от женщин без вагинальных инфекций, но с наличием жалоб, мы также получили существенные расхождения результатов на наличие воспалительной реакции: 25,9% проб положительных при микроскопическом исследовании, были отрицательны при тестировании методом ОТ-ПЦР, и 40% проб отрицательных при микроскопии, были положительны при определении транскрипционного профиля генов компонентов иммунного ответа. Большинство (85,7%) обратившихся женщин предъявляли жалобы на выделения, и при осмотре у 62,3% пациенток эти жалобы были подтверждены. Образцы с повышенным количеством лейкоцитов, определенные микроскопически и не подтвержденные методом ОТ-ПЦР, как наличие воспаления, могли быть получены от женщин в период менструального цикла, когда повышение числа лейкоцитов является физиологическим и не связано с наличием воспалительной реакции [20]. Также положительный результат при микроскопии, не подтвержденный ОТ-ПЦР, может свидетельствовать о том, что воспалительная лейкоцитарная реакция во влагалище, вероятно, соответствует профилю экспрессии генов цитокинов, не вошедших в состав тест-системы, (например, IL6 или IL8) и объясняется ограниченными возможностями данного диагностического теста [23]. Изменения профиля цитокинов, указывающих на наличие воспаления при отсутствии лейкоцитарной реакции в образце, могут быть связаны с тем, что изменения в транскрипции генов цитокинов, опережают появление нейтрофилов и является отличительным признаком ранней стадии воспаления [36]. Или иммунная реакция сопровождается повышением уровня IL10, который является противовоспалительным цитокином и ингибирует воспаление, определяя иммунопатогенез заболевания. При этом тест ОТ-ПЦР, позволяющий определять мРНК генов цитокинов, свидетельствует о более высокой информативности молекулярно-биологического метода. Также нужно учитывать, что у части пациенток с физиологическим микробиоценозом тестом ФемофлорСкрин были выявлены Mycoplasma spp. или Ureaplasma spp. в небольшом количестве (102,0-104,0). По мнению некоторых авторов, микоплазмы и уреаплазмы считаются комменсальными бактериями и являются маловирулентными [79], но все-таки способны инициировать неблагоприятные воспалительные реакции в зависимости от микробной нагрузки, продолжительности воздействия, полимикробной ассоциации и общего состояния иммунной системы женщины [58]. Толл-подобные рецепторы, расположенные на поверхности макрофагов, дендритных и других клетках врожденного иммунитета, при контакте с патогенными микроорганизмами активируют синтез ряда провоспалительных цитокинов [13, 40]. Мы провели объективную диагностику воспалительного процесса на основе интегральной оценки экспрессии мРНК генов врожденного иммунитета (IL1b, IL10, IL18, TNFa, TLR4, GATA3, CD68), чтобы выяснить могут ли данные маркеры быть использованы как дополнительные инструменты для дифференциального определения патологических состояний влагалища, вызванных условно патогенной микрофлорой, а именно АВ, БВ и КВВ. Соответственно, наша основная задача заключалась в оценке избирательных способностей различных иммунных генов в отношении АВ, БВ, КВВ, а не в анализе профилей экспрессии генов маркеров иммунного ответа и их роли в мукозальном иммунитете при различных вагинальных инфекциях. Были выявлены значительные различия в экспрессии генов маркеров иммунного ответа во влагалище женщин с различными вагинальными инфекциями по сравнению с женщинами контрольной группы. Особенно характерно это было для генов IL1b, IL10 и TLR4 при воспалительных инфекциях - АВ и КВВ. В то же время для БВ было отмечено значительное снижение экспрессии мРНК IL18. В ROC-анализе мы подтвердили, что наиболее явными предикторами АВ были повышенные уровни мРНК IL1b, IL10 и TLR4; КВВ – повышенные уровни мРНК IL1b и TLR4, БВ – сниженные уровни мРНК IL18 и GATA3. IL10 является противовоспалительным цитокином и его повышение при воспалительных процессах имеет важное значение в сдерживании активности воспалительного процесса и предохранении тканей организма от чрезмерного повреждения. Что, несомненно, очень важно при АВ, сопровождающемся выраженной воспалительной реакцией и десквамацией эпителия. Описаны некоторые механизмы супрессорного действия С. albicans, обладающего способностью стимулировать синтез некоторых противовоспалительных цитокинов, в том числе и IL10 [120]. Ключевую роль в иммунном ответе при бактериальных и грибковых инфекциях играют макрофаги, нейтрофилы и натуральные киллеры, обеспечивающие фагоцитоз и нейтрализацию патогена непосредственно на поверхности слизистых. Фагоцитоз сопровождается синтезом в макрофагах ряда цитокинов TNFα и IL1b [11, 40]. Повышенные уровни транскриптов генов TNFа и IL1b мы и наблюдаем при АВ и КВВ – вагинальных инфекциях с воспалительным синдромом. Важность IL18 при инфекционных процессах определяется его участием в дифференцировке Тh0 в Th1-лимфоциты, следовательно, способностью стимулировать выработку IFNγ. Результаты нашего исследования совпали с результатами другого исследования, где было показано, что уровень экспрессии мРНК генов IL18 при БВ снижен [3]. Эти данные соответствуют общим представлениям об иммунносупрессии, имеющей место при БВ [84]. Учитывая ассоциацию разных видов лактобацилл c различными состояниями микробиоты влагалища, была проанализирована зависимость транскрипционного профиля генов маркеров иммунного ответа от вида лактобацилл. При оценке взаимосвязи между преобладанием видов L. crispatus, L. iners, L. jensenii и L. gasseri и транскриптами генов врожденного иммунитета, корреляция была выявлена только для вида L. crispatus. Было установлено, что в образцах с доминированием L. crispatus уровни экспрессии мРНК генов IL18, GATA3 и CD68 были повышены. Подобные результаты были получены и в другом исследовании, изучающем состояние локального иммунитета слизистой влагалища при дисбиотических нарушениях, где показано снижение мРНК IL18, GATA3 и CD68 при неспецифических вагинитах и БВ, по сравнению с группой, где доминировал L. crispatus [3]. Известно, что GATA3 экспрессируется не только иммунокомпетентными, но и некоторыми другими типами клеток и играет важную роль в поддержании гомеостаза эпителия [85]. Повышение данных иммунных маркеров свидетельствует о высокой резистентности слизистой влагалища к условно патогенным микроорганизмам при доминировании в вагинальном биотопе вида L. crispatus, иммуномодулирующая способность которого подтверждена во многих исследованиях [28, 37, 54, 74, 90, 100, 118]. Таким образом, на основании полученных нами данных об особенностях экспрессии транскрипционного профиля некоторых генов врожденного иммунитета в отделяемом влагалища у здоровых женщин и женщин с вагинальными инфекциями, мы выявили основные микробиологические и иммунные маркеры, характерные для различных состояний микробиоценоза. Показали, что у здоровых женщин при доминировании в вагинальном биотопе вида L. crispatus повышены уровни экспрессии мРНК генов IL18, GATA3 и CD68. У женщин с вагинальными инфекциями иммуномодулирующее воздействие на слизистую оказывают УПМ, а не лактобациллы. Так при АВ отмечены повышенные уровни мРНК IL1b, IL10 и TLR4; для КВВ характерны повышенные уровни мРНК IL1b и TLR4, а преобладание анаэробных микроорганизмов при БВ сопровождается снижением уровней мРНК IL18 и GATA3. Тем самым, изученный нами комплексный подход, основанный на применении молекулярно- биологических тестов, позволяющих в одном и том же образце исследуемого материала выявить ДНК микроорганизмов и оценить локальную воспалительную реакцию, является важнейшим инструментом для оценки состояния микробиоценоза влагалища и дифференциальной диагностики вагинальных инфекций. ВЫВОДЫ 1. Использование молекулярно-биологических тестов позволило определить лидирующее место труднокультивируемого вида L. iners и показало, что вагинальный биотоп колонизируют до шести видов лактобацилл одновременно, но доминирующим, как правило, является один вид. Аналитическая чувствительность и специфичность тест-системы на основе ПЦР в реальном времени для видовой дифференциации лактобацилл составили 100%. 2. В популяции женщин репродуктивного возраста чаще доминируют виды L. iners, L. crispatus, L. gasseri и L. jensenii, в связи с чем представляется целесообразным дифференциация и количественное определение этих 4 видов. При доминировании в вагинальном биотопе L. crispatus состояние микробиоценоза наиболее стабильно, с доминированием L. iners и L. gasseri связаны риски развития дисбиотических процессов. 3. Содержание вида L. crispatus в группе здоровых женщин достоверно выше, чем у женщин с бактериальным вагинозом и аэробным вагинитом (p<0,0001). Преобладание L. crispatus коррелирует с более низким уровнем рН вагинального отделяемого и имеет значительную отрицательную корреляцию с кластером Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp. (р<0,0001), что позволяет расценивать доминирование L. crispatus в микробиоте влагалища как благоприятный прогностический признак и надежный маркер защиты от бактериального вагиноза. 4. Изменение состава микробиоты влагалища, сопровождающиеся чрезмерным размножением УПМ, приводит к изменению профиля экспрессируемых мРНК цитокинов. Применение теста, основанного на ОТ- ПЦР для оценки локальной воспалительной реакции, имеющего высокие показатели чувствительности и специфичности (100% и 87,5%, соответственно), представляется наиболее информативным подходом. Для аэробного вагинита диагностические параметры чувствительности и специфичности теста ОТ-ПЦР для оценки воспаления составили 100%. 5. Выявлены значительные различия в экспрессии мРНК цитокинов у женщин с вагинальными инфекциями по сравнению с женщинами контрольной группы. Маркерами аэробного вагинита явились повышенные уровни мРНК IL1b, IL10 и TLR4; кандидозного вульвовагинита – повышенные уровни мРНК IL1b и TLR4; бактериального вагиноза – сниженные уровни мРНК IL18 и GATA3. Данные иммунные маркеры могут быть использованы для дифференциальной диагностики вагинальных инфекций. 6. В образцах с доминированием L. crispatus уровни экспрессии мРНК генов IL18, GATA3 и CD68 повышены. Данное сочетание микробиологических и иммунологических маркеров является благоприятным прогностическим критерием стабильности физиологического микробиоценоза влагалища. 7. Не выявлена взаимосвязь между видами вагинальных лактобацилл и экспрессией мРНК генов врожденного иммунитета у женщин с вагинальными инфекциями. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Для специалистов клинической лабораторной диагностики и клинических врачей акушеров-гинекологов, оказывающих специализированную помощь женщинам репродуктивного возраста: 1. Молекулярно-биологический тест на основе ПЦР в режиме реального времени для видовой дифференциации вагинальных лактобацилл («Типирование лактобактерий», ООО «НПО ДНК-Технология», Москва, Россия) рекомендуется в качестве высоко чувствительной (100%) и специфичной (100%) альтернативы культуральному методу выделения лактобацилл, особенно некультивируемых. Этот метод выявляет одновременно несколько видов лактобацилл, позволяет провести их дифференциацию, определить количество и существенно сократить время исследования. 2. Для оценки стабильности микробиоценоза влагалища рекомендуется количественное определение лактобацилл. При наличии в анамнезе вагинальных инфекций, а также акушерских и гинекологических осложнений имеет значение дифференциация лактобацилл до вида. Доминирование L. crispatus свидетельствует о стабильности вагинального микробиоценоза; при аэробном вагините и бактериальном вагинозе наблюдается значительное снижение L. crispatus, L. jensenii и L. vaginalis, а для кандидозного вульвовагинита характерны преобладание L. gasseri и L. vaginalis. 3. Для объективной оценки локального воспалительного статуса рекомендуется использование теста на основе ОТ-ПЦР, позволяющего по профилю экспрессии мРНК генов врожденного иммунитета в отделяемом влагалища выявить наличие воспалительной реакции. Чувствительность и специфичность нового теста ИммуноКвантекс для оценки локальной воспалительной реакции во влагалище составили 100% и 87,5%, соответственно. При аэробном вагините чувствительность и специфичность теста ИммуноКвантэкс составляют 100%. 4. Метод ОТ-ПЦР для оценки воспалительной реакции выявляет изменение показателей врожденного иммунитета при дисбиотических нарушениях влагалищной микрофлоры, выражающееся в изменении профиля мРНК генов маркеров иммунного ответа, и рекомендован в случаях неэффективности проводимой терапии и высокой частоты рецидивирования бактериального вагиноза и других вагинальных инфекций, а также для дифференциальной диагностики различных вагинальных инфекций.