Клинико-нейрофизиологические и молекулярно-генетические характеристики наследственных периферических нейропатий с аутосомно-рецессивным типом наследования

В первой части обзора представлены современные представления о НН и их
классификации. Во второй и третьей частях приведены клинические и молекулярно- генетические особенности отдельных форм наследственных моторно-сенсорных и наследственных моторных нейропатий соответственно. В четвертой главе обсужда- ются вопросы диагностики НН с аутосомно-рецессивным типом наследования. В за- ключительной части рассматриваются подходы к лечению наследственных нейропа- тий.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы исследования
Для решения поставленных задач работа была разделена на две части: молеку-
лярно-генетическую и клиническую, и состояла из 3 этапов, результаты которых в по- следующем объединены с целью оптимизации диагностики НН. Каждый из этих трех этапов исследования включил сбор и/или анализ разного материала: (1) ретроспектив- ный анализ данных секвенирования экзомов 1034 пробандов, обратившихся в ФГБНУ МГНЦ им. акад. Н.П. Бочкова с диагнозами, отличными от НН; (2) поиск частых мута- ций в генах HINT1, GDAP1, NDRG1 и SH3TC2 в группе 1596 неродственных пробандов с диагнозом НМСН; (3) клиническое и нейрофизиологическое обследование и сбор ар- хивных клинических и нейрофизиологических данных больных НМСН, часть из кото- рых была обследована на втором этапе, а часть была выявлена и обследована после завершения второго этапа работы.
Методы исследования
Ретроспективный анализ данных секвенирования экзомов 1034 больных, обра- тившихся для поведения секвениования ДНК по причине, отличной от НМСН. Данные секвенирования экзомов включены в базу данных RuEXAC и обработаны с помощью программного обеспечения «NGSData». Был сгенерирован единый VCF-файл, который включил в себя отличия от референсной последовательности по генам, ответственным за развитие АР-НН: NDRG1, GDAP1, HINT1, SH3TC2, SORD, KARS, IGHMBP2, TRIM2, MED25, LMNA, PRX, SBF2, MTMR2, FGD4, FIG4, MME, HK1.
Выделение ДНК проведено из образцов цельной крови с использованием набо- ров DIAtomTM DNA Prep100 kit (Isogene Lab. Ltd., Russia) и Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega, USA) согласно инструкции фирмы производителя.
Мультиплексная аллель-специфичная проба-зависимая лигазная реакция. Лигаз- ная реакция проводилась на программируемом термоциклере Терцик (ДНК-техноло- гия, Россия) с использованием ДНК-лигазы Pfu («Stratagene»).
Метод прямого секвенирования по Сенгеру. Определение нуклеотидной после- довательности проводилось методом прямого автоматического секвенирования про- дукта ПЦР с прямого и обратного праймеров по Сенгеру. В качестве матрицы для про- ведения сиквенирования использованы фрагменты, полученные амплификацией мето- дом ПЦР. Секвенирование проведено согласно протоколу производителя, на приборе ABI Prism 3100 (Applied Biosystems).
Метод массового параллельного секвенирования. Анализ ДНК проведен на се- квенаторе нового поколения Ion S5. Для пробоподготовки использована технология ультрамультиплексной ПЦР сопряженная с последующим секвенированием (AmpliSeqTM). Анализ проведен с использованием кастомной панели «Charcot-Marie- Tooth», включающей кодирующие последовательности генов: MFN2, MPZ, EGR2, FGD4, LITAF, PMP22, PRX, MORC2, SH3TC2, HINT1, HSPB1, NEFL, NDRG1, GDAP1, GJB1. Обработка данных секвенирования проведена с использованием стандартного автоматизированного алгоритма, предлагаемого TermoFisher Scientific (Torrent SuiteTM), а также программного обеспечения Gene-Talk.
Биоинформатический анализ проведен на основе руководства по интерпретации данных последовательности ДНК человека, полученных методами массового парал- лельного секвенирования (Рыжкова О.П. и др., 2019) и критериев Американского кол- леджа молекулярной генетики (ACMG) (Richards S. et al., 2015).
Клиническое обследование больных. Клинико-нейрофизиологические особенно- сти АР-НН изучены у 62 больных из 52 семей. На всех больных заполнена карта фено- типа, включившая разделы оценки чувствительной сферы (болевая чувствительность, мышечно-суставное чувство, наличие сенситивной атаксии), оценки двигательной сферы (трофика, тонус и сила мышц, тремор пальцев вытянутых рук, наличие дефор- мации кистей, стоп, позвоночника, глубокие рефлексы с рук и ног), наличие дополни- тельных признаков, таких как нейромиотонический феномен, дисфония и другие.
Стимуляционная и игольчатая электронейромиография (ЭНМГ). Исследованы сенсорные и моторные волокна срединного нерва, моторные волокна большеберцового нерва и сенсорные волокна икроножного нерва с одной стороны. Оценивались ско- рость распространения возбуждения (СРВ) и амплитуда ответов. Больным аксональной формой нейропатии проведена игольчатая ЭНМГ мышц ног (передняя большеберцовая мышца и латеральная широкая мышца бедра). При этом оценивались наличие и вид спонтанной активности и параметры потенциалов двигательных единиц (средняя ам- плитуда и средняя длительность). ЭНМГ проведена на электромиографах компаний “Keypoint” (Дания) и “Нейрософт” (Россия).
Статистическая обработка данных осуществлялась с использованием пакета программы Statistica 10.0. В качестве описательной статистики для количественных признаков применены медиана и интерквартильный размах. При анализе предполагае- мых различий качественных признаков в исследуемых группах исходили из Н0 гипо- тезы об отсутствии различий. При сравнении представленности признака у больных разными формами нейропатий Н0 проверялась с помощью Z-score для оценки пропор- ций при уровне значимости α=0,05 (p<0,05 принят достаточным для признания разли- чий достоверными). Для процедуры множественной проверки гипотез с целью коррек- ции р-значений использован метод Бенджамини-Хохберга. Сравнение исследуемых групп по возрастным характеристикам проведено с помощью критерия Краскела–Уол- лиса. 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Вклад аутосомно-рецессивных форм в структуру наследственных нейропатий в Российской Федерации С целью оценки вклада аутосомно-рецессивных форм в структуру НН в РФ про- веден расчет частоты носительства патогенных и вероятно-патогенных вариантов в ге- нах, ответственных за АР-НН, а также поиск частых мутаций в генах наиболее частых АР-НН в группе больных, направленных на ДНК-анализ с диагнозом «наследственная моторно-сенсорная нейропатия». Расчет частоты носительства патогенных и вероятно- патогенных вариантов осуществлен путем ретроспективного анализа данных севкени- рования экзомов. На основании проведенного исследования оценена суммарная рас- четная частота болезни АР-НН в РФ и вклад аутосомно-рецессивных форм в структуру НН. Анализ данных секвенирования экзомов Проведен ретроспективный анализ данных секвенирования экзомов 1034 боль- ных, обратившихся за анализом по причине, отличной от НМСН, в результате чего сформированы единые VCF-файлы, включающие все варианты отличные от референса в генах АР-НН: NDRG1, GDAP1, HINT1, SH3TC2, SORD, KARS1, IGHMBP2, TRIM2, MED25, LMNA, PRX, SBF2, MTMR2, FGD4, FIG4, MME, HK1. Проведена фильтрация выявленных вариантов по частоте: в соответствии с Российскими рекомендациями по клинической интерпретации данных массового параллельного секвенирования ото- браны варианты с частотой меньшей или равной 0,005 (0,5%) согласно популяционной базе данных gnomAD (Karczewski K.J. et al., 2020) и базе данных RuEXAC. Далее для всех генов отобраны варианты, которые согласно критериям Американского колледжа молекулярной генетики (ACMG) (Richards S. et al., 2015) и Российских рекомендаций (Рыжкова О.П. и др., 2019) являются патогенными и вероятно патогенными (табл. 4.1- 4.14). В генах IGHMBP2, TRIM2, MED25, LMNA, EGR2 патогенных и вероятно пато- генных вариантов не встретилось. В генах GDAP1, HINT1, SH3TC2, FIG4, MME и SORD выявлены варианты, ранее описанные при рецессивной нейропатии как патогенные (выделены жирным шрифтом). В генах NDRG1, KARS, PRX, SBF2, MTMR2, FGD4 вы- явлены варианты, которые не описаны ранее как патогенные, однако, согласно крите- риям ACMG (Richards S. et al., 2015), являются патогенными и вероятно патогенными. Для расчета частоты носительства отдельных форм АР-НН мы использовали описанные ранее как каузативные варианты в исследуемых генах (в таблицах 4.1-4.13 выделены жирным шрифтом). Также проведена оценка возможной частоты рецессив- ных форм НН с учетом как ранее описанных так и не описанных как патогенные вари- антов, носительство которых выявлено в исследуемой группе экзомов (табл.1). Для всех аутосомно-рецессивных форм определена суммарная расчетная частота болезни. При оценке только по описанным ранее как патогенные при НН вариантам она составила 1 на 66 813 населения РФ [95%ДИ 1:155 909–1:4 494]. Таким образом, несмотря на то, что частота рецессивных форм у жителей РФ ниже суммарной частоты доминантных форм, их возможное присутствие необходимо учитывать при медико-ге- нетическом консультировании и планировании профилактических мероприятий. Таблица 1. Частота носительства и расчетная частота аутосомно-рецессивных наследственных нейропатий. Ген Аллельная частота ва- риантов, описанных в литера- турных ис- точниках как пато- генные Частота носи- тельства Расчетная частота бо- лезни Аллельная частота всех патоген- ных и ве- роятно-па- тогенных вариантов Частота носитель- ства Расчетная частота бо- лезни NDRG1 0.000000 GDAP1 0.000967 HINT1 0.003385 SH3TC2 0.001451 SORD 0.000484 KARS 0.000000 IGHMBP2 0.000000 TRIM2 0.000000 MED25 0.000000 LMNA 0.000000 PRX 0.000000 SBF2 0.000000 MTMR2 0.000000 FGD4 0.000000 FIG4 0.000484 MME 0.000484 HK1 0.000000 Суммар- ная 0.000000 0.001934 0.006770 0.002902 0.000968 0.000000 0.000000 0.000000 0.000000 0.000000 0.000000 0.000000 0.000000 0.000000 0.000968 0.000968 0.000000 0.000000000 0.000000935 0.000011458 0.000002105 0.000000234 0.000000000 0.000000000 0.000000000 0.000000000 0.000000000 0.000000000 0.000000000 0.000000000 0.000000000 0.000000234 0.000000234 0.000000000 0.000015201 0.000484 0.002901 0.004836 0.002418 0.000484 0.000484 0.000000 0.000000 0.000000 0.000000 0.001451 0.002418 0.000484 0.000484 0.001934 0.003385 0.001451 0.000968 0.005802 0.009671 0.004836 0.000968 0.000968 0.000000 0.000000 0.000000 0.000000 0.002901 0.004836 0.000967 0.000967 0.003868 0.006770 0.002901 0.000000234 0.000008416 0.000023383 0.000005846 0.000000234 0.000000234 0.000000000 0.000000000 0.000000000 0.000000000 0.000002104 0.000005846 0.000000234 0.000000234 0.000003740 0.000011458 0.000002104 0.000064066 Поиск мутаций в генах HINT1, GDAP1, SH3TC2 и NDRG1 Из 1596 неродственных семей, обратившихся в ФГБНУ «МГНЦ им. академика Н.П. Бочкова» с клиническим диагнозом НМСН в период с 2005 по 2017 год, отобраны образцы ДНК пробандов, родословная семьи которых не противоречит аутосомно-ре- цессивному типу наследования болезни (не прослеживается передача болезни из поко- ления в поколение), у них не обнаружена иная молекулярно-генетическая причина НМСН на предыдущих этапах обследования. Из этой группы образцы ДНК были до- ступны для исследований у 694 неродственных больных (рис. 1). На первом этапе проведен поиск частой мутации с.110G>C (р.Arg37Pro) в гене
HINT1, ответственного за одну из самых частых аутосомно-рецессивных форм НН в ряде стран (Lassuthova et al., 2015; Peeters et al., 2017). Данный вариант выявлен в го-
мозиготном состоянии у 29 неродственных больных и у 5 пробандов – в гетерозигот- ном состоянии. У всех гетерозигот по варианту с.110G>C проведено исследование всей кодирующей последовательности и прилежащих интронных областей гена HINT1 ме- тодом прямого автоматического секвенирования по Сенгеру. У двух пробандов выяв- лены вторые варианты нуклеотидной последовательности, ранее не описаны как кау- зативные и не зарегистрированные в популяционной базе данных gnomAD (Karczewski et al., 2020): c.112-1delG и c.281A>G (p.Tyr94Cys). Транс-положение выявленных вари- антов по отношению к с.110G>C доказано анализом образцов ДНК родителей пробан- дов. Таким образом, у 31 неродственного больного с клиническим диагнозом «наслед- ственная моторно-сенсорная нейропатия» причиной болезни являются мутации гена HINT1. В пересчете на общую выборку в 1596 семей установлено, что доля HINT1-АР- НН у российских больных с диагнозом НН не менее 1,9%. Среди 316 больных с аксо- нопатией, мутации гена HINT1 в гомозиготном и компаунд-гетерозиготном состоянии выявлены у 30 неродственных пробандов (9%).
Рисунок 1. Результаты поиска мутаций в генах HINT1, GDAP1, SH3TC2 и NDRG1 у больных НН.
Далее проведен поиск мутаций в генах GDAP1 и SH3TC2 методом мультиплекс- ной проба-зависимой амплификации. Для данных генов не выявлено мажорных вари- антов нуклеотидной последовательности на предыдущем этапе при ретроспективном анализе данных 1034 экзомов. В связи с этим при формировании системы для скринин- гового обследования больных мы использовали литературные данные о вариантах, накопленных у родственных российским больным славянских народов. В систему де- текции мутаций вошли следующие варианты нуклеотидной последовательности: c.715C>T (p.Leu239Phe) в гене GDAP1, c.2860C>T (p.Arg954*), c.1972C>T (p.Arg658Cys) и c.3325C>T (p.Arg1109*) в гене SH3TC2.
Мутация c.715C>T (p.Leu239Phe) в гене GDAP1 обнаружена в гомозиготном со- стоянии у 5 пробандов и в гетерозиготном состоянии – у 13 пробандов, у которых было проведено секвенирование всей нуклеотидной последовательности. У 9 из 13 гетеро- зигот по частой мутации обнаружены вторые варианты нуклеотидной последователь- ности (рис. 1). Транс-положение обнаруженных вариантов по отношению к c.715C>T доказано анализом образцов ДНК родителей пробандов.
В трёх образцах ДНК выявлены варианты нуклеотидной последовательности гена SH3TC2 в гетерозиготном состоянии: c.1972C>T (p.Arg658Cys) — в двух и c.2860C>T (p.Arg954*) в одном. Два образца ДНК из этих трех направлены на секвени- рование последовательности гена SH3TC2 с целью поиска вторых вариантов, у одного из которых обнаружен один вариант нуклеотидной последовательности c.1969G>A (p.Glu657Lys).
Для исследования причины НМСН у 14 неродственных пробандов цыганского происхождения, проживающих на территории РФ, проведен поиск вариантов нук-лео- тидной последовательности c.442C>T в гене NDRG1 и c.3325C>T в гене SH3TC2 с ис- пользованием системы на основе аллель-специфичного лигирования. В гене NDRG1 мутация c.442C>T (p.Arg148*) обнаружена в гомозиготном состоянии у 11 больных (79%). Двое больных являются сибсами, остальные случаи — изолированные. Досто- верных данных о кровном родстве в обследованных семьях нет. У оставшихся 3 про- бандов проведено секвенирование клинического экзома, однако значимых вариантов нуклеотидной последовательности не обнаружено.
Таким образом, используя системы поиска отдельных вариантов нуклеотидной последовательности в генах HINT1, GDAP1, SH3TC2 и NDRG1, удалось установить мо- лекулярно-генетическую причину болезни у 57 больных из 1596 направленных, что со- ставило 3,6% (рис. 2А), а среди подтвержденных молекулярно-генетическими мето- дами НН — 9% (рис. 2Б).
Данные электромиографического обследования были известны у 1180 больных из 1596 (рис. 2В): у 864 пробандов СРВ по срединному нерву меньше 38 м/с, у 316 пробандов — больше 38 м/с. Для 416 семей мы не располагали информацией о резуль- татах ЭНМГ. Среди 864 пробандов с демиелинизирующей нейропатией у 392 обнару- жена дупликация гена PMP22 — причина самой частой демиелинизирующей АД-НН. У 8 из оставшихся 472 больных обнаружена НН, обусловленная мутациями в генах NDRG1 (7 пробандов) и SH3TC2 (1 пробанд). Таким образом, не менее 0,9% демиели- низирующих НН после исключения НМСН1А являются аутосомно-рецессивными. Среди 316 больных с аксональной нейропатией у 30 пробандов обнаружены мутации в гене HINT1 и у 14 пробандов — в гене GDAP1 в гомозиготном или компаунд-гетерози- готном состоянии. То есть не менее 14% аксонопатий являются аутосомно-рецессив- ными нейропатиями.
Сравнение доли аутосомно-рецессивных форм среди миелинопатий и аксонопа- тий проведено с использованием Z-score для оценки пропорций при уровне значимости α=0,05 (p<0,05 принят достаточным для признания различий достоверными). Значение Z составило 9,6331 (p < 0,00001), что указывает на статистическое значимое преобла- дание доли АР-НН среди аксонопатий, чем среди миелинопатий. Таким образом, среди аксональных нейропатий аутосомно-рецессивных форм больше, чем среди демиелини- зирующих. А. Б. В. Рисунок 2. А — Результаты поиска мутаций в 4 генах HINT1, GDAP1, SH3TC2 и NDRG1 у 1596 больных, направленных с диагнозом наследственной нейропатии у всех больных с клиническим диагнозом «наследственная нейропатия», Б — распределение нейропатий по типам наследования у больных с подтвержденным молекулярно-гене- тическими методами диагнозом, В — доля выявленных аутосомно-рецессивных форм в структуре демиелинизирующих и аксональных нейропатий. Клиническая и молекулярно-генетическая характеристика наследственных нейропатий с аутосомно-рецессивным типом наследования Группа больных АР-НН включила 62 больных из 52 семей у которых диагноз был подтвержден молекулярно-генетическими методами либо родословная соответ- ствовала аутосомно-рецессивному типу наследования болезни (два и более больных детей у здоровых родителей). На основании результатов генеалогических, клиниче- ских, биохимических, электрофизиологических и молекулярно-генетических методов обследования диагноз подтвержден у 56 пациентов, что составило 90,3%. У шестерых больных из 3 семей выявить этиологию заболевания не удалось, в том числе и при про- ведении секвенирования экзома. Большую часть выборки с подтвержденным молекулярно-генетическими мето- дами диагнозом составили больные, выявленные на втором этапе исследования (из вы- борки 1596 больных с НМСН), для которых были доступны клинические данные, од- нако часть больных обратилась в ФГБНУ МГНЦ уже после того как выборка была сформирована. Среди 56 больных с подтвержденным диагнозом у 15 больных обнару- жены мутации в гене GDAP1, у 17 – в гене HINT1, у 9 – в гене NDRG1, у 12 – в гене SH3TC2. У троих больных диагностированы редкие варианты АР-НН, обусловленные мутациями в генах IGHMBP2, FIG4, MME. Возраст на момент осмотра больных АР-НН составил от 4 до 63 с медианой 17,5 лет. Стимуляционная ЭНМГ проведена 82% больных. У 31 больного (50%) выявлен аксональный тип нейропатии на основании СРВ по моторным волокнам срединного нерва (больше 38 м/с), а демиелинизирующий тип — у 20 больных (32%). Хотя прове- дение игольчатой ЭНМГ не является облигатным методом исследования, тем не менее она проведена половине больных аксональными формами АР-НН (HINT1-АР-НН и GDAP1-АР-НН). Таким образом, для изучения клинических и нейрофизиологических особенно- стей разных форм АР-НН в России составлены 4 группы больных c наиболее частыми вариантами АР-НН. Число больных в группах, а также их половой состав позволяют провести сравнительный анализ клинических и нейрофизиологических данных с целью выявления отличительных особенностей. Кроме того, в работу включены описания 3 клинических наблюдений с более редкими формами АР-НН (обусловленными мутаци- ями в генах MME, IGHMBP2 и FIG4) для демонстрации генетического и фенотипиче- ского разнообразия этой группы НН. Клиническая и молекулярно-генетическая характеристика больных наслед- ственной нейропатией, обусловленной мутациями в гене GDAP1 (OMIM:607831) В группу больных GDAP1-АР-НН вошло 15 человек: 7 больных мужского и 8 женского пола. Все семьи идентифицировали себя по национальности русскими, за ис- ключением одной семьи (белорусы). Возраст на момент осмотра составил от 4 до 63 лет с медианой 18 [10; 28]. Девять случаев являются изолированными, данные о кров- нородственных отношениях в этих семьях отсутствуют. Остальные 6 больных из 2 се- мей имеют больных сибсов. У всех больных причиной болезни являлась мажорная мутация c.715C>T (p.Leu239Phe): у 9 больных — в гомозиготном состоянии, у 6 больных — в компаунд- гетерозиготном состоянии с другими вариантами нуклеотидной последовательности. Среди обнаруженных вариантов, кроме c.715C>T (p.Leu239Phe), выявлены два мис- сенс-варианта, один нонсенс-вариант и один вариант, влияющий на сплайсинг.

Все обследованные больные GDAP1-АР-НН имеют аксональную форму нейро- патии, манифестирующую в первом десятилетии жизни и характеризующуюся уме- ренно прогрессирующим течением. Мы предполагаем, что отсутствие тяжелых форм заболевания объясняется относительной молекулярно-генетической однородностью выборки. У всех больных обнаружена частая мутация c.715C>T (p.Leu239Phe) в гомо- зиготном или компаунд-гетерозиготном состоянии. Проведенный ранее функциональ- ный анализ этой мутации свидетельствует о нерезко выраженном влиянии мутации на функцию белкового продукта гена (Kabzinska D. et al., 2010; Rzepnikowska W. et al., 2020).
В выборке нет больных с парезом голосовых связок, который изначально был описан как один из симптомов данной формы нейропатии, возникающий вследствие вовлечения возвратного гортанного нерва (Sevilla T. et al., 2008). Полученные резуль- таты можно объяснить характером мутаций у описанных в литературе больных с паре- зом голосовых связок. Показано, что преобладающая часть таких больных имела на обоих аллелях варианты, приводящие к прекращению синтеза белка, в то время как у больных выборки хотя бы на одном аллеле обнаружен нуклеотидный вариант, оказы- вающий умеренный патогенный эффект. Так у троих больных с нонсенс-вариантом на одном аллеле, тяжесть клинических проявлений не отличалась от таковых у больных с миссенс-вариантами.
Клиническая и молекулярно-генетическая характеристика больных наслед- ственной нейропатией, обусловленной мутациями в гене HINT1 (OMIM:137200)
Группу HINT1-АР-НН составили 17 больных, 10 из которых женского, 7 — муж- ского пола, в возрасте от 10 до 44 лет с медианой 26 [18; 32]. Четверо больных из вы- борки имеют семейный анамнез, предполагающий аутосомно-рецессивное наследова- ние (более 1 больного ребенка у родителей без признаков НМСН). Остальные 13 про- бандов — единственные больные в семье. Возраст дебюта болезни варьировал от 4 до 14 лет с медианой 9 [6; 11], то есть заболевание обычно манифестирует к концу первой декады жизни, что подтверждается данными литературы (Lassuthova P. et al., 2015; Zimon M. et al., 2012).
У 15 больных обнаружена мутация c.110G>C (р.Arg37Pro) в гомозиготном со- стоянии, что связано с высокой частотой ее носительства на территории РФ. Эта мута- ция
. У двух больных эта же мутация находится в компаунд-гетерозиготном со- стоянии с другими мутациями:
(Richards S. et al., 2015).
Все больные, причиной болезни которых явились мутации в гене HINT1, имеют
аксональную периферическую нейропатию с несколькими отличительными клиниче- скими признаками. У подавляющего большинства больных при неврологическом осмотре выявляется нейромиотонический феномен в виде затруднения быстрого рас-
является мажорной в ряде стран Центральной и Восточной Европы (Lassuthova P.
et al., 2015)
выявленных вариантов по отношению к
c.112-1delG и c.250T>C (p.Cys84Arg). Транс-положение
с.110G>C
доказано анализом образцов ДНК
родителей пробандов. Все обнаруженные варианты являются патогенными согласно
критериям патогенности ACMG
слабления мышц после их сильного сокращения, который появлялся по мере прогрес- сирования заболевания. Этот признак с патогенетической точки зрения обусловлен спонтанно возникающими разрядами в периферических нервах (Peeters K. et al., 2017). Отсутствие этого признака у ряда больных может быть обусловлено несколькими при- чинами. Врач может пропустить его при проведении клинического осмотра, особенно, если больной активно не предъявляет жалоб на скованность в мышцах. Также нейро- миотонический феномен сложно обнаружить при наличии контрактур межфаланговых суставов пальцев кистей в связи с ограничением их разгибания. Однако при проведе- нии игольчатой ЭНМГ у 100% больных зарегистрированы нейромиотонические раз- ряды.
При разных НН редко отмечаются контрактуры пальцев рук, а у больных HINT1- АР-НН, как изученных в настоящей работе, так и описанных в литературе, тугоподвиж- ность и контрактуры межфаланговых суставов кистей отмечаются у половины больных (Peeters K. et al., 2017). Это может быть обусловлено выраженным снижением силы мышц кистей и постоянно присутствующим невидимым сокращением мышечных во- локон вследствие нейромиотонии.
Феномен нейромиотонии, вероятно, обуславливает и нейропатическую боль, на которую предъявляли жалобы треть обследованных больных. При этом противоболе- вой эффект могут иметь противоэпилептичексие препараты, применяющиеся для ку- пирования нейропатических болей иного генеза (Peeters K. et al., 2017). Препараты типа карбамазепина могут значительно уменьшить и скованность мышц.
При проведении стимуляционной ЭНМГ заинтересованность сенсорных воло- кон регистрируется лишь у части больных, поэтому HINT1-АР-НН можно отнести к наследственным моторным нейропатиям.
Клиническая и молекулярно-генетическая характеристика больных наслед- ственной нейропатией, обусловленной мутациями в гене SH3TC2 (OMIM:601596) Группу больных SH3TC2-АР-НПН составили 12 больных, из которых двое явля- ются сибсами. Пять больных женского пола и семь — мужского. Возраст на момент осмотра варьировал от 7 до 54 лет с медианой 16 [14,25;18,25], возраст дебюта болезни — от 1 до 16 лет с медианой 6 [3,75;10,75]. Все больные, за исключением одной обле-
дуемой, по национальности русские.
У 4 больных из 3 семей по родословной предположен аутосомно-рецессивный
тип наследования болезни, то есть пробанды имеют больных сибсов и здоровых роди- телей. У одной больной родители состоят в кровнородственном браке. Остальные 7 случаев SH3TC2-АР-НПН являются изолированными.
У больных SH3TC2-АР-НН выявлено 15 вариантов нуклеотидной последова- тельности с разными эффектами: нонсенс, миссенс, влияющие на сплайсинг, приводя- щие к сдвигу рамки считывания. У семерых больных оба варианта нуклеотидной по- следовательности являются вариантами, определенно приводящими к прекращению синтеза белка SH3TC2.
Потеря функции белка SH3TC2 является известным механиз-
мом развития болезни: в гене описано более 60 патогенных вариантов, приводящих к
прекращению синтеза белка.
У всех больных SH3TC2-АР-НН, которым проведена ЭНМГ, выявлены признаки демиелинизирующего поражения нервов. При SH3TC2-АР-НН отсутствуют описания больных с аксональным или промежуточным типом поражения периферических не- рвов (Kontogeorgiou Z. et al., 2019; Piscosquito G. et al., 2016). При этом, несмотря на демиелинизирующее, а не аксональное, поражение периферических нервов, атрофия мышц ног у больных с данной формой НН равномерная, а не по типу «перевернутых бутылок», как при других миелинопатиях, что свидетельствует о довольно быстром развитии вторичного аксонального поражения нервов и, как следствие, нарушению трофики мышц не только стоп, но и голеней.
Характерным клиническим признаком SH3TC2-АР-НН является сколиотическая деформация позвоночника, развивающаяся на ранних стадиях болезни, иногда еще до появления признаков полинейропатии. Сколиоз обнаружен у 83% больных, что гово- рит об отсутствии связи возраста развития признаков нейропатии и определенных мо- лекулярно-генетических характеристик с деформацией позвоночника.
Итак, SH3TC2-АР-НН можно заподозрить у больных при сочетании демиелини- зирующей нейропатии со сколиотической деформацией позвоночника, особенно в слу- чае раннего развития последней.
Клиническая и молекулярно-генетическая характеристика больных наслед- ственной нейропатией, обусловленной мутациями в гене NDRG1 (OMIM:601455)
В группу больных NDRG1-АР-НПН вошло 9 больных из 8 семей. Все пробанды цыганского происхождения. 4 больных мужского пола и 5 — женского. 2 больных из 9 являются сибсами. 7 случаев изолированные, в двух из которых отмечен близкород- ственными браками. Остальные случаи изолированные.
Возраст на момент осмотра больных — от 6 до 19 лет c медианой 9 лет [8;11], возраст начала болезни — от 2 до 7 лет с медианой 3 года [2;3]. Такой возраст дебюта является ранним в сравнении с другими НПН. По данным литературы, NDRG1-АР- НПН, как правило, манифестирует в возрасте до 7-10 лет (Gabrikova D. et al., 2013; Safka Brozkova D. et al., 2017).
У всех больных NDRG1-АР-НН обнаружена мутация c.442C>T (p.Arg148*) в го- мозиготном состоянии. Вариант нуклеотидной последовательности c.442C>T приво- дит к образованию преждевременного терминирующего кодона в позиции 148 и со- гласно критериям патогенности ACMG (Richards S. et al., 2015) является патогенным (табл. 13.1). Для этой мутации описан эффект основателя у цыган, в настоящее время проживающих на территории разных стран (Gabrikova D. et al., 2013; Kalaydjieva L. et al., 1998).
При обсуждении больных NDRG1-АР-НН следует учитывать, что все больные осмотрены в возрасте до 19 лет. Вероятно, этим обуславливается однородность клини- ческой картины заболевания. Описанная в литературе особенность этой формы нейро- патии в виде развития нейросенсорной тугоухости не отмечена ни у кого из больных NDRG1-АР-НН, что связано с возрастом манифестации признака в 30-40 лет.

У всех обследуемых заболевание манифестировало в возрасте до 10 лет. Часто появление первых признаков отмечалось в 2-3 летнем возрасте, что согласуется с дан- ными литературы (Kalaydjieva L. et al., 1998; Safka Brozkova D. et al., 2017). Как и SH3TC2-АР-НПН, NDRG1-АР-НПН всегда проявляется демиелинизирующим пораже- нием периферических нервов. Тем не менее вторичное аксональное поражение разви- вается довольно рано, приводя к равномерной атрофии мышц стоп и голеней еще в детском возрасте (Kalaydjieva L. et al., 2000; Safka Brozkova D. et al., 2017).
Сравнение клинической картины наследственных нейропатий с аутосомно-ре- цессивным и аутосомно-доминантным типом наследования
С целью выявления отличительных клинических признаков исследуемых АР-НН проведена статистическая обработка полученных результатов клинического обследо- вания больных. В качестве групп сравнения выбраны больные аутосомно-доминант- ными формами наследственной нейропатии (НМСН 1А типа и НМСН 2А типа), кото- рые проходили обследование в ФГБНУ МГНЦ им. акад. Н.П. Бочкова.
В связи с предполагаемым ненормальным распределением данных в большин- стве изучаемых групп, а также из-за их малочисленности сравнение возрастных харак- теристик проведено с помощью критерия Краскела-Уоллиса. Попарное сравнение групп выявило, что HINT1-АР-НН статистически значимо манифестирует позже, чем GDAP1-АР-НН и NDRG1-АР-НН, но не отличается по возрасту начала болезни от SH3TC2-АР-НН в силу того, что возраст манифестации SH3TC2-АР-НН широко варь- ирует (рис.3). Таким образом, в группе аксональных АР-НН в случае более позднего дебюта болезни можно предполагать HINT1-АР-НН, но в группе демиелинизирующих АР-НН возраст начала болезни не может служить дифференцирующим признаком.
Рисунок 3. Сравнение исследуемых групп по возрасту дебюта болезни (в годах): 1 – HINT1-АР-НН (n=17); 2 – GDAP1-АР-НН (n=15); 4 – NDRG1-АР-НН (n=9); 5 – SH3TC2-АР-НН (n=12); * — p<0,01. Сравнение HINT1-АР-НН с другими нейропатиями показало, что нейромиото- ния нейромиотония не обнаружена ни у одного больного с другой формой НН и явля- ется исключительным отличительным признаком HINT1-АР-НН. Нейромиотония от- мечена у 82,3% больных HINT1-АР-НН. Не обнаружено ни одного клинического проявления, по которому GDAP1-АР- НН отличалась бы от всех изученных НН. Сравнение SH3TC2-АР-НН с другими формами нейропатий показало, что SH3TC2-АР-НН статистически значимо отличается от всех нейропатий по признаку наличия деформации позвоночника. Этот признак может быть использован при прове- дении дифференциальной диагностике разных форм НН. Клинических признаков, по которым NDRG1-АР-НН отличалась бы от всех изу- чаемых НН, не обнаружено. Единственное отличие от других форм НН — это нацио- нальная принадлежность: все больные NDRG1-АР-НН являются цыганами, а в других группах НН цыгане не представлены. Таким образом, статистическая обработка клинических данных частых форм аутосомно-рецессивных и аутосомно-доминантных НН показала, что для оптимизации диагностики АР-НН с использованием молекулярно-генетических методов исследова- ния необходимо учитывать наличие двух клинических признаков: нейромиотониче- ского феномена и сколиотической деформации позвоночника, поскольку в обследован- ной выборке российских больных с АР-НН, обусловленных мутациями в генах HINT1 и SH3TC2, значимые различия получены только по этим двум клиническим признакам. На основании перечисленных данных и доступности таргетной молекулярно-ге- нетической диагностики разработаны подходы к оптимизации диагностики АР-НН (рис. 4). В представленном алгоритме учтены только те признаки, которые являются статистически значимыми в дифференциальной диагностике нейропатий. Рисунок 4. Подходы к оптимизации диагностики наследственных нейропатий с ауто- сомно-рецессивным типом наследования. Алгоритм диагностики АР-НН применим в случае наличия семейного анамнеза: наличие 2 и более больных детей у здоровых родителей. В основе алгоритма, кроме оценки родословной, лежат клинико-нейрофизиоло- гичексие характеристики. В начале необходимо определиться с типом нейропатии — демиелинизирующий или аксональный. Для этого необходимо знать СРВ по моторным волокнам срединного нерва. В случае СРВ больше 38 м/с, то предполагается аксональ- ный тип НН, если меньше — демиелинизирующий. В случае сочетания у больного аксональной формы нейропатии с нейромиото- нией, то необходимо начинать молекулярно-генетическую диагностику с поиска частой мутации c.110G>C (p.Arg37Pro) в гене HINT1 и при необходимости продолжить поиски мутации прямого автоматического секвенирования по Сенгеру всей кодирую- щей последовательности гена HINT1.
При наличии аксональной нейропатии без нейромиотонии целесообразно прове- сти в начале поиск частой мутации c.715C>T (p.Leu238Phe) в гене GDAP1. При обна- ружении этого варианта на одном аллеле, то необходимо продолжить поиск второго варианта в гене GDAP1 методом прямого автоматического секвенирования по Сенгеру всей кодирующей последовательности гена. В случае отсутствия частой мутации c.715C>T (p.Leu238Phe) рекомендуется исследовать панель генов методом МПС с включением генов GDAP1, MME и SORD.
При выявлении у пробанда цыганского происхождения демиелинизирующей наследственной нейропатии необходимо начать поиск мутации c.442C>T (p.Arg148*) в гене NDRG1. Если мутация не выявлена, то рекомендовано проведение секвенирова- ния экзома или генома.
В случае подозрения на аутосомно-рецессивную демиелинизирующую нейропа- тию у больных нецыганского происхождения, то рекомендовано назначение исследо- вания панели генов методом МПС с включением генов SH3TC2 и FIG4, а также секве- нирование экзома или генома.
ВЫВОДЫ
1. Определена частота гетерозиготного носительства мутаций в генах, ответ- ственных за аутосомно-рецессивные наследственные нейропатии. Наиболее распро- страненными формами в России являются генетические варианты, обусловленные му- тациями в генах GDAP1, HINT1, SH3TC2, FIG4, MME и SORD. Установлена частота носительства мутаций в генах GDAP1 — 1 на 517 человек [95%ДИ 1:1 344–1:216], HINT1 — 1 на 147 человек [95%ДИ 1:564–1:85], SH3TC2 — 1 на 345 человек [95%ДИ 1:2 654–1:162], FIG4, MME и SORD — по 1 на 1034 человек [95%ДИ 1:1 078–1:349]. Рассчитана суммарная частота аутосомно-рецессивных нейропатий, которая состав- ляет не менее 1 на 67 тыс. населения РФ [95%ДИ 1:155 909–1:4 494).
2. На долю аутосомно-рецессивных нейропатий приходится не менее 3,6% за- болеваний этой группы. Показано существование мажорной мутации в гене HINT1 — с.110G>C (р.Arg37Pro) и в гене GDAP1 — c.715C>T (p.Leu239Phe), у больных цыган- ского происхождения в гене NDRG1 — c. 442C>T (p.Arg148*). В других генах, ответ- ственных за аутосомно-рецессивные нейропатии, мажорных мутаций в России не вы- явлено.
3. Среди аксональных нейропатий аутосомно-рецессивных форм больше, чем среди демиелинизирующих (p<0,00001). На долю аутосомно-рецессивных форм среди аксонопатий приходится не менее 14%, а среди миелинопатий — не менее 0,9%. 4. Нейропатии, обусловленные мутациями в генах HINT1 и SH3TC2, имеют клинические и нейрофизиологические особенности, позволяющие заподозрить опреде- ленную генетическую форму нейропатии у больных на этапе клинического и электро- физиологического обследования. 5. Оптимизирована клиническая и молекулярно-генетическая диагностика наследственных нейропатий на основе изученного вклада аутосомно-рецессивных форм в структуре наследственных нейропатий, наличия мажорных мутаций, особенностей клинических проявлений и нейрофизиологических признаков. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. При наличии аксональной нейропатии с нейромиотоническим феноменом рекомендовано первым этапом проводить поиск частой мутации с.110G>C (р.Arg37Pro) в гене HINT1. В случае отсутствия данного варианта нуклеотидной после- довательности в гомозиготном состоянии следует провести секвенирование последо- вательности гена HINT1.
2. В случае обнаружения рано формирующейся деформации позвоночника в сочетании с демиелинизирующей нейропатией у больного, чья родословная не проти- воречит аутосомно-рецессивному типу наследования болезни, высока вероятность об- наружения мутаций в гене SH3TC2. В связи с чем таким больным возможно проведение поиска мутаций в данном гене с помощью диагностических систем, основанных на мультиплексной лиганд-зависимой реакции, или секвенирования ДНК с помощью па- нели, включающей ген SH3TC2.
3. При обнаружении у пробанда признаков аксональной НН без иных специ- фических клинических признаков возможно начинать обследование с секвенирования нуклеотидной последовательности гена GDAP1.
4. У российских пробандов цыганского происхождения с признаками НН в первую очередь следует проводить поиск мажорной мутации c. 442C>T (p.Arg148*) в гене NDRG1.