Молекулярно-генетическая структура гиперфенилаланинемий в Российской Федерации

В период с декабря 2016 года по январь 2018 года в лаборатории ДНК-
диагностики ФГБНУ «МГНЦ» проводилась программа бесплатного генотипирования пациентов с диагнозами «фенилкетонурия» и «гиперфенилаланинемия». В рамках программы проводился поиск 25 частых вариантов гена РАН. За указанный период исследованы образцы ДНК 1263 неродственных пробандов из 51 субъекта России с диагнозами «фенилкетонурия» и «гиперфенилаланинемия». По каждому пациенту лечащими врачами предоставлены данные о возрасте, клинической формы ФКУ или ГФА, данных об уровне ФА в крови и соблюдении диеты. Указанные пациенты внесены в Аудит неонатального скрининга и лечения фенилкетонурии.
Методы исследования
Выделение геномной ДНК проводилось из образцов периферической крови с помощью набора реактивов для выделения Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega, США) по протоколу производителя. Выделение ДНК из сухих пятен крови на фильтровальной бумаге проводилось при помощи набора реактивов DIAtom DNA Prep100 kit (Isogene Lab. Ltd., Россия).
Мультиплексная лигазная реакция (MLPA) для детекции частых точковых замен гена PAH проводилась на амплификаторе МС2 фирмы «ДНК-технология» (Россия) в 2 этапа с последующей визуализацией в полиакриламидном геле (ПААГ).
Метод массового параллельного секвенирования: для поиска редких вариантов разработана пользовательская панель, включающая все известные на сегодняшний день гены, варианты в которых приводят к развитию ГФА с использованием программного обеспечения Ion AmpliSeqTM. Для каждого образца создавалась библиотека с использованием коммерческого набора Ion AmpliSeqTM Library Kit 2.0 (Life Technologies, США) в соответствии с инструкциями производителя. Образцы помечались уникальными баркодами (Ion XpressTM Barcode Adapters Kit, Life Technologies, США), затем объединялись в эквимолярных концентрациях. Подготовка библиотек к секвенированию проводилась в автоматическом режиме на приборе Ion ChefTM (TermoFisher Scientific, США). Массовое параллельное секвенирование

проводилось на приборе Ion S5TM (TermoFisher Scientific, США). Обработка данных секвенирования проведена с использованием стандартного автоматизированного алгоритма, предлагаемого TermoFisher Scientific (Torrent SuiteTM, США) и программного обеспечения Gene-Talk.
Анализ числа копий гена РАН методом MLPA: дополнительно проведен поиск протяженных делеций и дупликаций гена PAH с использованием набора SALSA MLPA P055-050R PAH probemix (MRC-Holland, Нидерланды). Реакция осуществлялась по протоколам фирмы производителя. Полученные данные проанализированы с помощью программного обеспечения Coffalyser V8 предоставляемого компанией-разработчиком MLPA для точного количественного анализа.
Для амплификации исследуемых фрагментов ДНК использовался метод ПЦР. Реакция проводилась на термоциклере МС2 фирмы «ДНК-технология» (Россия) в объеме 25 мкл реакционной смеси следующего состава: по 200μМ каждого нуклеозидтрифосфата; буфер для ПЦР (67 mM Tris-HCl; 16.6 mM (NH4)2SO4; 0.01% Twin-20; рН 8.8); 1 единица активности ДНК-полимеразы Biotaq («БиоМастер»); 0,1-1 мкг геномной ДНК; по 0.25 μМ каждого оригинального олигопраймера; 20 мкл минерального масла.
Визуализация результатов реакций осуществлялась с помощью электрофореза в ПААГ с использованием гель-документирующей системы GelDoc® 2000.
Определение нуклеотидной последовательности проводилось методом прямого автоматического секвенирования по Сэнгеру продукта ПЦР (Sanger F. et al., 1977). Автоматическое секвенирование проводилось с применением набора реактивов ABI Dye Terminator, version 1 (Applied Biosystems) с последующим анализом на приборе 3130 ABI genetic analyzer (Applied Biosystems, США).
Кастомная система MLPA: поиск протяженных делецй гена PTS осуществлялся кастомной системой, в основе которой лежит мультиплексная проба-зависимая лигазная реакция с последующей амплификацией (Multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA), представленная впервые в 2002 году компанией-разработчиком MRC-Holland. Использованы последовательности праймеров для экзонов 1-6 гена PTS и референсных генов.
Статистическая обработка данных осуществлялась с использованием пакетов программ Statistica 10.0 и GraphPad Prism 6.0. Для расчета аллельных частот вариантов, выявленных в гене PAH, в выборке не учитывались аллели с вариантами, обнаруженными в других генах.
Биоинформатический анализ проводился на основе руководства по интерпретации данных последовательности ДНК человека, полученных методами массового параллельного секвенирования (Рыжкова О.П. 2019).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Установление спектра вариантов генов, вовлеченных в развитие ГФА в РФ
Впервые в России проведено масштабное молекулярно-генетическое исследование генов, варианты в которых приводят к развитию гиперфенилаланинемий. Работа проведена с использованием современных методов ДНК анализа. С целью установления спектра вариантов генов, вовлеченных в развитие ГФА проведено генотипирование 1263 неродственных пробандов (2526 хромосом) с диагнозами «фенилкетонурия» и «гиперфенилаланинемия». В рамках программы для каждого пациента проведен поиск 25 частых вариантов в гене РАН. Для тех пациентов, у которых не удалось обнаружить два частых варианта в гене РАН проведен поиск редких вариантов в генах, варианты в которых связаны с развитием ГФА, с использованием метода массового параллельного секвенирования, произведен поиск протяженных делеций и дупликаций в гене РАН. Таким образом, в настоящей работе использованы все доступные методы молекулярно-генетической диагностики.
Поиск 25 частых вариантов гена РАН
Согласно мировым данным самой распространенной формой ГФА является фенилкетонурия. В связи с этим, на первом этапе исследования для 1263 неродственных пробандов проведен поиск 25 частых вариантов гена PAH. К частым вариантам относятся: p.Ser16* (с.47_48delCT), p.Leu48Ser, IVS2+5G>A, IVS2+5G>C, p.Arg111*, IVS4+5G>T, EX5del4154ins268, p.Arg158Gln, p.Asp222* (c.664_665delGA), p.Arg243Gln, p.Arg243*, p.Arg252Trp, p.Arg261Gln, p.Arg261*, p.Glu280Lys, p.Pro281Leu, p.Ala300Ser, p.Ile306Val, p.Ser349Pro, IVS10-11G>A, p.Glu390Gly, p.Ala403Val, p.Arg408Trp, p.Tyr414Cys, IVS12+1G>A. Диагностика осуществлялась методом мультиплексной амплификации лигированных проб. Исследовано 2526 хромосом пациентов. Результаты проведенного исследования представлены в таблице 1. С помощью метода мультиплексной амплификации лигированных проб патогенные варианты выявлены на 2198 (87,0%) хромосомах. Хотя бы один вариант обнаружен у 97,3% пациентов.
Таблица 1. Результаты программы генотипирования по частым вариантам гена РАН.
Число пациентов 969 260 34 1263 Число хромосом 1938 260 328 2526
Проанализированы аллельные частоты искомых вариантов. Результаты анализа представлены в таблице 2. Наиболее распространенным патогенным вариантом является р.Arg408Trp. Данный вариант является самым частым среди российских больных (Gundorova et al. 2019). В исследуемой выборке вариант p.Arg408Trp
Выявлено два варианта в гене РАН
Выявлен один вариант в гене РАН
Частых вариантов не обнаружено
Всего

встречается на 52,3% аллелей. Пациенты с генотипом р.[Arg408Trp];[Arg408Trp] составляют 27,9% выборки (353 человека).
Таблица 1 Частоты 25 частых вариантов гена РАН, зарегистрированные в выборке из 1263 пациентов.
Позиция в кДНК
Позиция в белке
Число хромосом
Аллельная частота (N=2526), %
Остаточная активность ФАГ, %
c.47_48delCT p.Ser16* c.143T>C p.Leu48Ser
c.168+5G>A IVS2+5G>A c.168+5G>С IVS2+5G>C c.331C>T p.Arg111* c.441+5G>T IVS4+5G>T
9 0,4 0 28 1,1 39 10 0,4 0 12 0,5 0 20 0,8 0 31 1,2 0
20 0,8 0
74 2,9 10 43 1,7 0 23 0,9 0 11 0,4 14 41 1,6 0 27 1,1 0 147 5,8 44 38 1,5 2 72 2,9 2 12 0,5 31 12 0,5 39
5 0,2 1 63 2,5 5 19 0,8 62 23 0,9 66
1321 52,3 2 52 2,1 57 85 3,4 0
c.442-2913_509+ 1173del4154ins268 p.Arg158Gln c.664_665delGA c.727C>T c.728G>A c.754C>T c.781C>T c.782G>A c.838G>A c.842C>T c.898G>T c.916A>G
EX5del4154ins268
p.Arg158Gln p.Asp222* p.Arg243* p.Arg243Gln p.Arg252Trp p.Arg261* p.Arg261Gln p.Glu280Lys p.Pro281Leu p.Ala300Ser p.Ile306Val
c.1045T>C p.Ser349Pro
c.1066-11G>A c.1169A>G c.1208C>T c.1222C>T c.1241A>G c.1315+1G>A
IVS10-11G>A p.Glu390Gly p.Ala403Val p.Arg408Trp p.Tyr414Cys IVS12+1G>A
Всего
Изученные варианты являются характерными для стран Европы, однако, их
распространенность в каждом субъекте отличается. На территории России частота этих вариантов также варьирует в зависимости от субъектов. Используемый метод позволил выявить патогенные варианты на 87% хромосом, но этого недостаточно, чтобы установить полный спектр вариантов, характерных для Российской Федерации, а также определить доли других форм ГФА.
Поиск вариантов методом МПС
Особый интерес представляли пациенты, у которых не удалось обнаружить двух частых вариантов в гене РАН, так как высока вероятность выявить варианты в генах, ответственных за развитие ВН4-дефицитных форм ГФА. Для ускорения процесса
2198 87,0 –

поиска спроектирована панель для массового параллельного секвенирования, включающая все известные гены, варианты в которых связаны с развитием ГФА (МПС; next-generation sequencing NGS). Настоящим методом исследованы образцы ДНК 294 неродственных пробандов без двух выявленных частых вариантов гена РАН. Среди них у 260 пробандов ранее выявлен один частый вариант гена РАН в ходе поиска 25 частых вариантов, и у 34 пробандов частых вариантов не выявлено (Таб.1, рис.1). Таким образом, методом массового параллельного секвенирования проведен поиск вариантов на 328 хромосомах без выявленных вариантов.
При анализе 260 образцов ДНК пробандов, имевших один ранее выявленный частый вариант в гене РАН, у 224 пробандов (17,7% всех пробандов) обнаружен второй вариант и подтвержден первый. У 36 пациентов (2,9%) подтвержден первый вариант, второй вариант не выявлен. Проанализированы образцы ДНК 34 пробандов, не имевших частых вариантов гена РАН. Варианты обнаружены у 28 пробандов (рис. 1), среди них у 23 обнаружены варианты в гене РАН, у 5 пробандов – два варианта в гене PTS. У 6 пробандов варианты в исследуемых генах не обнаружены. Из 23 пробандов, у которых найдены варианты в гене РАН, два варианта обнаружены у 15 пробандов, один вариант – у 8 пробандов. Из 328 обследованных хромосом без вариантов на 262 обнаружены варианты в гене PAH, на 10 – варианты в гене PTS, на 56 хромосомах вариантов не выявлено. Методом МПС обнаружено 110 редких вариантов, из них 104 обнаружено в гене РАН и 6 вариантов – в гене PTS. В генах GCH1, PCBD1, QDPR, SPR и DNAJC12 вариантов не обнаружено.
Поиск крупных перестроек методом количественной MLPA
Согласно данным базы HGMD, в генах PAH, PTS, GCH1 и DNAJC12 описаны протяженные делеции, приводящие к гиперфенилаланинемии. Метод панельного высокопроизводительного секвенирования AmpliSeq не позволяет детектировать крупные делеции и перестройки более 10 п.н. В качестве дополнительного метода для поиска крупных делеций использован метод MRC-Holland MLPA. Производитель предоставляет тестовую систему только для количественного анализа гена РАН. Для других генов, представляющих интерес, готовых наборов для поиска крупных перестроек нет. Поиск крупных делеций проводился в гене РАН для пробандов, у которых не установлен диагноз и материал позволял проведение анализа. В ходе проведенной работы у 50 пробандов диагноз не установлен, у 44 из них обнаружен только один вариант в гене РАН, у 6 пробандов вариантов не обнаружено. У 6 пробандов материал оказался непригоден для проведения анализа MRC-Holland MLPA. Таким образом, анализ проведен для 44 образцов ДНК. Из них, протяженные делеции выявлены у 10 пробандов. У этих пробандов имеется одна точковая мутация. Выявлены делеции экзонов 1, 3 и 5, которые встретились 1 раз, 4 раза и 5 раз, соответственно. В литературе описаны протяженные делеции экзонов 1, 3 и 5 гена РАН (Yan и et al. 2016; Desviat et al. 2006; Kozak et al. 2006; Chen et al. 2002; Lu et al. 2011).

Рисунок 1. Результат анализа методом массового параллельного секвенирования для пациентов без установленной молекулярной причиной заболевания.
Для определения границ выявленных протяженных делеций синтезированы праймеры, покрывающие границы описанных в литературе делеций. Определение границ проводилось с помощью секвенирования полученных в результате амплификации фрагментов с известными праймерами. Также, проведен поиск выявленных крупных делеций с помощью амплификации исследуемых фрагментов для 6 пробандов, материал которых не позволил провести поиск крупных делеций методом MRC-Holland MLPA. Установлены границы делеции 5 экзона, обнаруженной в данной работе. Они совпадают с границами делеции Kozak L. (Kozak et al. 2006)- EX5del955 (с.442-102_509+781del). Дополнительно проведен поиск крупных делеций промоторной области гена РАН. Для поиска использовались праймеры на делеции Chen K.J. – с.-4173_-407del3767 (Chen et al. 2002) и Yan Y.S. – с.-4163_-406del3758 (Yan et al. 2016). У одного пробанда обнаружена делеция с.-4161_-404del3758. Выявленная делеция отличается от описанной Yan Y.S. делеции с.-4163_-406del3758 на 2 нуклеотида, однако, это может быть связано с изменением правил номенклатуры наименований крупных делеций.
По итогам проведенной работы крупные перестройки гена РАН выявлены у 11 пробандов. Все эти пробанды имели в генотипе 1 ранее выявленный вариант, таким образом, 11 пациентам диагноз ФКУ подтвержден молекулярно-генетическими методами. У 39 пациентов, включая 6 пациентов материал которых не позволил провести анализ MRC-Holland MLPA, крупные делеции не обнаружены.
Редкие варианты гена РАН
В настоящей работе с использованием всех доступных методов выявлено 108 редких вариантов гена РАН в выборке российских больных. Среди них 10 ранее не описаны в литературе. Все выявленные варианты приведены в тексте диссертационной работы. Обнаружено 10 редких вариантов гена РАН, которые встретились чаще, чем варианты, входящие в систему детекции 25 частых вариантов. В связи с этим возможно редактирование существующей системы детекции частых вариантов для повышения ее эффективности.
Варианты гена РАН обнаружены на 2471 хромосоме (97,8% от всех хромосом). Основная часть выявленных вариантов представлена миссенс-вариантами (82,2%). Варианты сплайсинга составляют 10,1%, небольшие делеции и дупликации 3,2%, нонсенс варианты 3,2%. Крупные перестройки встречаются с частотой 1,3% (рис. 2).
Новые варианты гена РАН
На сегодняшний день в базах данных HGMD и BioPKU описано 1280 вариантов в гене РАН (данные от 4 апреля 2021г.). В ходе исследования выявлено 10 ранее не описанных в литературе вариантов в гене РАН: p.Pro69Thr, p.Leu83Trpfs*9, p.Gln232Pro, p.Cys237Phe, p.Ala300Asp, p.Gly312Ser, p.Thr328Pro, p.Tyr417*, p.Asp435Val и IVS9-1G>C. Клиническая значимость (патогенность) выявленных вариантов оценивалась на основе руководства по интерпретации данных последовательности ДНК человека, полученных методами массового параллельного

Таблица 3. Новые варианты гена РАН
секвенирования (Рыжкова О.П. 2019). Патогенность данных вариантов и критерии патогенности приведены в таблице 3.
Рисунок 2. Спектр вариантов гена РАН. Голубым цветом представлены миссенс- варианты, оранжевым – варианты, влияющие на сплайсинг, серым- небольшие делеции и дупликации, желтым – нонсенс варианты, и темно-синим показаны крупные перестройки.
Вариант
p.Pro69Thr p.Leu83Trpfs*9 p.Gln232Pro p.Cys237Phe p.Ala300Asp IVS9-1G>C p.Glu312Ser p.Thr328Pro p.Tyr417* p.Asp435Val
Число хромосом
1 5 1 1 1 1 1 1 1 2
Критерии патогенности
Патогенность варианта1
PS3, PM2, PP2, PP3 ВП PVS1, PM2, PP3 П
PM2, PP2, PP3, PP4 НЗ PM2, PP2, PP3 НЗ PM2, PM5, PP2, PP3, PP4 ВП
PVS1, PM2, PP3 П PM2, PM5, PP2, PP3, PP4 ВП PS3, PM2, PP2, PP3, PP4 ВП
PS3, PM2, PM4, PP3, PP4 П PM2, PP2, PP3 НЗ
Примечание:1П – патогенный вариант, ВП – вероятно патогенный вариант, НЗ – вариант неопределенного значения.
Для пациентов, в генотипе которых обнаружены вероятно патогенные варианты, а также варианты неопределенного значения, необходимо проведение семейного анализа для уточнения патогенности выявленных вариантов.
ВН4-дефицитные формы ГФА
Наибольший интерес в работе представляли редкие формы ГФА. В России пока не существует системы, направленной на молекулярно-генетическую диагностику редких форм ГФА. Клиническая диагностика редких форм ГФА проводится в качестве дифференциальной диагностики с фенилектонурией и осуществляется методом тандемной масс-спектрометрии. До этого крупных исследований, посвященных определению доли ВН4-дефицитных ГФА на выборке Российских больных, не проводилось. В настоящей работе исследованы все гены, для вариантов в которых установлена связь с развитием ГФА. Среди исследованных генов, обнаружены варианты в гене PTS, которые приводят к развитию ВН4-дефицитной ГФА типа А. В других генах вариантов не обнаружено.
Трое из пяти пациентов, с выявленными вариантами в гене PTS, поступили на исследование с диагнозом «фенилкетонурия», что подтверждает необходимость проведения дифференциальной диагностики до проведения молекулярно- генетического анализа. Все варианты, обнаруженные в гене PTS, представлены в таблице 4 с указанием частот.
Таблица 4. Варианты, выявленные в гене PTS
Позиция в кДНК
c.26G>A
c.94A>G c.108C>G c.146A>G c.216T>A c.317C>T c.(?_26)_(216_?)del
Всего
Позиция в белке p.Arg9His p.Ser32Gly p.Asn36Lys p.His49Arg p.Asn72Lys p.Thr106Met –
Число Аллельная частота, %
Патогенность варианта1
хромосом N=10 2 20 1 10 1 10
1 10
2 20
2 20 1 10
N = 2526
0,08 НЗ 0,04 НЗ 0,04 НЗ 0,04 ВП 0,08 П 0,08 П 0,04 П
0,4%
Примечание:1П – патогенный вариант, ВП – вероятно патогенный вариант, НЗ – вариант неопределенного значения
Вариант p.Ser32Gly, как и патогенные варианты р.Asn72Lys и p.Thr106Met, описан в статье Степановой А.А., где он обнаружен в ходе рутинной диагностики, проводившейся с 2005 по 2006 годы в лаборатории ДНК-диагностики ФГБНУ «МГНЦ» (Степанова А.А. 2006). Однако, данный вариант больше нигде не описан. Вариант p.Asn36Lys описан только в работе Zekanowski у двух сибсов, и относится к вариантам неопределенного значения (Zekanowski et al. 1998). Вероятно патогенный вариант p.His49Arg описан в работе Leuzzi V., в выборке больных ГФА в России ранее не встречался. В данной работе вариант встретился у пациента с патогенным вариантом p.Asn72Lys. Для данного пациента проведен семейный анализ, подтвердивший, что выявленные варианты находятся в транс-положении.
В ходе работы, у пациентов, в исследуемой выборке обнаружены варианты, приводящие к развитию ВН4-дефицитной ГФА типа А. Суммарная аллельная частота данных вариантов составляет 0,4%. Данный показатель гораздо ниже ожидаемого, так
как, согласно литературным данным, ВН4-дефицитные формы составляют 1-2% от всех ГФА в странах Европы (Opladen et al. 2011). Таким образом, доля ВН4- дефицитных ГФА на территории Российской Федерации составляет всего 0,4% и представлена ВН4-дефицитной ГФА типа А. Причиной такой низкой частоты может являться отсутствие накопления ВН4-дефицитных форм в популяции, а также стертые клинические проявления у некоторых форм, не позволяющие заподозрить у пациента диагноз «гиперфенилаланинемия».
Особенности спектра вариантов в различных субъектах в РФ
В лабораторию ДНК-диагностики для исследования направлялись пациенты из различных субъектов России. В данной работе проанализированы данные 1263 неродственных пробандов, направленных на обследование из 51 субъекта. В связи с тем, что субъекты могут отличаться национальным составом населения, проведен анализ особенностей спектра вариантов для каждого субъекта. Возможные особенности можно использовать для создания субъект-специфичных систем диагностики. В настоящее время в некоторых субъектах проводится молекулярно- генетическая диагностика пациентов с ФКУ методом поиска 8 частых вариантов гена РАН (р.Arg158Gln, IVS4+5G>T, р.Arg252Trp, р.Arg261Gln, р.Pro281Leu, IVS10-11G>A, р.Arg408Trp, IVS12+1G>A) или методом поиска патогенного варианта р.Arg408Trp. На анализ направлялись только те пациенты, у которых не удалось выявить двух частых вариантов в гене РАН на уровне субъектов. Для сравнительного анализа частот вариантов и генотипов выбраны субъекты, количество пациентов из которых превышает 15. Данные из 25 субъектов не удалось статистически достоверно проанализировать в связи с недостаточным количеством пациентов. Результаты анализа для 26 субъектов приведены в тексте диссертации.
Дополнительно проведено сравнительное исследование частоты ФКУ среди новорожденных в субъектах РФ. Данные получены из открытого источника – Федеральной Службы Государственной Статистики (Росстат). Наиболее высокая частота ФКУ отмечается в Республике Мордовия (1:4000 новорожденных), реже всего ФКУ встречается в Архангельской области (1:17000 новорожденных). Высокая частота заболеваемости ФКУ отмечается в Центральном федеральном округе (Брянская, Рязанская, Тамбовская и Тульская области), низкая частота – в Северо-Западном федеральном округе (Архангельская, Ленинградская и Мурманская области).
Наиболее частым патогенным вариантом в гене РАН в популяции российских больных является вариант р.Arg408Trp. Он встречается на 1316 хромосомах (52,1% аллелей с вариантами) из 2526. Субъекты с самой высокой частотой р.Arg408Trp– Москва, Нижегородская область, Краснодарский край, Пермская область, Санкт- Петербург и Самарская область. Однако, частота данного варианта может быть выше, так как в лабораторию не направлялись данные о пациентах, имевших в генотипе вариант р.Arg408Trp в гомозиготном состоянии, или два частых варианта. Частоты вариантов сильно варьируют в зависимости от субъекта.
Исходя из полученных данных наиболее эффективной системой диагностики остается поиск 25 частых вариантов гена РАН. Суммарная доля этих вариантов в субъектах варьирует от 75% до 94%, что говорит о применимости системы на всей территории РФ.
Доли потенциально сапротерин-зависимых и сапроптерин- чувствительных пациентов
Для 1258 пациентов с вариантами в гене РАН проведено определение потенциальной чувствительности к сапроптерину. Потенциальная чувствительность каждого пациента определялась по наличию в генотипе «тяжелых» и «мягких» вариантов. При наличии в генотипе пациента двух «тяжелых» вариантов, пациент считается потенциальным «неответчиком». Это обусловлено тем, что при «тяжелых» вариантах остаточная активность фермента ФАГ отсутствует или сильно снижена (менее 10%). В таком случае, введение синтетического аналога ВН4, являющегося кофактором ФАГ не вызовет терапевтического ответа у пациента. Пациенты, в генотипе которых обнаружено два «мягких» варианта считаются потенциальными «ответчиками». Остаточная активность ФАГ при таких вариантах превышает 10% и введение сапроптерина может стабилизировать молекулу ФАГ. Потенциальным ответчикам рекомендуется проведение нагрузочных тестов с использованием сапроптерина для оценки терапевтического ответа и подбора дозы препарата для эффективного лечения. Пациенты, в генотипе которых обнаружен хотя бы один мягкий вариант также относятся к потенциальным ответчикам. Данные об остаточной активности фермента ФАГ при разных вариантах гена PAH приведены в базе данных BioPKU.org. Однако, не для всех вариантов известна их остаточная активность.
В России среди мутантных аллелей гена РАН, выявленных в результате поиска 25 наиболее частых вариантов гена РАН 17 являются тяжелыми и 8 мягкими. Основной вклад в суммарную частоту тяжелых вариантов вносит вариант Arg408Trp. Среди 108 редких выявленных вариантов гена РАН встретился 21 мягкий и 17 тяжелых вариантов. Для 66 вариантов (61,11%) данных об остаточной активности фермента ФАГ в базе данных BioPKU.org не приведено. Среди 318 проанализированных хромосом выявлено 62 аллеля с мягкими вариантами и 56 аллелей с тяжелыми вариантами, для 155 аллелей остаточная активность фермента неизвестна, на 45 аллелях вариантов не обнаружено. В результате, в выборке 2516 хромосом, доля тяжелых вариантов составила 77,4%, а доля мягких – 14,6%. По итогам проведенной работы, исходя из установленных генотипов, 807 пробандов относятся к потенциальным неответчикам, 335 пробандов являются потенциальными ответчиками. Для 116 пробандов рекомендуется проведение дальнейших исследований, так как в их генотипе обнаружены варианты, остаточная активность ФАГ при которых неизвестна (рис. 3).
Рисунок 31. Доли потенциальных ответчиков и неответчиков на лечение ВН4. Усовершенствование протокола ДНК-диагностики у пациентов с ГФА в
РФ
Суммарная аллельная частота повторяющихся редких вариантов, встретившихся в данной работе более 6 раз, составляет 3,4% (таблица 5). Выявлено 10 таких повторяющихся редких вариантов гена РАН.
Таблица 5. Повторяющиеся редкие варианты гена РАН
Вариант
p.Tyr386Cys p.Phe55Leufs*6 p.Ala104Asp p.Pro225Thr p.Arg241Cys IVS1+5G>T p.Leu311Pro p.Ser350Tyr IVS7+1G>A p.Val230Ile Всего
Число выявленных вариантов (хромосом)
10
9
8
7
7
Аллельная частота (%) (N=2516 хромосом) 0,4
0,4
0,4
0,4
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
3,4
Исходя из результатов, полученных в ходе работы, предложен усовершенствованный протокол молекулярно-генетической диагностики ГФА (рис. 4).
На первом этапе проводится поиск частых мутаций в гене РАН. Также, поиск частых вариантов можно проводить в «горячих» экзонах (6, 7, 12) гена РАН, в отсутствие специализированных диагностических систем. Если у пациента обнаружена одна мутация в гене РАН, рекомендуется проведение прямого автоматического секвенирования по Сэнгеру гена РАН. Для пациентов, у которых не найдено частых мутаций в гене РАН, рекомендуется проведение поиска редких вариантов методом массового параллельного секвенирования в генах PAH, PTS, GCH1, PCBD1, QDPR, SPR и DNAJC12. В случае, если, после проведения секвенирования по Сэнгеру или использования метода МПС обнаружена только одна мутация в гене РАН или мутаций не найдено, рекомендуется проведение поиска крупных делеций и дупликаций в гене РАН методом MLPA. Такой протокол позволит точно и своевременно устанавливать молекулярно-генетические причины гиперфенилаланинемии у каждого конкретного пациента, а также сократит экономические затраты на проведение анализов.
Рисунок 4. Предложенный усовершенствованный протокол диагностики ГФА. Цветом обозначено нововведение в существующий алгоритм.

ВЫВОДЫ
1. При исследовании генов PAH, PTS, GCH1, PCBD1, QDPR, SPR и DNAJC12 в выборке российских больных кроме установленных ранее 25 частых вариантов гена РАН обнаружено 114 редких вариантов, на их долю приходится 11,3% от всех хромосом с выявленными изменениями. Из них 108 найдены в гене РАН, 6 – в гене PTS. Обнаружено 10 ранее не описанных вариантов гена РАН. На долю крупных делеций в гене РАН приходится 1,3%. В других исследуемых генах вариантов не обнаружено.
2. Установлена доля ВН4-дефицитных ГФА в РФ, которая составила 0,4% от всех ГФА, это ниже таковой в странах Европы и Азии. ВН4-дефицитные ГФА представлены формой ГФА-ВН4-А, в гене PTS выявлены миссенс-варианты, а также протяженная делеция. Выявлен повторяющийся, ранее неописанный вариант p.Ser32Gly (0,04% выборки всех пациентов), характерный для российских больных.
3. Данные спектра вариантов, полученные в ходе анализа образцов из 51 субъекта России, показали, что основной причиной развития гиперфенилаланинемий во всех исследованных субъектах являются патогенные варианты в гене РАН (99,1% пациентов). Система поиска 25 частых вариантов в гене PAH эффективна (информативность 89%) для всех изученных субъектов РФ.
4. Доля потенциально сапроптерин-чувствительных пациентов на основании полученных генотипов в гене РАН составила 27%, что ниже, чем в европейских странах. Доля пациентов, потенциально не отвечающих на терапию – 64%. Рекомендовано назначать нагрузочное тестирование препаратами ВН4, если не удалось установить потенциальную чувствительность после проведения поиска 25 наиболее частых вариантов гена PAH.
5. Предложен усовершенствованный алгоритм молекулярной диагностики ГФА, включающий в себя последовательное проведение поиска частых вариантов гена PAH, поиск крупных перестроек методом MLPA, а также поиск вариантов последовательности ДНК методом массового параллельного секвенирования во всех известных генах, ответственных за ГФА.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Для всех новорожденных, с повышенным содержанием фенилаланина в крови, рекомендовано проведение дифференциальной диагностики с редкими формами гиперфенилаланинемий.
2. В качестве основного метода молекулярно-генетической диагностики ГФА в России рекомендовано использование системы детекции 25 частых вариантов гена РАН.
3. Использование метода МПС рекомендовано только при отсутствии у пациентов вариантов гена РАН, в остальных случаях рекомендовано проведение прямого автоматического секвенирования по Сэнгеру гена РАН, а также поиск крупных перестроек.
4. Пациентам, в генотипе которых выявлен хотя бы один «мягкий» вариант, или вариант с неизвестной остаточной активностью фермента ФАГ, рекомендуется
проведение нагрузочного тестирование фармакологическими аналогами фермента ВН4.