Морфофункциональная характеристика большого сальника при опухолевом поражении яичников

Материалы и методы исследования
Объектом исследования служили большие сальники пациенток с опухолевым
поражением яичников (40 – II стадия, 64 – IIIа стадия). Материал для морфологических
исследований был предоставлен патолого-анатомическим отделением Государственного
автономного учреждения здравоохранения Министерства здравоохранения Республики
Башкортостан «Республиканский клинический онкологический диспансер» г. Уфы. (ГАУЗ
РКОД МЗ РБ (главный врач д.м.н., проф. Измайлов А.А.).
В состав исследований выборки вошли 104 пациентки, проходившие лечение в VIII
хирургическом отделении (онкогинекология) Государственного автономного учреждения
здравоохраненияМинистерстваздравоохраненияРеспубликиБашкортостан
«Республиканский клинический онкологический диспансер» г. Уфы. Отбор пациенток для
участия в исследовании проводился в соответствии со следующими критериями
включения:
– гистологически подтвержденный диагноз низкодифференцированного рака яичников II
стадии (без метастазов в большом сальнике) и IIIa стадии (с метастазами в большом
сальнике);
– возраст от 50 до 65 лет.
Критерием исключения являлось проведение химио- или радиотерапии до операции.
Выполненная работа с этических позиций одобрена решениемлокального
этического комитета Оренбургского государственного медицинского университета
(Протокол № 268 от 19 февраля 2021 года).
Исследовали фрагменты сальника без метастатического поражения и с метастазами
опухоли, прилежащие к опухоли участки сальника. В работе использовались архивные
истории болезни.
Формирование групп исследований
Для изучения морфологических характеристик большого сальника в условиях опухолевого
поражения рака яичников были сформированы 2 группы, в соответствии с отсутствием (II
стадия) или наличием (IIIa стадия) метатстатического поражения большого сальника
(таблица 1).
Таблица 1
Количественная характеристика исследуемых групп случаев рака яичников II и IIIa
стадий
Уровень поражения большого сальникаКоличество случаев
Все случаи104

Большой сальник без метастазов (II стадия)40
Большой сальник с метастазами (IIIа
стадия)

Для изучения морфологических изменений в тканях большого сальника,
пораженного метастазами, была сформирована дополнительная группа в соответствии с
наличием или отсутствием лейкоцитарного вала вокруг метастатического очага (таблица
2).
Таблица 2
Количественная характеристика исследуемых групп случаев рака яичника IIIa
стадии
Уровень реактивных изменений в тканяхКоличество случаев
большого сальника

Все случаи64

Большой сальник с лейкоцитарным валом
вокруг метастатического очага
Большой сальник без лейкоцитарного вала
вокруг метастатического очага

Методы исследования

Операционный материал фиксировали в 10 %-ном нейтральном формалине,
обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и заливали в парафин. Из
парафиновых блоков готовили серийные срезы толщиной 5–7 мкм на микротоме Accu-Cut
SRM 200 (Сакура, Нидерланды). При приготовлении пленочных препаратов опускался этап
заливки в парафин и депарафинирования (Коржевский Д.Э., Гиляров А.В..2010).
Гистологические методы окрашивания
Гистологическое исследование проводилось на парафиновых срезах и пленочных
препаратах. Гистологические препараты всех групп окрашивали гематоксилином Майера и
эозином. Для выявления структуры микроциркуляторного русла использовали
микропрепараты сальника, импрегнированные серебром (Артишевский А.А.,1999;
Горчаков В.Н.,1997; Семченко В.В. и соавт. 2006). Для фотосъемки микропрепаратов,
окрашенных гематоксилином и эозином, применялся микроскоп-микровизор mVizo-103,
микроскоп МИКРОМЕД 3 с фотокамерой DTM 510 (АО «Ломо», Россия), увеличение 100,
200, 400. При морфометрическом исследовании определялись форма большого сальника,
его длина и ширина, а также площадь. Линейные размеры органа определялись обычной
линейкой с точностью до 1 мм. Площадь сальника определялась планиметрическим
методом. Для этого использовалась планиметрическая сетка, представляющая собой лист
прозрачной пластиковой пленки, на который были нанесены горизонтальные и
вертикальные линии с периодом 1 см (Автандилов Г.Г., 1990). При определении площади
сальник расправлялся на ровной горизонтальной поверхности, сверху накладывалась
планиметрическая сетка, и по ней велся подсчет ячеек сетки. Площадь ячеек сетки,
полностью умещавшихся в границах сальника, принималась за 1 см2,, а площадь ячеек,
пересекавшихся границами сальника (независимо от места пересечения ячейки), – за 0,5 см2
(Автандилов Г.Г., 1990). Площадь большого сальника определяли как сумму площадей
целых и пересеченных ячеек. Велся подсчет количества млечных пятен на единицу
площади.
Измерения размеров лимфоидных образований сальника проводились на
парафиновых срезах толщиной около 7 мкм, окрашенных гематоксилином и эозином на
х100. Измеряли длину млечного пятна. Также оценивали количество лимфоцитов в поле
зрения х200 на удалении от опухоли; количество лимфоцитов в поле зрения х200 на границе
с опухолью; наличие лимфоцитарного вала на границе с опухолью.
Для морфометрической оценки исследуемых структур применяли визуальный
подсчет клеток. Для подсчета размерных характеристик сосудов использовали пленочные
препараты, импрегнированные серебром.

Иммуногистохимические методы исследования
Иммуногистохимические исследования осуществляли на парафиновых срезах
толщиной 4 мкм. Окраску проводили на автоматизированном иммуногистостайнере для
иммуногистохимии Ventana BENCHMARK XT(США) с применением первичных
мышиных моноклональных антител.
Для определения пролиферации ядер клеток использовались мышиные
моноклональные антитела Ki67 («Diagnostic BioSystems», США, клон MMI same as MB67)
(Сазонов С.В. и соавт.2017). Определение экспрессии проапоптотического фактора белка
Р53 осуществлялось с помощью мышиных моноклональных антител к человеческому
антителу Р53, клон DO-7, в разведении 1:100 («Diagnostic BioSystems», США).
Для выявления клеток лимфоидного ряда в тканях большого сальника во всех
группах использовали маркер Т-хелперов моноклональное мышиное антитело к
человеческому CD4 клон 1f6 («Diagnosis BioSystems», США), в разведении 1:30; маркер
популяции Т-лимфоцитов моноклональное мышиное антител к CD7, клон СВС.37
(«Diagnostic BioSystems», США), в разведении 1:10; маркер Т-киллеров моноклональное
мышиное антитело к человеческому CD8 клон 144В («Diagnostic BioSystem», США), в
разведении 1:50; маркер макрофагов моноклональные мышиные антитела к человеческому
CD68 , клон Кр-1 (Cell Marque, США), в разведении 1:20; ( Иванцов А.О., Мацко Д.Е.,2011)
Для исследования ангио- и лимфоангиогенных процессов, происходящих в
эндотелиоцитах сосудов тканей большого сальника в условиях опухолевого роста
использовали моноклональныемышиные антитела к человеческим эндотелиальным
клеткам CD34, клон QBEND/10 («Diagnostic BioSystems», США), в разведении 1:50;
моноклональное мышиное антитело к человеческому сосудистому фактору роста
эндотелиоцитов VEGF, клон VG1(«Diagnostic BioSystem», США), в разведении 1:10;
моноклональное мышиное антитело к человеческому D2-40, клон D2-40, («Dako», Дания) в
разведении1:100 (Zhao D.,2008).
Для выяснения процессов адгезии опухолевых клеток на мезотелиоцитах,
энтотелиоцитах тканей большого сальника исследовали маркеры молекул адгезии клетки
спомощьюмоноклональныхмышиныхантителкинтегральному
клеточному гликопротеину CD44, клон 156-3С11 («Diagnostic BioSystems» США) в
разведении 1:50; моноклональные мышиные антитела к молекуле клеточной адгезии E-cad,
клон 36 («BioGenex» ,Нидерланды), в разведении 1:20; моноклональное мышиное антитело
к человеческому гликопротеиду IIIа тромбоцитов CD61,клон Y2/51 (Diagnostic BioSystems
США), в разведении 1:100; Докраска проводилась гематоксилином в автоматическом
режиме.Для оценки результатов использовался световой микроскоп «Nikon Eclipse E400»
при увеличении x400 и видеосистемы «TauVideo» с программой «Тау Морфология» на
основе видеокамеры «Watec 221s». Количество клеток, позитивно окрашенных (P53, Ki67,
CD4, CD7, CD8, CD68, CD34, D2-40, VEGF, CD44, E-cad, СD61) подсчитывали на
микрофотоснимках при увеличении x400.
Электронная микроскопия
Подготовка и исследование больших сальников с помощью сканирующего
электронного микроскопа производилась согласно общепринятым методикам (Гоулдстейн
Дж., Яковиц Х., 1978). С помощью установки «Fine coat Ion sputter JFC 1100» (JEOL,
Япония) исследуемые образцы, фиксировали раствором 2,5 % глутаральдегида, подвергали
сушке и очистке поверхности. Затем в этой же установке производили вакуумное катодное
напыление на исследуемую поверхность образцов токопроводящего материала (тяжелых
металлов). Микроструктура поверхности полученных образцов исследовалась на
сканирующем растровом электронном микроскопе Tescan Vega-3SBH с вольфрамовым
термокатодом при увеличении (пр-во Чехия).
Атомно-силовая микроскопия
Для определения структуры поверхности большого сальника применяли метод
атомно-силовой микроскопии (АСМ) (Плескова С.Н.,2011; Шарафутдинова Л.А. и
соавт.,2018; McKenzie et al., 2018). Помимо определения механических характеристик,
данный метод позволяет получить изображения биологических образцов с высоким
разрешением (Stylianou et al., 2019).
Подготовка образца заключалась в выделении фрагмента большого сальника и
закреплении его на поверхности предметного столика. В качестве материала для
проведения исследования использовались фрагменты большого сальника, полученные
после оперативного вмешательства по поводу новообразования яичников. Из полученных
фрагментов нарезались кусочки размером 5 мм, специальная подготовка для визуализации
поверхности большого сальника не требовалась (Бахтизин Р.З., 2000). В зависимости от
фрагмента толщина его варьировала от 1 до 2 мм. В течение 2 часов материал доставляли в
лабораторию и микроскопировали, предварительно промыв в дистиллированной воде.
Исследования проводились с помощью сканирующего зондового микроскопа СММ-
2000-15Е (г. Зеленоград, «ПРОТОН-МИЭТ»). Применялась контактная мода атомно-
силовой микроскопии (АСМ) в режиме постоянной силы. Максимальное поле
сканирования 30×30 мкм. Наиболее светлые участки на АСМ-изображениях
соответствовали возвышенностям рельефа поверхности образца. Наиболее темные участки
соответствовали углублениям рельефа поверхности образца. При измерении размеров
структурных единиц корректирующие фильтры не использовались. Далее к изображениям
применялась функция повышения контрастности с целью детализации строения
поверхности образцов. По обработанным таким образом изображениям производился
расчет диаметра структурных единиц. Влияние шага сканирования и радиуса кривизны
зонда (частицы диаметром от 5 до 20 нм) учитывалось при расчетах и вычиталось из
конечного графика распределения частиц по диаметру. Использовали сканирующий
зондовый микроскоп, зонды с жесткостью 0,3 Н/м, радиус закругления кончика зонда
составлял 50 нм (способ сканирования в воздушной фазе в полуконтактном режиме). В
частности, по полученным изображениям были определены: среднеарифметическое
отклонение рельефа, что соответствует среднеарифметической шероховатости Ra и
среднеквадратичная шероховатость Rq.
Методы статистической обработки данных
Статистическую обработку данных производили в пакете прикладных программ
STATISTICA V.7.0 («StatSoftInc», США). Вид распределения признаков в группах
оценивали с помощью критерия Шапиро-Уилка (Гланц С., 1998; Реброва О. Ю., 2000; Ланг
Т.А., Сесик М., 2011). Сравнение данных, подчиняющихся закону нормального
распределения, проводили с помощью параметрических методов (t-критерий Стьюдента), в
противном случае – непараметрического критерия (U-критерий Манна-Уитни для парных
сравнений). Различия считали статистически значимыми при p<0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Изучение большого сальника больных II и IIIа стадией рака яичников показало, что большие сальники, поражённые метастазами, имели меньшие размеры, по сравнению с сальниками, не имеющими метастазов (таблица 3). Таблица 3 Морфометрические показатели большого сальника без метастазов и пораженного метастазами Большой сальник без Большой сальник с метастазами Размерметастазов M+mM+m Длина (см)22,4+2,69,4+3,0* Ширина (см)37,8+3,731,7+5,8 Площадь (см ) 831,4+23,9450,5+23,9* Примечание: * – статистически значимые различия по сравнению с контрольной группой (p<0,001). Диаметр сосудов микроциркуляторного русла большого сальника с метастазами был выше (таблица 4). Таблица 4 Размеры капилляров в большом сальнике с метастазами и без метастазов ПоказательБольшой сальникаБольшой сальник ср без метастазовметастазами M±mM±m Размер капилляра,p<0,001 10,13±0,7718,41±1,50* мкм Также изменяются плотность и размеры млечных пятен, содержащихся в большом сальнике. Плотность млечных пятен в большом сальнике, пораженном метастазами, по сравнению с большим сальником без метастазов была меньше (Таблица 5). Размеры млечных пятен в большом сальнике с метастазами менялись в сторону уменьшения. Таблица 5 Морфометрия млечных пятен в разных отделах большого сальника при опухолевом поражении яичников Верхне-Нижне-Верхне- Нижне-левый Сальникв Показательправыйправыйлевый квадрантцелом квадрант квадрантквадрант Плотность млечных пятен на 1 см2 в сальнике 5,0+1,15,4+0,96,4+0,87,2+0,75,7+1,0 безметастазов (n=40) Плотность млечных пятен на 1 см2 в сальнике с 1,0+0,21,3+0,21,4+0,21,4+0,31,2+0,2* метастазами(n=64 ) Площадь млечного пятна в сальникебез 3,09+6,04 3,73+6,263,05+6,243,05+5,553,07+6,03 метастазов(n=40) (мм2) Площадь млечного пятна в сальникес 1,29+2,83 1,35+3,211,33+2,241,22+2,551,32+2,8* метастазами(n=64 ) (мм2) Примечание *– p<0,001. В 66 процентах случаев в большом сальнике вокруг метастаза формируется лейкоцитарный вал. В составе лейкоцитарного вала преобладали лимфоциты и макрофаги. Наличие лимфоцитов и макрофагов подтверждено иммуногистохимическими исследованиями. В очаге метастаза определялись клетки аденокарциномы, лимфоциты, макрофаги, эндотелиоциты. Наши наблюдения показали, что в 42 образцах больших сальников с метастазами вокруг очага формируется лейкоцитарный вал, при этом в других участках этих же образцов, млечные пятна редуцированы, а их клеточный состав истощен. В остальных 34 процентах образцов большого сальника с метастазами лейкоцитарный вал вокруг очага не сформировывался или отсутствовал, вместе с тем, отмечалась редукция и клеточное истощение млечного пятна (Рис.1). В результате ИГХ исследования большого сальника без метастазов и с метастазами на экспрессию клетками белка ki67 и Р53 было выявлено, что в большом сальнике без метастатического поражения, число клеток, экспрессирующих маркеры пролиферации и апоптоза, было снижено, по сравнению с большим сальником с метастатическим поражением (таблица 6). В метастатическом очаге на фоне экспрессии Р53 наблюдалась экспрессия белка ki67, что говорит о нарушении механизмов регуляции апоптоза в клетках и агрессивность опухоли. АБ Рис.1.Большой сальник с участками метастазов. Окраска гематоксилином Майера и эозином. Ув.100х. А-фрагмент большого сальника с метастазами без лейкоцитарного вала вокруг метастатического очага. Б-фрагмент большого сальника с метастазами и лейкоцитарным валом вокруг метастатического очага. Таблица 6 Морфометрические показатели количества клеток, экспрессирующих проапоптотический белок Р 53 и протеин ki 67 в большом сальнике без метастазов и с метастазами Большой сальник безБольшой сальник с Маркерыметастазовметастазамир M±mM±m p53162,0±21,3280,3±17,95*р<0,05 ki-67113,6±6,9148,0±13,4*р<0,05 Проведенное исследование на основе ИГХ окрашивания большого сальника с метастазами и без метастазов, с использованием маркеров CD8, показало, что количество CD8+ клеток в большом сальнике с метастазами составило 75,00±12,82, что не имело статистически значимых различий по сравнению с контрольной группой, где количество CD8+ клеток составляло 46,88±33,11. Количество клеток, экспрессирующих CD7, по нашим данным, достоверно выше в сальнике с метастазами в 1,7 раз, число клеток экспрессирующих на своей мембране маркер Т-хелперов CD4+ было ниже. Также в большом сальнике с метастазами число клеток, позитивно окрашенных маркером CD68, было выше, по сравнению с большими сальниками, в котором отсутствуют метастазы (Рис.2) (таблица 7). АБ Рис.2 Большой сальник при опухолевом поражении яичников. ИГХ реакция с антителами CD68 (клон Kp-1; Cell Marque.США) А- без метастатического поражения. Б- с метастатическим поражением. Увеличение х 400. Таблица 7 Морфометрические показатели количества клеток, экспрессирующих белки CD7 и CD68 в большом сальнике без метастазов и с метастазами Большой сальникБольшой сальник с Параметрыбез метастазовметастазамир Ме(Q1-Q3)Ме(Q1-Q3) CD710,00(9,00–10,00) 16,50(16,00-17,00)0,001** CD6829,00(17,00-30,00) 36,00(35,00-37,00)0,0005*** Это может свидетельствовать о сохранении функции цитотоксических лимфоцитов (CD8), усилении функции натуральных киллеров (CD7), увеличении количества клеток макрофагального ряда (CD68) и ослаблении работы хелперов (CD4). При исследовании лимфоангиогенных процессов в большом сальнике в условиях опухолевого роста, отмечено что, число VEGF+, количество CD34+ и количество D2-40+ эндотелиоцитов в сальнике с метастазами превосходило число позитивно окрашенных аналогичными маркерами клеток в большом сальнике без метастазов. Исследование процессов адгезии опухолевых клеток на структурах большого сальника путем иммуногистохимического исследования маркерами молекул адгезии клетки CD44, CD61, E-cad показало, что в не поражённых метастазами больших сальниках клетки практически не экспрессировали маркер CD44. В основном эти клетки выявлялись в большом сальнике с метастазами. Сравнение полученных результатов подтвердило, что число клеток с экспрессией белка CD44 при опухолевом поражении большого сальника значительно превосходит, число таких клеток в сальнике без метастатических поражений. CD61+ клеток, в большом сальнике с метастазами оказалось в 3 раза выше по сравнению с количеством CD61+ клеток в сальнике без метастазов. Также численность клеток с экспрессией белка Е-кадгерина превосходила в больших сальниках, в которых наблюдались метастазы. Экспрессия маркера Е-кадгерина наблюдалась во всех клетках опухоли или в фокусах опухолевых клеток. (Рис.3). АБ Рис.3 A Морфометрические показатели количества эндотелиоцитов, экспрессирующих маркеры ангиогенеза D2-40, VEGF, CD34 в большом сальнике без метастазов и в большом сальнике с метастазами. Б. Сравнительная характеристика количества эндотелиоцитов, экспрессирующих маркеры молекул адгезии СD44, E-кадгерин, CD61 в большом сальнике без метастазов и в большом сальнике с метастазами Для исследования больших сальников с метастатическим поражением( n=64), нами были сформированы 2 группы. В первую группу были включены большие сальники с лейкоцитарным валом, сформировавшимся вокруг метастатического очага, во вторую – сальники без лейкоцитарного вала вокруг метастатического очага. Количественный анализ показал преобладание CD8+ клеток в группе больших сальников с лейкоцитарным валом. Число клеток, экспрессирующих белок CD7 в большом сальнике с метастазами без лейкоцитарного вала вокруг него было достоверно ниже, по сравнению с сальниками, где сформировался лейкоцитарный вал вокруг метастаза ( таблица 7). Снижение содержания клеток Т- лимфоидного ряда, а именно CD8+, CD7+ приводит к истощению лимфоидной ткани, способствуя опухолевому росту и снижению выживаемости. Число VEGF+ клеток, выше в большом сальнике, где нет четкого сформированного вала вокруг метастаза по сравнению с сальником, где определялся вал вокруг метастаза. Численность позитивных CD34 клеток в большом сальнике без лейкоцитарного вала превышала группу сравнения в два раза. При сравнении двух групп, выявлено статистически значимое превосходство численности клеток, экспрессирующих белок D2- 40, в большом сальнике без клеточного вала. При количественном анализе иммуногистохимического окрашивания большого сальника с метастазами на выявление клеток, экспрессирующих маркеры молекул адгезии, таких как Е-кадгерины, CD44, CD61 выявлено, что статистически значимые различия в группах были только в отношении CD44. Подсчет количества клеток, экспрессирующих CD44 показал, что в группе, в которой образовывался лейкоцитарный вал вокруг метастатического очага, число этих клеток было ниже (Рис 4). АБ Рис 4. А. Сравнительная характеристика количества клеток экспрессирующих маркеры ангиогенеза D2-40, VEGF, CD34 большом сальнике с наличием лейкоцитарного вала вокруг метастатического очага. Б. Сравнительная характеристика количества клеток экспрессирующих маркеры молекулы адгезии клетки CD44 большом сальнике с наличием лейкоцитарного вала вокруг метастатического очага большого сальника без лейкоцитарного вала вокруг метастатического очага. В результате проведённого нами ультраструктурного анализа показано, что основу плотной соединительной ткани серозной оболочки большого сальника составляют коллагеновые фибриллы. Их пучки существенно различаются по толщине и ориентированы в различных направлениях. При этом плотность распределения пучков вариабельна в разных участках сальника. В серозной оболочке имеются участки, в которых соединительнотканная основа истончена, в этих участках наблюдаются отверстия(стигматы), которые способствуют обмену жидкости между сальником и перитонеальным пространством. Наибольшее число таких отверстий выявляется в области так называемых млечных пятен сальника, которые ассоциируются с лимфоидной тканью. Согласно нашим данным в серозной оболочке большого сальника размеры этих отверстий варьируют в пределах от 2,5 мкм до 25 мкм. Более рыхлое расположение коллагеновых фибрилл и наличие отверстий разного размера в соединительной ткани серозной оболочки определялось в сальнике, не поражённом метастазами. Тогда как в сальнике с метастазами расположение коллагеновых волокон было более плотным. Поскольку эти отверстия представляют собой промежутки между пучками коллагеновых волокон, отверстия эти, очевидно, являются непостоянными образованиями и могут формироваться в любых участках серозной оболочки. Различия в диаметре этих отверстий обусловлены величиной транспорта жидкости и клеток через них, то есть со степенью их функциональной активности. Различный диаметр отверстий, очевидно, является отражением разных по времени стадий формирования и закрытия этих структур. Нами не было выявлено закономерности в распределении этих отверстий между участками сальника без метастазов и околоопухолевыми участками. Анализ электронограмм показал, что эти отверстия позволяют перемещаться из сальника в перитонеальное пространство и обратно не только жидкости, но также и различным клеткам (как Т-лимфоцитам, так и опухолевым клеткам). Расположение фибриллярных структур в непоражённых метастазами участках сальника было более рыхлым по сравнению с участками с метастазами и околоопухолевыми участками (Рис.5). В связи с этим, формирование отверстий между коллагеновыми пучками в условиях метастатического поражения происходит хуже, это может приводить к нарушению перемещений клеточных элементов иммунной системы в этих участках серозной оболочки. Более плотное расположение коллагеновых фибрилл в участках с наличием метастазов может способствовать высокой адгезии опухолевых клеток, что подтверждается большим количеством клеток с экспрессией CD44 – одного из маркеров клеточной адгезии. На АСМ-изображениях поверхность большого сальника, не пораженного метастазами, выглядит однородной и гладкой. Исследование поверхности пораженного метастазами большого сальника выявило структурную неоднородность и сложный характер микрорельефа, отличающегося наличием крупных гранул, округлых или бугристых выпячиваний. Для количественной оценки обнаруженных изменений микрорельефа поверхности большого сальника были рассчитаны параметры шероховатости, а именно, Rq - среднеквадратичная шероховатость, Ra- среднеарифметическая шероховатость. Наши результаты показали, что исследуемые показатели шероховатости поверхности большого сальника при раке яичника III стадии значительно выше, чем при II стадии рака яичников. АБ Рис.5. А- Поверхность деэпителизированного участка серозной оболочки не поражённого метастазами большого сальника в области млечного пятна. Фотография демонстрирует рыхлое расположение коллагеновых фибрилл и наличие отверстий разного размера в соединительной ткани серозной оболочки. Б- Фрагмент деэпителизированной поверхности серозной оболочки большого сальника с метастазами рака яичников в большой сальник. Фотография демонстрирует перемещение клетки через отверстие в серозной оболочке большого сальника. Таким образом, в большом сальнике в условиях опухолевого роста рака яичников происходят адаптивные и реактивные изменения. В проведенном нами исследовании количество млечных пятен выше в большом сальнике при II стадии рака яичников, снижается при III a стадии. Однако, в 66 процентах случаев при III a стадии рака яичников формируется лейкоцитарный вал, что свидетельствует о адаптогенных свойствах большого сальника. По мнению авторов, первоначально колонизация большого сальника опухолевыми клетками вызывает увеличение млечных пятен, путем рекрутирования макрофагов из перитонеальной полости, но раковые клетки продолжают расти, что может быть обусловлено дефектом в иммунном распознавании или иммунносупрессивным эффектом (Martinez F.O., Gordon S.,2014;Liu J. et al.,2016). В большом сальнике с метастазами увеличивается число клеток, экспрессирующих белки CD7 и CD68, уменьшается количество клеток, экспрессирующих CD4, по сравнению с большим сальником без метастазов, что ведет к изменению функционирования Т- и В- лимфоцитов. С одной стороны, большой сальник оказывает противоопухолевый эффект, который проявляется в увеличении CD7 Т-лимфоцитов, с другой стороны, уменьшение количества CD4 Т-лимфоцитов и свидетельствует о нарушении работы Т- и В- лимфоцитов (Rangel- Moreno J.,2009; Martinez F.O., Gordon S.,2014; Carroll M.J.,2018). Уменьшение числа макрофагов, экспрессирующих белок CD68, снижает колонизацию тканей большого сальника опухолевым клетками (Krishnan V., 2020), а увеличение количества этих клеток, может указывать на прогрессию заболевания. По данным авторов это связано со способностью макрофагов высвобождать факторы роста, хемокины, ферменты регулирующие ангиогенез, инвазию и метастазы. (Martinez F.O., Gordon S.,2014; Carroll M.J.,2018). В большом сальнике с метастазами увеличивается число эндотелиоцитов, экспрессирующих маркеры ангио-, лимфангиогенеза CD34, VEGF, D2-40. Возможно, это связано с тем, что макрофаги мигрируют в ткани большого сальника через кровеносные сосуды, благодаря выделению хемоаттрактантов опухолевого происхождения, к которым относится VEGF, способствуя стимуляции опухолевого ангиогенеза и прогрессированию опухолевого процесса. В литературе имеются данные, согласно которым солидные опухоли обладают способностью вызывать гипоксию в тканях, которая приводит к накоплению белка HIF1, инициирующего синтез VEGF. (Wong C.W. et al., 2012; Sopo M. et al., 2019; Janiszewska M. et al., 2020). Метастатические опухолевые клетки преимущественно локализуются в тканях большого сальника, богатых проангиогенными сосудами, развитие которых стимулируется ангиогенными факторами, синтезируемыми мезотелиоцитами большого сальника (Gerber S.A. et al.,2006), кроме того, VEGF стимулирует выработку эндотелиоцитами молекул адгезии Ig-CAM, которые являются поверхностными лигандами для интегринов (Wong C.W. et al., 2012;) Возможно с этим связано, что количество клеток, экспрессирующих маркеры молекул адгезии СD44 (хоуминг- ассоциированные молекулы клеточной адгезии) и CD61 ( интегрин бета-3) выше в большом сальнике с метастазами, по сравнению с большим сальником без метастазов. Полученные нами данные согласуются с данными авторов, доказавших, что выраженная экспрессия CD44 неопластическими клетками связана с опухолевой инвазией, миграцией и ангиогенезом (Paschos K.A., et al., 2010). В большом сальнике с метастазами увеличивается количество клеток, положительно окрашенных маркером клеточной адгезии E-cad. Полученные нами данные подтверждает гипотезу авторов, утверждающих, что при эпителиальной карциноме яичников экспрессия Е-кадгерина повышается и связано это с тем, что раковые клетки могут мигрировать скоплениями, что характерно для более агрессивного течения опухолевого процесса (Sundfeldt K, Piontkewitz Y et al.,1997; Sundfeldt K. , 2003; Imai T, Horiuchi A, et al., 2004). В 66 процентах случаев развиваются компенсаторно- приспособительные реакции в большом сальнике пациенток с III a стадией рака яичников виде образования лейкоцитарного вала вокруг метастатического очага. Это проявлялось увеличением числа клеток, экспрессирующих белки CD 7 и CD8. Наши данные согласуются с данными авторов, показывающих в своих исследованиях, что присутствие CD8 Т- лимфоцитов в тканях большого сальника ассоциируется с лучшей выживаемостью, а отсутствие инфильтрации опухоли Т-лимфоцитами приводит к неэффективности лечения (Sato E.,2005; Wouters M.C.,2016). Низкое количество CD4 лимфоцитов в тканях большого сальника вокруг метастатического очага, может указывать на нарушение функционирования Т- и В- лимфоцитов. По мнению авторов, CD4+ лимфоциты способны рекрутировать и активировать другие клетки, как макрофаги, дендритные клетки, В- лимфоциты и другие Т- лимфоциты и количество этих клеток коррелирует с положительным прогнозом Pinto M.P., et al.,2018; Van der Meer J.M.R., et al.,2020). Число эндотелиоцитов, экспрессирующих белки-маркеры ангиогенеза и лимфангиогенза CD34, VEGF, D2-40 и число эпителиоцитов и клеток аденокарциномы яичников, экспрессирующих белок маркер молекулы адгезии клетки CD44, выше в большом сальнике, вокруг метастатических очагов которых лейкоцитарный вал отсутствует. Результаты исследования свидетельствуют о значительной пластичности и реактивности большого сальника в условиях опухолевого процесса в организме. Однако, наличие выраженной пролиферативной активности опухолевых клеток в метастазах опухоли указывает на то, что этих адаптивных возможностей недостаточно для противостояния инвазии опухоли в большой сальник. ВЫВОДЫ 1.При метастазировании рака яичников в большой сальник в метастатических очагах органа в 1,3 раза повышается количество клеток, экспрессирующих белок Ki67, и в 1,75 раз увеличивается количество клеток, экспрессирующих белок P53, по сравнению с большим сальником без метастазов. Высокое количество клеток, экспрессирующих белок Ki67, на фоне высокого содержания клеток, экспрессирующих Р53, говорит об агрессивности опухоли и о нарушении регуляторных механизмов апоптоза. 2.В случаях с метастатическим поражением большого сальника при раке яичников количество клеток, экспрессирующих маркеры популяции Т-лимфоцитов CD7 и маркеры макрофагов CD68, показывает статистически значимое увеличение, количество клеток Т- хелперов, экспрессирующих CD 4, ниже, по сравнению с количеством Т-хелперов в большом сальнике без метастазов. Количество клеток, экспрессирующих маркеры цитотоксических лимфоцитов CD8, статистически значимых различий не показало. Это указывает на нарушение взаимодействия систем Т- и В –лимфоцитов, приводящее к ухудшению адаптивных и реактивных свойств большого сальника. 3.В большом сальнике, пораженном метастазами, уровень экспрессии факторов роста сосудов VEGF выше в 2,9 раз, уровень экспрессии CD 34 выше в 6,5 раз и уровень экспрессии D2-40 выше в 2.8 раз по сравнению с большим сальником при II стадии рака яичников. Выраженность ангиолимфогенных факторов роста сосудов усиливает кровоснабжение опухолевого очага и способствует более глубоким нарушениям адаптивных свойств большого сальника. 4.В большом сальнике при III a стадии рака яичников статистически значимо увеличивается уровень Е-кадгеринов в 3,75 раз, CD44 в 23,75 раз, CD61 в 3 раза по сравнению с образцами II стадии рака яичников, что свидетельствует о вовлеченности молекул адгезии клетки в формировании метастатических очагов колонии опухолевых клеток. 5.Изменения физических и ультраструктурных свойств большого сальника при III a стадии рака яичников, выявляемые при помощи СЭМ и АСМ, характеризуются уплотнением коллагеновых волокон, уменьшением диаметра серозных люков и повышением шероховатости поверхности мезотелия. 6.В ряде случаев млечные пятна при III a стадии рака яичников меняют свою типичную структуру и клеточный состав, превращаясь в метастатический очаг поражения, и способствуют дальнейшему нарушению реактивных и адаптивных свойств большого сальника.