Морфология орбитальной культи, сформированной с применением никелида титана и аутологичных мононуклеарных клеток крови

Во введении обоснована актуальность темы диссертации,
сформулированы цель и задачи исследования, научная новизна, теоретическая и
практическая значимость работы.
В первой главе проведён анализ отечественной и зарубежной научной
литературы по теме исследования. Представлены сведения о современных
принципах формирования опорно-двигательной культи глазного яблока.
Обобщён опыт использования различных имплантационных материалов при
формировании орбитальной культи. Проанализированы морфологические
аспекты формирования опорно-двигательной культи глаза из различных
имплантатов, механизмы их фиксации в орбитальной полости, осложнения при
орбитальной имплантации.
Вторая глава диссертации посвящена описанию материалов и методов
исследования.
Представленная научная работа включает в себя серию экспериментов
in vivo. Исследование выполнено на базе ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава
России (г. Томск) в лаборатории биологических моделей после утверждения
протокола экспериментального исследования локальным этическим комитетом
(регистрационный № 7794 от 27.05.2019). Работы с животными и выведение их
из эксперимента проводили в соответствии с законодательством Российской
Федерации, положениями с соблюдением требований «Европейской конвенции
по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и
других целей» (Страсбург, 1968) и Хельсинской декларации (2013).
Выполнена серия экспериментов на 54 половозрелых крысах-самцах
линии Wistar (54 глаза) массой тела 200–250 г, полученных из вивария ФГБОУ
ВО СибГМУ Минздрава России. Перед экспериментом всех животных
выдерживали на протяжении недельного карантинного срока в условиях вивария
на обычном пищевом рационе.
В зависимости от вида используемого в ходе операции имплантата
экспериментальные животные были разделены на три группы.
Животным 1-й группы (18 крыс, 18 глаз) после эвисцероэнуклеации одного
из глаз формировали опорно-двигательную культю глазного яблока путём
имплантации в склеральный мешок тканеинженерной конструкции из никелида
титана и суспензии аутологичных мононуклеарных клеток крови.
Во 2-й группе животным (18 крыс, 18 глаз) после эвисцероэнуклеации
одного из глаз формировали опорно-двигательную культю глазного яблока
путём помещения в склеральный мешок имплантата из никелида титана.
Животным 3-й группы (18 крыс, 18 глаз) после эвисцероэнуклеации одного
из глаз формировали опорно-двигательную культю глазного яблока
с помощью биоматериала из подкожно-жировой клетчатки подошвы человека.
Процедуру выделения мононуклеаров крови проводили на базе
Центральной научно-исследовательской лаборатории ФГБОУ ВО СибГМУ
Минздрава России.
Мононуклеарные клетки из крови экспериментального животного
выделяли методом фракционирования в градиенте плотности на разделяющем
растворе фиколл-верографин. Чистота полученных на градиенте мононуклеаров
составляла 96–98%. Жизнеспособность клеточного материала оценивали в тесте
с трипановым синим. Доля окрашенных (погибших) элементов составляла 1,5–
2,0%, что не превышало допустимое количество (3%).
Орбитальный имплантат из никелида титана изготавливался на базе НИИ
медицинских материалов и имплантатов с памятью формы при СФТИ им. акад.
В.Д. Кузнецова НИ ТГУ (г. Томск) из нити пористого никелида титана марки
ТН-10 толщиной 100 мкм (сертификат соответствия № РОСС RU. АЯ79Н14192
от 12.04.2011) [28] и имел округлую форму, диаметр 4–5 мм.
Имплантат из биоматериала изготавливался в ФГУ ВЦГиПХ (г. Уфа) из
подкожно-жировой клетчатки подошвы человека и имел округлую форму
диаметром 5 мм. Имплантат легко моделируется, обладает слабой
иммуногенностью и устойчив к инфекциям.
Общая продолжительность эксперимента составила 21 сутки. Осмотр
проводили на 1, 3, 7, 14, 21-й день после операции. В ходе эксперимента
выполняли наружный осмотр, биомикроскопию оперированных глаз с оценкой
состояния конъюнктивы век и опорно-двигательной культи глазного яблока,
краёв операционной раны и швов, а также наличия и характера отделяемого
в конъюнктивальной полости, фоторегистрацию.
Забор материала производили на 7-, 14-, 21-е сутки. Из каждой группы
в условиях глубокого наркоза выводили по 6 животных с последующей
энуклеацией оперированного глаза. Полученный в ходе экспериментов материал
фиксировали для световой и электронной микроскопии.
Гистологические исследования проводили на кафедре гистологии,
эмбриологии и цитологии ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России.
Для подготовки к световой микроскопии энуклеированные глазные яблоки
животных фиксировали в жидкости Карнуа, затем их препарировали,
дегидратировали, заливали в парафиновую среду Histomix (БиоВитрум, Россия).
На санном микротоме (Микром, Россия) изготавливали парафиновые срезы
толщиной 5–6 мкм, которые затем монтировали на предметные стекла и
окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по методу Ван Гизона.
Микропрепараты просматривали в проходящем свете на микроскопе Axioskop 40
(Carl Zeiss, Германия) на малом (50-, 100- и 200-кратном) и большом (400-
кратном) увеличениях.
Изучение ультраструктуры проводили методом трансмиссионной
электронной микроскопии (Лакин Г. Ф., 1990). Ультратонкие срезы толщиной
60–100 нм готовили на ультратоме Ultrotome III (“LKB”, Швеция) по методике
Б. Уикли (1975). Просмотр и фотографирование препаратов осуществляли с
помощью электронного микроскопа JEM-100 CXII (JEOL, Япония) с апертурной
диафрагмой 25–30 мкм при ускоряющем напряжении 80 кВ.
Для количественной оценки изменений проводили морфометрическое
исследование. Подсчёт различных структурных компонентов и клеточной
плотности выполняли при помощи светового микроскопа «ЛОМО Биолам АУ-12»
(ок. ×7, об. ×40, ×90, собственное увеличение микроскопа ×1,5), окулярную
сетку Автандилова на 50 точек, окулярную вставку с известной площадью.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с
применением пакета статистических программ IBM SPSS Statistics 20.
Нормальность распределения показателей проверяли с помощью теста
Колмогорова–Смирнова. Анализпеременных,имеющихнормальное
распределение, выполняли с помощью t-критерия Стьюдента. Результаты
представлены в виде M ± m, где M – среднее арифметическое значение, m –
стандартная ошибка среднего. При несоответствии распределения данных
нормальному закону распределения использовали непараметрический U-
критерий Манна-Уитни. В этом случае результаты представляли в виде
Me (Q1; Q3), где Me – медиана, Q1 и Q3 – квартили. Различия считали
статистически значимыми при уровне p < 0,05. В третьей главе диссертации представлены результаты собственных исследований. В послеоперационном периоде, по данным наружного осмотра, орбитальная культя у всех экспериментальных животных имела округлую форму, поверхность её была гладкой. Веки смыкались полностью. В ходе эксперимента (21 сутки) не выявлено ни одного случая обнажения или отторжения имплантата у животных всех трёх групп. В ходе гистологических исследований были получены следующие данные. На 7-е сутки после операции У животных 1-й группы в полости опорно-двигательной культи глазного яблока обнаруживались обширные скопления мононуклеарных клеток, небольшое количество лимфоцитов и единичные полиморфно-ядерные лейкоциты. Вокруг имплантата из никелида титана – очаговые скопления незрелых фибробластов, рыхло расположенные тонкие, умеренно отечные коллагеновые волокна, между ними – новообразованные капилляры с широким просветом. По данным электронной микроскопии преобладали макрофаги и фибробласты с хорошо развитой эндоплазматической сетью (ЭПС). В ядрах преобладал эухроматин. В межклеточном веществе визуализировались пучки коллагеновых фибрилл с продольной исчерченностью. У крыс 2-й группы в полости опорно-двигательной культи обнаруживались умеренно выраженный отёк, мелкие кровоизлияния, а также диффузная равномерная лимфолейкоцитарная инфильтрация и небольшое количество фибробластов. Вокруг имплантата выявлялись отёчные рыхлые коллагеновые волокна и единичные новообразованные сосуды. По результатам электронной микроскопии среди клеток встречались макрофаги со светлой цитоплазмой, небольшим количеством мембранных органелл. В межклеточном веществе обнаруживалось небольшое количество хаотично расположенных тонких коллагеновых фибрилл. Капилляры были заполнены эритроцитами. У животных 3-й группы полость опорно-двигательной культи была заполнена жировой тканью, между дольками которой обнаруживались единичные мононуклеарные клетки, небольшое количество полиморфно- ядерных лейкоцитов, тонкие коллагеновые волокна и единичные новообразованные сосуды. По данным электронной микроскопии среди клеток преобладали адипоциты с большим содержанием крупных липидных капель, между которыми встречались макрофаги с крупным ядром, содержащим гетерохроматин. В межклеточном веществе – хаотично направленные пучки коллагеновых фибрилл, единичные микрососуды с эритроцитами в просвете. На 14-е сутки после операции У крыс 1-й группы в полости орбитальной культи наблюдалось обширное разрастание волокнистой соединительной ткани. При этом коллагеновые волокна располагались более упорядоченно, чем на 7-е сутки, и между ними выявлялись скопления мононуклеаров крови, большинство из которых были подвержены лизису. Вокруг имплантата – новообразованные сосуды, встречались веретенообразной и звёздчатой формы зрелые фибробласты. По данным электронной микроскопии, среди клеток визуализировались макрофаги и фибробласты, в ядре преобладал эухроматин, в цитоплазме – множественные расширенные цистерны гранулярной ЭПС, митохондрии с нормальной структурой. В межклеточном веществе обнаруживались более упорядоченные, чем на 7-е сутки, пучки коллагеновых фибрилл, ориентированные продольно. У животных 2-й группы в полости орбитальной культи наблюдалось разрастание рыхлой волокнистой соединительной ткани, характеризовавшейся значительным отёком и умеренно выраженной лимфоцитарно-макрофагальной инфильтрацией. Тонкие коллагеновые волокна располагались хаотично, между ними обнаруживались тонкостенные капилляры, единичные артериолы и венулы. По результатам электронной микроскопии, среди клеток преобладали, как и на 7-е сутки, макрофаги и фибробласты. Цитоплазма фибробластов имела хорошо развитую гранулярную ЭПС, большое число рибосом. В ядрах преобладал эухроматин. В межклеточном веществе обнаруживались слабо упорядоченные коллагеновые фибриллы. Между ними встречались капилляры. У крыс 3-й группы в полости орбитальной культи между жировыми долькамиимплантатавстречаласьнезначительнаялимфоцитарно- макрофагальная инфильтрация и разрастание тонких коллагеновых волокон. Вокруг имплантата обнаруживались единичные новообразованные сосуды. По данным электронной микроскопии, среди клеток преобладали адипоциты, между которыми встречались фибробласты и неупорядоченные пучки коллагеновых фибрилл. Также между адипоцитами имели место фрагменты клеток с выраженными деструктивными изменениями. Митохондрии с признаками деструкции вплоть до фрагментации наружной митохондриальной мембраны. Эндотелиоциты микрососудов встречались с неправильной формой ядра. На 21-е сутки после операции У животных 1-й группы в полости опорно-двигательной культи глаза обнаруживалась зрелая соединительная ткань. Толстые пучки коллагеновых волокон располагались компактно и упорядоченно, среди них отмечались множественные новообразованные артериолы и венулы. Согласно результатам электронной микроскопии, среди клеток преобладали фибробласты с хорошо развитой гранулярной ЭПС. Эндотелиоциты новообразованных микрососудов встречались с митохондриями и множественными микровезикулами. У крыс 2-й группы в полости опорно-двигательной культи глаза обнаруживалась рыхлая соединительная ткань с тонкими неупорядоченно расположенными вокруг имплантата коллагеновыми волокнами, между которыми выявлялась диффузная мононуклеарная инфильтрация и небольшое число новообразованных сосудов. По результатам электронной микроскопии, в клеточном составе преобладали макрофагии фибробласты, в цитоплазме которых обнаруживалось множество мелких везикул. Эндотелиоциты новообразованных сосудов имели хорошо развитые органеллы и типичное строение ядра. У животных 3-й группы в полости опорно-двигательной культи глазного яблока обнаруживалась жировая ткань, между дольками которой выявлялись незначительная мононуклеарная инфильтрация и рыхло расположенные коллагеновые волокна. Вокруг имплантата располагались единичные новообразованные сосуды. Вместе с тем, на некоторых участках культи вблизи имплантата встречались эпителиоидные клетки, а также группы гигантских многоядерных клеток Пирогова–Лангханса, что указывает на развитие гранулематозного воспаления. По результатам электронной микроскопии, среди адипоцитов обнаруживались фрагменты клеток с множественными деструктивными изменениями. В цитоплазме клеток – редукция мембранных и немембранных органелл, выраженная деструкция мембран митохондрий, множественные аутофагосомы и лизосомы. В ядрах некоторых соединительнотканных клеток – гиперконденсация хроматина, кариорексис. Таким образом, результаты световой и электронной микроскопии показали, что у животных 1-й группы в опорно-двигательной культе глаза к 21-м суткам после операции сформировалась зрелая плотная неоформленная соединительная ткань, в то время как у крыс 2-й группы обнаруживалась рыхлая соединительная ткань. В 3-й группе животных с 14-х суток в опорно-двигательной культе глаза определялись признаки биодеструкции имплантата (дистрофические и некротические изменения биоматериала). Согласно результатам морфометрического анализа, в клеточном составе опорно-двигательной культи глазного яблока у крыс всех трёх групп на протяжении эксперимента (21 сутки) преобладали мононуклеарные клетки (Таблица 1). При этом у животных 1-й группы численность клеток данной популяции в ходе эксперимента статистически значимо превышала таковую у животных остальных групп. Так, на 7-е сутки после операции число мононуклеарных клеток в опорно-двигательной культе глаза у крыс 1-й группы (n = 6) в 3,3 раза (р = 0,034) превышало значения данного показателя у животных 2-й группы (n = 6) и у крыс 3-й группы (n=6) (р = 0,0002) (Таблица 1). На 14-е сутки численность клеток данной популяции в опорно-двигательной культе глазного яблока у крыс 1-й группы превышала таковую у крыс 2-й группы в 1,9 раза (р = 0,01), на 21-е сутки – в 2,2 раза (р = 0,02). Различия данного показателя с таковым у животных 3-й группы также были статистически значимыми (р = 0,0001) (Таблица 1). Численная плотность лимфоцитов на протяжении всего эксперимента преобладала у животных 1-й группы. Так, на 7-е сутки число лимфоцитов у крыс 1-й группы в 3,1 раза превышало значение этого показателя у крыс 2-й группы (р = 0,028). На 14-е и 21-е сутки численность лимфоцитов в 1,9– 2,0 раза превышала таковую у животных 2-й группы (Таблица 1). При сравнении количества полиморфно-ядерных лейкоцитов у животных 1-й и 2-й групп было обнаружено, что на протяжении всего эксперимента данные показатели были примерно одинаковыми в связи с умеренной воспалительной реакцией на 7-е сутки и стиханием воспалительного процесса к 21-м суткам после операции (Таблица 1). В связи с тем, что в 3-й группе животных имплантат был представлен в основном жировой тканью, клеточная плотность на протяжении всего эксперимента была низкой, поэтому разница показателей лимфоцитов и полиморфно-ядерных лейкоцитов в1-й и 2-й группе по сравнению с показателями 3-й группы была очень высокой (р = 0,0002). Численная плотность фибробластов у животных всех трёх экспериментальных групп на 7-е сутки после операции была низкой (Таблица 1). На 14-е сутки у крыс 1-й группы выявлено статистически значимое увеличение численности фибробластов в 22 раза по сравнению с наблюдаемым у животных 2-й группы (р = 0,0001), что свидетельствует о сдвиге воспалительной реакции в фазу регенерации. На 21-е сутки у животных 1-й группы наблюдалось уменьшение численной плотности фибробластов (Таблица 1), что, в сочетании с другими гистологическими признаками, свидетельствует о созревании соединительной ткани. У животных 2-й группы повышение численности фибробластов отмечено к 21-м суткам (Таблица 1), что указывает на начало созревания соединительной ткани. У животных 3-й группы статистически значимого изменения величины данного показателя не выявлено, при этом отмеченонезначительноеувеличениечисленностифибробластов к 21-м суткам, что указывает на формирование соединительной ткани между жировыми дольками в биоматериале. Таблица 1 – Содержание клеток в 1 мм2 среза опорно-двигательной культи глазного яблока у экспериментальных животных в зависимости от вида имплантата, Me (Q1; Q3) ГруппаСрок наблюдения Вид клеток животных7-е сут14-е сут21-е сут 1-я3249,885869,762657,04 (n = 6)(492,84; 9856,80)(2957,04; 9363,96) (1971,36; 3942,72) р1 = 0,034р1 = 0,01р1 = 0,02 Моноциты-р2 = 0,0002р2 = 0,0001р2 = 0,0002 макрофаги2-я958,682964,201189,26 (n = 6)(492,84; 1971,36)(492,84: 5698,80) (492,84; 2957,04) 3-я65,2855,3460,62 (n = 6)(15,46; 156,54)(10,24; 143,26) (10,24; 123,46) 1-я30,86492,84410,26 (n = 6)(0; 62,44)(246,42; 1478,52) (246,42; 1256,48) р1 = 0,034;р1 = 0,0001;р2 = 0,0002 р2 = 0,028р2 = 0,0002 Фибробласты 2-я10,2412,46492,84 (n = 6)(0; 62,44)(0; 123,26)(62,44; 958,68) 3-я10,2418,4856,74 (n = 6)(0; 30,86)(0; 62,44)(0; 246,42) 1-я3196,364435,562210,84 (n = 6)(492,84; 4928,40)(492,84; 5914,28) (246,42; 3449,88) р1 = 0,028;р2 = 0,0002р2 = 0,0002 р2 = 0,0002 Лимфоциты 2-я1031,262334,561105,86 (n = 6)(246,42; 2435,56)(492,84; 3942,72) (246,42; 2957,04) 3-я56,2452,4848,56 (n = 6)(15,46; 143,26)(10,24; 123,46) (10,24; 111,36) 1-я246,42123,2660,62 (n = 6)(0; 1478,52)(0; 958,68)(0; 492,84) Полиморфно-р2 = 0,0001р2 = 0,0002р2 = 0,0004 ядерные2-я246,42123,2662,44 лейкоциты(n = 6)(0; 1971,36)(0; 958,68)(0; 492,84) 3-я62,4462,4430,86 (n = 6)(0; 246,42)(0; 123,26)(0; 62,44) Примечание. р1 – Уровень статистической значимости различий по сравнению с показателями во 2-й группе; р2 – уровень статистической значимости различий по сравнению с показателями в 3-й группе; n – число животных в группе. Удельный объём соединительной ткани в опорно-двигательной культе глазного яблока у животных 1-й группы, начиная с 7-х суток после операции и на протяжении всего эксперимента, также статистически значимо превышал таковой у животных остальных групп (Таблица 2). Так, у животных 1-й группы на 7-е сутки после операции значение данного показателя было в 7,9 раза выше, чем у крыс 2-й группы (р = 0,048), и в 15,8 раза выше, чем у животных 3-й группы (р = 0,039) (Таблица 2). На 14-е сутки объём соединительной ткани в опорно-двигательной культе глаза у крыс 1-й группы достигал наибольшего значения по сравнению с таковым у животных других групп (Таблица 2). На 21- е сутки у животных 1-й группы наблюдалось статистически значимое – в 1,2 раза – уменьшение объёма стромы опорно-двигательной культи глазного яблока по сравнению с показателем на 14-е сутки (р = 0,0019) (Таблица 2), что обусловлено созреванием соединительной ткани в культе (упорядоченно расположенные толстые пучки коллагеновых волокон, множественные новообразованные артериолы и венулы). У животных 2-й группы объём стромы опорно-двигательной культи глаза на 21-е сутки после операции был в 1,19 раза выше, чем у крыс 1-й группы (р = 0,0019) и в 17,9 раза выше по сравнению с показателями 3-й группы (р = 0,0003) (Таблица 2). Необходимо отметить, что у всех животных 2-й группы на данном сроке наблюдения обнаруживались признаки незрелости соединительной ткани (неупорядоченные, рыхло расположенные тонкие коллагеновые волокна, диффузная клеточная инфильтрация, небольшое число новообразованных сосудов). Таблица 2 – Удельный объём стромы и новообразованных сосудов в 1 мм2 среза опорно-двигательной культи глазного яблока у экспериментальных животных в зависимости от вида имплантата, M ± m Удельный объём стромы, %Удельный объём сосудов, % СрокГруппа экспериментальных животных наблюдения1-я2-я3-я1-я2-я3-я группагруппагруппагруппагруппагруппа (n = 6)(n = 6)(n = 6)(n = 6)(n = 6)(n = 6) 7-е0,16 ±0,02 ±0,01 ±0,040 ±0,020 ±0,010 ± 0,100,010,0050,0270,0140,006 14-е95,00 ± 2,10 0,30 ± 0,14 0,20 ± 0,115,00 ± 2,10 0,04 ± 0,03 0,02 ± 0,01 р1 = 0,0002р1 = 0,04 р2 = 0,0001р2 = 0,03 21-е79,1 ± 3,4 94,7 ± 1,9 5,3 ± 1,920,9 ± 3,15,3 ± 1,92,2 ± 1,2 р2 = 0,005р1 = 0,001 р2 = 0,003 Примечание. р1 – Уровень значимости различий по сравнению со 2-й группой; р2 – уровень значимости различий по сравнению с 3-й группой; n – число животных в группе У животных 3-й группы статистически значимого изменения величины данного показателя не выявлено, при этом имело место незначительное увеличение объёма стромы к 21-м суткам, что указывает на формирование соединительной ткани между жировыми дольками в биоматериале (см. Таблицу 2). Численная плотность новообразованных сосудов у крыс 1-й группы, начиная с 14-х суток после операции и до завершения эксперимента (21-е сутки), статистически значимо превышала таковую у крыс остальных групп (см. Таблицу 2). Так, на 14-е сутки в 1-й группе животных обнаруживались новообразованные сосуды с признаками дифференцировки в артериолы и венулы, у животных 2-й группы – тонкостенные капилляры. На 21-е сутки у крыс 1-й группы численная плотность новообразованных сосудов в 4,0 раза была выше, чем у животных 2-й группы (р = 0,001), и в 9,8 раза выше, чем у животных 3-й группы (р = 0,0003) (см. Таблицу 2). При этом у животных 1-й группы в опорно-двигательной культе глаза обнаруживались множественные новообразованные артериолы и венулы, что также указывает на созревание соединительной ткани. Таким образом, результаты проведённогоэкспериментального исследования показали, что дополнительное введение аутологичных мононуклеарных клеток крови в структуру имплантата из никелида титана после эвисцероэнуклеации способствует ускоренному созреванию соединительной ткани в опорно-двигательной культе глаза, что обеспечивает прочную фиксацию имплантата в склеральном мешке и снижает риск развития послеоперационных осложнений (обнажение, отторжение имплантата). В главе «Обсуждение» был выполнен анализ полученных результатов с привлечением данных литературы. Полученные результаты экспериментального исследования у животных 1-й группы с имплантатом из тканеинженерной конструкции объясняются как непосредственным дополнительным введением аутологичных мононуклеарных клеток крови в структуру пористого имплантата из никелида титана, так и дополнительноймиграциейклетокданнойпопуляциивследствие индуцирующего (за счёт секреции биологически активных веществ) влияния экзогенно введенных мононуклеаров. Мы предполагаем, что при имплантации никелида титана в орбитальную полость крыс и дополнительном введении аутологичных мононуклеарных клеток крови в структуру имплантата в культе глазного яблока ускоряются смена клеточных фаз воспаления и его переход в фазу регенерации. Мононуклеары крови, секретируя провоспалительные цитокины – фактор некроза опухолей (TNFα), IFNγ– активируют М1 макрофаги, которые, в свою очередь, благодаря секреции IL-1, IL-6, IL-8, TNFα, IFNγ, тромбоцитарного фактора роста (PDGF) (Бикбов М. М. и др., 2008), приводят к активации фибробластов в очаге воспаления (Yang D. et al., 2014) (Рисунок 1). Попадая в поток тканевой жидкости и фиксируясь цитоскелетом к элементам внеклеточного матрикса, фибробласты начинают процесс фиброгенеза, включающий синтез и выделение в межклеточную среду белков – коллагена и эластина, а также гликозоаминогликанов (Nakayama T. et al., 2019) (Рисунок 1). Мононуклеарные клетки крови TNFα, IFNγIL-4, IL-10, IL-13 М1 макрофагМ2 макрофаг (провоспалительный)(противоспалительный) ПровоспалительныеПротивоспалительные цитокины:цитокины: IL-1, IL-6, IL-8, TNFα,IL-10, TGFβ, IFNγ, PDGFVEGF АктивацияАктивация фибробластовнеоваскуляризации Фиброгенез (коллагенообразование,Формирование созреваниесоединительной фибробластов)ткани Рисунок 1 – Участие мононуклеарных клеток крови в формировании соединительной ткани (с учётом данных R. Yoshida и M. M. Murray (2013); A. L. Mescher (2017)) L-8 является независимым стимулятором фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), способствует пролиферации, миграции эндотелиальных клеток (Rouwkema J., Khademhosseini A., 2016). PDGF является мощным стимулом для восстановления тканей, активирует пролиферацию фибробластов, усиливает выработку коллагена (Шамитова Е. Н. и др., 2019). Крометого,мононуклеарныеклеткисекретируют противовоспалительные цитокины, такие как IL-4, IL-10, IL-13, трансформирующий фактор роста β (TGF-β) и фактор роста эндотелия сосудов VEGF, которые играют решающую роль в неоваскулогенезе, регенерации тканей, а также в пролиферации и дифференцировке клеток, синтезе макромолекул межклеточного вещества (Mescher A. L., 2017) (см. Рисунок 1). VEGF– основной регулятор ангиогенеза - увеличивает проницаемость сосудистой стенки, избирательно активирует эндотелиальные клетки, контролирует их миграцию (Шамитова Е. Н. и др., 2019). TGF-β стимулирует синтез белков внеклеточного матрикса, способствуют стабилизации новообразованныхсосудов(Rouwkema J.,Khademhosseini A., 2016). Восстановление кровотока в поврежденных тканях обеспечивает их кислородом и питательными веществами, необходимыми для поддержки роста и функции репаративных клеток (Sadiq S. A. et al., 2008). В нашей работе мы использовали имплантат из пористого никелида титана, который обладает высокой биосовместимостью, способностью стимулировать процессы регенерации поврежденной ткани, обеспечивает опорную и структурообразующую функцию, вызывает минимальные изменения в окружающих тканях. В ходе экспериментов микропористая поверхность никелида титана обеспечивала клеточную адгезию и кооперацию, активацию неоваскуляризации и прорастание сосудов между нитями имплантата (Рисунок 2). Анализируя всё вышеизложенное, можно сделать вывод о том, что имплантация в эксперименте in vivo тканеинженерной конструкции из никелида титана и суспензии аутологичных мононуклеарных клеток крови обеспечивает эффективное формирование опорно-двигательной культи глазного яблока. Никелид титана надёжно фиксируется в орбитальной полости вследствие прорастания соединительной ткани в местах переплетения нитей имплантата. За счёт своих упруго-эластичных свойств и эффекта памяти формы имплантат из никелида титана длительно и стабильно поддерживает форму опорно- двигательной культи глазного яблока, хорошо переносится тканями глаза, отсутствуют смещение, обнажение и отторжение имплантата. Также он служит матриксом для аутологичных мононуклеарных клеток крови, которые, фиксируясь к имплантату, запускают процессы пролиферации и дифференцировки клеток, что способствует созреванию соединительной ткани. В результатате максимально снижается риск обнажения, миграции или отторжения имплантата. Проведённоенамиисследованиеподтверждаетвозможность использования тканеинженерной конструкции из никелида титана для формирования опорно-двигательной культи глазного яблока, а аутологичных мононуклеарных клеток крови – для ускоренного созревания соединительной ткани и обеспечения прочной фиксации имплантата в опорно-двигательной культе глазного яблока. Клеточная Клеточнаякооперация миграцияи адгезия Имплатация никелида титана в орбитальную полость АктивацияСекреция цитокинов неоваскуляризации ПрорастаниеВоспалительно- сосудов междурепаративная нитямиреакция имплантата Формирование соединительной ткани Рисунок 2 – Формирование соединительной ткани при имплантации никелида титана (с учётом данных А. Н. Стеблюк, Г. М. Могильной (2012), J. Rouwkema, A. Khademhosseini (2016)) ВЫВОДЫ 1. Течение воспалительно-репаративной реакции при формировании опорно-двигательной культи глаза в эксперименте in vivo с применением тканеинженерной конструкции из никелида титана и суспензии аутологичных мононуклеарных клеток крови характеризуется быстрым переходом воспаления в стадию регенерации с ускоренной дифференцировкой фибробластов и эндотелиоцитов. 2. Формирование опорно-двигательной культи глаза в эксперименте in vivo с помощью тканеинженерной конструкции из никелида титана и суспензии аутологичных мононуклеарных клеток крови характеризуется более интенсивным коллагенообразованием и преобладанием стромального компонента культи, а также индуцирует ангиогенез и более выраженное увеличение численной плотности сосудов культи по сравнению с таковыми при использовании имплантата из никелида титана и биоматериала из подкожно- жировой клетчатки. 3. Ускоренное (с 14-х суток) созревание соединительной ткани и интенсивный рост сосудов при формировании опорно-двигательной культи глазного яблока с помощью тканеинженерной конструкции из никелида титана и суспензии аутологичных мононуклеарных клеток крови обеспечивают прочную фиксацию имплантата и стабильную форму культи глаза в эксперименте in vivo. 4. Применение тканеинженерной конструкции из никелида титана и суспензии аутологичных мононуклеарных клеток крови в качестве имплантата при формировании опорно-двигательной культи глазного яблока в эксперименте in vivo характеризуется отсутствием интра- и послеоперационных осложнений в виде обнажения и отторжения имплантата, присоединения вторичной инфекции.